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方法文章

界定活检来源肾细胞的代谢表型

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DOI：

10.3791/65457

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2025年6月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

本文内容

摘要

本方案描述了一种对活检来源的肾细胞进行代谢谱分析的独特方法。该方法已在健康的成年雄性猪中优化，有望增强对肾移植器官活力的实时评估。该方法还可能有助于揭示多种基于代谢的肾脏疾病的全新生物学机制。

摘要

肾移植是终末期肾病的最佳治疗方法；然而，移植肾常出现过早丢失的情况，移植后10年内的移植物丢失率高达50%。导致移植物过早丢失的主要原因之一是移植过程中移植物所遭受的损伤，即缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）。 移植后第一周内需要透析定义为延迟移植物功能（delayed graft function, DGF），这是严重IRI的表现，具有急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）的功能和组织学特征。尽管驱动AKI的机制尚不明确，但越来越多的证据表明，移植物内代谢功能的改变介导了AKI的发生，可能是导致DGF的原因。因此，解析并监测IRI背后的代谢机制将提升 我们对AKI的诊断和预防能力。本文介绍了一种独特的方法，用于评估经穿刺活检获得的肾细胞悬液中的线粒体呼吸（通过耗氧率）、糖酵解（细胞外酸化率）以及细胞内ATP水平。该方法已在健康的成年雄性猪中优化，并在猪自体移植模型中得到验证。所提出的方法有望增强临床中对肾移植物活力的实时评估。对患者来源活检组织进行代谢谱分析，还可能揭示其他以代谢为基础的肾脏疾病中的新生物学机制。

引言

肾移植是终末期肾病的最佳治疗方法1,2,3,4；然而，移植肾常出现过早丢失，移植后10年内的移植物丢失率高达50%5。受影响的患者发病率和死亡率升高，并对医疗系统造成重大经济负担6。导致移植物过早丢失的主要原因是移植时移植物所遭受的损伤，即缺血-再灌注损伤（IRI）。IRI是一种不可避免的损伤，由血流减少继而再灌注所引起7。缺血的特征是组织中琥珀酸积累，这会驱动线粒体呼吸链中的逆向电子传递，导致再灌注早期产生超氧阴离子并引发后续损伤8。移植器官中的IRI会增加原发性无功能、延迟移植物功能（DGF）、排斥反应以及移植物预后不良的风险8,9。DGF被定义为移植后第一周内需要透析9，是严重IRI的一种表现形式10。从组织学上看，与IRI相关的DGF表现为急性肾小管坏死（ATN）以及微血管系统的损伤。功能上则表现为肾小球滤过率（GFR）和尿量下降，这些是同种异体移植物中急性肾损伤（AKI）的特征11。尽管这一问题至关重要，目前尚无针对移植后与缺血-再灌注相关的AKI的治疗方法。治疗手段的缺乏源于对疾病机制理解不充分，以及缺乏可在损伤可能逆转的关键时间点识别出移植物功能障碍高风险患者的生物标志物12。

越来越多的证据表明，移植器官中能量代谢的改变介导了急性肾损伤，并可能是延迟移植物功能（DGF）的基础。13,14,15. 肾脏细胞产生能量 通过 两种主要机制：线粒体呼吸和糖酵解16在缺血-再灌注损伤（IRI）中，再灌注会导致线粒体功能障碍17因此，糖酵解成为主要的能量来源13,18,19,20缺血再灌注损伤中的代谢改变促进肾小管和微血管内皮细胞死亡，导致急性肾损伤21,22,23,24在之前的研究中，ATN 与糖酵解酶表达增加以及线粒体蛋白水平的改变相关25，与移植物中的IRI一致13,18此外，在猪肾自体移植模型中，缺血后经低温保存导致肾脏线粒体蛋白水平降低，并增加乳酸排泄26这些研究结果共同证实了监测肾移植器官代谢表型的临床重要性，甚至在移植前就应进行，因为移植器官的基础代谢特征可预测移植器官功能障碍。27.

已开发出用于预测移植物短期排斥反应和丢失风险的临床预测模型28,29。然而，这些模型缺乏精确性，且未考虑移植物的分子特征30,31,32。近期研究致力于通过识别与不良移植物结局（如移植物功能障碍和排斥反应）相关的组织水平分子模式，以弥补这一未被满足的需求13,14,15,25,33,34。这些研究依赖于基因33,34,35、蛋白质25,26和代谢物水平13,14的稳态分子测量，导致对移植物代谢表型的认识仍不完整。这一知识空白部分源于无法在特定时间点测量肾脏来源样本的代谢功能和能量状态。因此，有必要建立一种标准化方案，用于确定活检来源肾细胞的代谢表型，并有望将其应用于患者样本的研究。本文介绍了一种独特的工作流程，用于评估活检来源肾细胞悬液中的线粒体呼吸（通过耗氧速率测定）、糖酵解（通过细胞外酸化速率测定）以及细胞内ATP水平。该方法使用健康成年雄性猪的肾活检组织芯进行优化。为便于未来的临床应用，活检组织芯采用18 G穿刺针获取，与肾移植物取样中的标准临床操作一致36,37。最后，该方案在区分不同实验条件方面的实用性已在猪自体移植模型中得到验证。

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方案

本方案已获得多伦多综合研究所动物护理委员会批准（动物使用方案编号：3652）。动物的饲养和护理均按照加拿大安大略省国家医学研究协会及美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理指南》执行。本研究使用了五只三个月大的雄性约克夏猪，每只体重约30 kg。本方法的实验流程分为以下步骤：（1）将单个肾脏活检组织芯解离为单细胞悬液；（2）对活检来源的肾细胞进行代谢谱分析；（3）测定活检来源肾细胞中的ATP含量。所有用于代谢功能或ATP含量检测的活检样本均在取材后3小时内于生物安全柜中完成解离。该方法的工作流程见图1。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 将单个肾脏活检组织芯解离为细胞悬液

  1. 使用同轴针（即外层导向针和内层活检针）枪系统，从肾皮质采集三根活检组织芯38。在临床转化应用中，建议使用18 G活检针枪39。
    注意：进行肾皮质活检时，应保持活检针枪角度一致（约45 °C），穿刺深度一致（约20 mm）。
  2. 将每根活检组织芯小心放入含有2 mL RPMI 1640培养基的15 mL离心管中，并置于冰上。
    1. 在置于冰上的6 cm培养皿中，用手术刀将活检组织切成小块（≤2 mm长）。使用超细尖弯头镊子，将每份活检组织的碎片分别转移至含有1 mL消化液的1.5 mL离心管中。
      注意：消化液成分为RPMI 1640培养基，其中包含0.1 mg/mL DNase I、10 mg/mL胶原酶和2990单位/mL来自Bacillus polymyxa的中性蛋白酶。使用该成分消化人肾活检组织已被证实可最大程度维持细胞活力，并保留稀有和脆弱细胞群体的代表性40。
  3. 在37 °C（加热块）条件下孵育30分钟进行消化，期间间歇性振荡（建议每5分钟涡旋混匀一次）。
  4. 消化完成后，将细胞悬液通过35 µm带盖细胞筛滤管过滤。
  5. 用等体积（1:1）的100%胎牛血清（FBS）冲洗细胞筛。
  6. 将三份活检来源的肾细胞悬液合并至一个15 mL离心管中。
  7. 离心沉淀细胞（400 × g，5分钟，4 °C），然后重悬于1 mL含10% FBS的RPMI 1640培养基中。此细胞悬液通常可获得0.8–1.2 × 106个细胞。

2. 肾活检来源细胞的代谢谱分析

注意：代谢谱分析步骤包括使用代谢功能分析仪检测糖酵解（ECAR）和氧消耗率（OCR），以及利用商业试剂盒测定细胞内ATP水平。

  1. 代谢功能分析仪试剂盒辅助板的水合与校准
    1. 在取样前一日，向代谢功能分析仪的试剂盒辅助板的每个孔中加入 200 µL 去离子水（ddH2O）。
    2. 将试剂盒辅助板置于无 CO2 的培养箱中，37 °C 过夜孵育。
    3. 在取样当天，使用连接真空系统的巴斯德吸管吸除 ddH2O，并向试剂盒辅助板的每个孔中加入 200 µL 校准液（pH = 7.4）。
    4. 将试剂盒辅助板置于无 CO2 的培养箱中，37 °C 过夜孵育。
  2. 细胞铺板及用于代谢功能检测的检测培养基与应激化合物的制备
    1. 在 96 孔代谢功能检测板的每个孔中加入 100 µL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基。
    2. 取少量细胞悬液（例如 10 µL，来自步骤 1）置于另一离心管中，使用台盼蓝排斥法染色检测细胞活力。
    3. 使用细胞计数板测定原始悬液中活细胞（台盼蓝阴性）的浓度41。
    4. 以每孔 1.0 × 105 个活细胞的密度，将细胞接种至代谢功能检测板的各个实验孔中。该细胞数量经优化后确定（见代表性结果部分）。
      注意：请勿在代谢功能检测板的四个角孔中接种细胞，这些孔用作空白对照。
    5. 将代谢功能检测板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中过夜孵育（约 16 小时），使细胞贴壁。
    6. 次日，在显微镜下确认细胞融合度至少达到 70%–80%（健康的单层细胞对准确测定代谢功能参数至关重要）。
    7. 在 37 °C 下解冻一份无酚红基础培养基（40–50 mL），时间不少于 15 分钟。
    8. 在 33.915 mL 预先解冻的基础培养基中加入 2 mM 谷氨酰胺（350 µL）、1 mM 丙酮酸钠（350 µL）和 5.55 mM 葡萄糖（385 µL），配制 35 mL 检测培养基。
    9. 使用单通道或多通道移液器，轻柔地吸除代谢功能检测板各实验孔中的 RPMI 培养基，随后每孔加入 100 µL 基础培养基清洗细胞。
    10. 轻柔吸除基础培养基，向每个孔（包括未接种细胞的孔）加入 150 µL 检测培养基。
      注意：若某些孔未添加检测培养基，可能影响板内湿度环境，导致代谢功能测量结果不一致（补充图 1）。
    11. 将代谢功能检测板置于无 CO2 的培养箱中，37 °C 孵育约 1 小时（适应阶段）。同时将已用校准液孵育的试剂盒辅助板移回生物安全柜中。
    12. 在细胞适应期间，用检测培养基配制以下四种应激化合物溶液：7 µM 寡霉素（7×，终浓度为 1 µM 寡霉素）；2.4 µM 羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）（8×，终浓度为 0.3 µM FCCP）；450 mM 2-脱氧葡萄糖（2-DG）（9×，终浓度为 50 mM 2-DG）；10 µM 鱼藤酮与 10 µM 抗霉素 A（Rot + AA）（10×，终浓度为 1 µM Rot + 1 µM AA）。
      注意：寡霉素通过抑制 ATP 合酶活性中断电子传递链（ETC），从而降低耗氧率（OCR）及 ATP 合酶驱动的质子向线粒体内的流入，使糖酵解成为主要的 ATP 生成途径42。FCCP 是一种带负电荷的氰化物类药物，作为氧化磷酸化的解偶联剂，可吸引质子（正电荷），诱导质子持续进入线粒体，使电子传递链独立于 ATP 合酶活性消耗氧气43。2-DG 是葡萄糖的合成结构类似物，其 2-羟基被氢取代，可作为糖酵解的竞争性抑制剂44。鱼藤酮（Rot）和抗霉素 A（AA）分别为电子传递链复合物 I 和 III 的抑制剂45。各药物在代谢功能检测不同阶段注入后的效应详见 补充图 2。
    13. 将每种药物各 25 µL 加入试剂盒辅助板每个孔顶部对应的加样口，包括未接种细胞的孔。加样顺序如下：7× 寡霉素（A 口）、8× FCCP（B 口）、9× 2-DG（C 口）、10× Rot + AA（D 口）。
    14. 将试剂盒辅助板置于无 CO2 的培养箱中孵育，直至进行代谢功能检测时取出使用。
  3. 肾活检来源细胞的耗氧率与糖酵解速率测定
    1. 确认代谢功能分析仪已开启，并与附属计算机中的控制软件连接。
    2. 启动软件。
    3. 点击 模板 > 空白 按钮。
    4. 在第一个标签页中，点击 加样策略 按钮。依次点击对应四个加样口的 A、B、C 或 D 按钮，填写每个加样口将注入的药物名称：寡霉素（A 口）、FCCP（B 口）、2-DG（C 口）、Rot + AA（D 口）。
    5. 在第二个标签页中，定义所有实验条件。点击 添加条件 按钮以引入新条件。软件将自动为每种条件分配一种颜色。点击 板图 按钮，为每个孔分配相应的实验条件，孔将按条件着色。
      注意：四个角孔必须保持为空白（黑色），用于扣除背景信号。
    6. 在第三个标签页中，点击“加样”按钮四次，使四次加样（A、B、C、D 口）均加入运行序列。检测可使用默认加样顺序（A、B、C、D）、测量次数（3 次基础测量 + 每次加样后 3 次测量）及测量间隔时间（3 分钟）。
    7. 在第四个标签页中，填写必要的研究信息，点击 运行。托盘将打开，软件提示用户安装试剂盒辅助板。放置板前请务必移除绿色盖板。
    8. 校准完成后（约 15 分钟），托盘再次打开，软件提示用户取下试剂盒辅助板，并将代谢功能检测板放置于托盘上。再次确认在安装前已移除检测板盖板。试剂盒辅助板可丢弃。
    9. 检测约 2 小时后结束。完成后保存相应的 '.asyr' 文件。通过计算分析 .asyr 文件，观察细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）曲线，并将数据导出为所需格式。
  4. 测定 DNA 含量以归一化代谢功能数据
    1. 使用指定的细胞增殖检测试剂盒（见材料表），测定代谢功能检测后各孔细胞中的 DNA 含量。
    2. 用去离子水将 20× 细胞裂解缓冲液稀释，配制所需体积的 1× 细胞裂解缓冲液。
    3. 为建立标准曲线，使用细胞裂解缓冲液对试剂盒中提供的噬菌体 λ DNA 标准品进行系列稀释，配制浓度分别为 0 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL 的 100 µL 样品，并将各稀释液加入黑色 96 孔微孔板的不同孔中。
    4. 将 400× 染料试剂用 1× 细胞裂解缓冲液稀释，配制 1× 染料结合溶液。每个标准曲线孔和代谢功能检测实验孔均需 100 µL。
    5. 向已含有标准品的第一列各孔中加入 100 µL 1× 染料溶液。注意：此步骤可在代谢功能检测结束前 30 分钟开始进行。
    6. 使用单通道或多通道移液器，吸除代谢功能检测板中的检测培养基。
    7. 使用多通道移液器，向代谢功能检测板的每个实验孔中加入 100 µL 1× 染料结合溶液。反复吹打数次以裂解细胞，随后将内容物转移至黑色微孔板中。
    8. 避光孵育，37 °C 孵育 2–5 分钟。
    9. 使用荧光酶标仪检测各样品的荧光强度，激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm。

3. 肾活检来源细胞中ATP含量的测定

注意：使用指定的ATP检测试剂和重组ATP（rATP）标准品（见材料表）测定肾活检来源的肾细胞中的ATP含量。

  1. 若为冷冻状态，将ATP检测试剂在4 °C下过夜解冻。
  2. 获得活检来源的细胞悬液并进行细胞计数后，将1.0 × 104个活细胞/孔接种至白色96孔微孔板的每孔中，每孔含100 µL添加10% FBS的RPMI 1640培养基。微孔板的第一列保持空置，因其将在次日用于加载rATP标准曲线。
  3. 将微孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。
  4. 次日，将ATP检测试剂在室温下预热。
  5. 制备rATP标准曲线。用PBS将rATP标准品进行系列稀释，配制成以下浓度的100 µL样品：0 nM、0.001 nM、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM。
  6. 将每种rATP标准品各50 µL加入微孔板的第一列中。
  7. 使用单通道或多通道移液器，移除各实验孔中的含10% FBS的RPMI 1640培养基。
  8. 用100 µL PBS（在37°C水浴中预热）洗涤每个实验孔。
  9. 移除PBS，并向每个实验孔中加入50 µL新鲜PBS。
  10. 向标准品孔和实验孔中各加入50 µL ATP检测试剂。
  11. 混匀后，先在37 °C孵育2分钟，随后在室温孵育10分钟。
  12. 使用微孔板读数仪读取并记录发光信号。

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结果

该实验流程在来自健康的3月龄雄性约克夏猪的活检肾细胞中进行了测试。组织解离和细胞接种的方案按照上述步骤进行。细胞贴壁培养16小时后，使用代谢功能分析仪实时检测活检来源的猪肾细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），分别作为线粒体呼吸和糖酵解的指标。

第一项实验旨在确定在活检来源的肾细胞中，能够可靠测量耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）值以及对代谢应激产生预期反应的最佳接种密度。共测试了四种不同的接种密度：15,000 个细胞、30,000 个细胞、60,000 个细胞和 1,20,000 个细胞。细胞被置于标准配方的功能测定培养基中（5.5 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸）。通过注射已报道的药物序列以以下剂量诱导代谢应激：1 µM 寡霉素（oligomycin）、0.3 µM FCCP、100 mM 2-DG 和 1 µM Rot+AA。这些剂量在既往针对人肾细胞的研究中表现出最佳效果25,40。观察到细胞密度与 OCR 和 E...

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讨论

本文介绍了一种评估肾活检所得肾细胞代谢功能的独特方法。该方法结合了从新鲜肾穿刺活检组织中制备单细胞悬液的实验方案，以及对代谢功能和细胞内ATP水平的分析。通过测量细胞外酸化率（ECAR）评估糖酵解，通过测量氧消耗率（OCR）评估线粒体呼吸。研究采用猪肾活检组织对方法学进行了优化。

为了有效研究所获得细胞中的生物能量功能 通过 使用代谢功能分析仪对肾活检组织进行解离时，首先优化接种的活细胞密度、滴定所用应激化合物的剂量（如适用），并在能反映预期结果的临床相关实验组中验证方法学至关重要。已在不同细胞密度和应激化合物浓度下进行优化。结果表明，当接种 1,00,000 个细胞时，可获得预期的 OCR 和 ECAR 基线值及曲线形态 细胞/孔，并在暴露于1 µM 寡霉素、0.3 µM FCCP、50 mM 2-DG 和1 µM 鱼藤酮/抗霉素A（Rot/AA）后检测。总体而言，活检来源的肾细胞显示出可检测的基础OCR和ECAR值，在技术重复样本中OCR和ECAR值具有一致性，并对代谢应激化合物表现出预期的反应，证实了该方法的有效性和可行性（

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披露

所有合著者均无须披露的竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

AK 获得了多伦多大学健康网络基金会（资助编号 579067450776、579072310776 和 579068260776）的支持。SC-F 获得了肾脏研究科学家核心教育与国家培训项目（KRESCENT）（项目编号 2019KPPDF637713 和 24KNIA-1291062）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-脱氧-D-葡萄糖SigmaD6134糖酵解的竞争性抑制剂
5 mL 圆底聚苯乙烯
带细胞筛 snap 盖试管		Falcon352235解离用试管
来自 Streptomyces sp. 的抗霉素 ASigmaA8674呼吸链复合体 III 的抑制剂
AOF BP 蛋白酶VitaCyte003-1000解离酶
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)
苯腙（FCCP）		SigmaC2920氧化磷酸化解偶联剂
CellTiter-Glo 2.0 检测试剂盒，100 mLPromegaG9242细胞内 ATP 的测定
胶原酶 MAVitaCyte001-2030解离酶
CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒（用于培养细胞）InvitrogenC7026细胞内 DNA 的测定
D-葡萄糖，无水，试剂级BioshopGLU501代谢底物
DNase IStemcell07469解离酶
胎牛血清，优级，
美国来源，热灭活，500 mL		Wisent080-450解离培养基补充剂
L-谷氨酰胺-200 mM（100 倍液），100 mL 液体Gibco25030081代谢底物
寡霉素 ASigma75351ATP 合酶抑制剂
PBS，无钙镁，500 mLWisent311-010-CL细胞洗涤液
rATP， 10 mM， 0.5 mLPromegaP1132细胞内 ATP 的测定
鱼藤酮SigmaR8875呼吸链复合体 I 的抑制剂
RPMI 1640Gibco11875119解离培养基
Seahorse Wave 控制器软件 2.6AgilentN/A代谢功能测定的设置
Seahorse Wave 桌面软件 2.6AgilentN/A代谢功能数据的分析
Seahorse XF 基础培养基， 不含酚红，500 mLAgilent103335-100代谢功能的测定
Seahorse XFe96 FluxPak （20 块板，18 个 cartridge，
和 500 mL 校准液）		Agilent102416-100代谢功能的测定
Seahorse XFe96 代谢功能分析仪Agilent101991-100代谢功能的测定
丙酮酸钠溶液 100 mM（100 倍液），100 mL 液体Gibco11360070代谢底物

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