本文的目的是探讨使用狂犬病间接荧光抗体试验来检测狂犬病特异性IgG和IgM抗体的方法。
本文内容
摘要
摘要
间接荧光抗体（IFA）试验用于检测血清或脑脊液中多种特异性抗狂犬病抗体亚型。该试验可快速获得结果，适用于多种不同情况下的狂犬病抗体检测。狂犬病IFA试验尤其适用于快速、早期检测抗体，以评估已感染狂犬病患者的免疫应答。尽管其他抗狂犬病死后诊断方法具有更高优先级，但该试验仍可用于通过抗体检测证明近期曾暴露于狂犬病病毒。IFA试验不能提供病毒中和抗体（VNA）滴度，但可通过检测抗体的阳性或阴性结果来评估暴露前预防（PrEP）的免疫反应。该试验可用于多种场景，并可针对多个不同目标提供检测结果。在本研究中，我们使用了若干份接受过暴露前预防接种个体的配对血清样本，并通过IFA试验展示了其随时间推移的狂犬病抗体存在情况。
引言
狂犬病间接荧光抗体（IFA）检测用于检测血清或脑脊液中多种特异性抗狂犬病抗体的同种型。该检测是可用于监测活体狂犬病患者的一系列检测方法之一，尤其适用于早期检测抗体，以评估患者对狂犬病感染的免疫应答。当结合其他检测方法、病史及患者的疫苗接种情况时，IFA 检测有助于判断是否暴露于狂犬病毒或疫苗1。由于 IFA 检测可测定 IgM 和/或 IgG，特异性抗体的数值可提示抗原暴露后的大致时间范围1。该检测可能适用于所列应用，或其他尚未探索的应用场景。
目前有多种狂犬病血清学检测方法可供选择。快速荧光灶抑制试验（RFFIT）、荧光抗体病毒中和试验（FAVN）或其改良方法是检测狂犬病病毒中和抗体（RVNAs）的主要手段1。然而，这些检测方法无法区分IgM和IgG抗体。当需要区分抗体亚型以监测狂犬病免疫反应时，可采用狂犬病免疫荧光试验（IFA）和狂犬病酶联免疫吸附试验（ELISA），但这些方法并不检测RVNAs。尽管IFA和ELISA可用于确定样本中是否存在特异性抗狂犬病抗体，但两者在操作上存在一些差异。IFA试验以细胞培养的活病毒作为抗原底物，而典型的狂犬病ELISA检测则使用一种或多种病毒蛋白作为抗原。在具备培养狂犬病病毒能力的实验室中，相比购买或培养单一病毒蛋白用于ELISA，执行IFA试验可能更为简便。在选择具体检测方法时，应充分考虑检测目的以及从检测结果中希望获取的信息2。
IgM 是最先产生的抗体，其水平持续升高直至约第28天发生类别转换，此时IgG成为主要的循环抗体3。因此，在暴露于狂犬病病毒或接种疫苗后，IgM仅在有限的时间内可被检测到。同时检测血清和脑脊液（CSF）可帮助判断暴露来源：若抗体仅存在于血清中，则提示为疫苗接种所致；若为病毒感染，则可能在脑脊液中检测到抗体1。
已有研究证实，暴露前预防（PrEP）后狂犬病抗体可持续存在数年4。免疫荧光试验（IFA）可作为一种有效工具，用于在接种疫苗或暴露后的不同时间点证明抗体的存在。
方案
以下方案已获得纽约州卫生部沃兹沃思中心批准，用于检测方法开发中人体样本的伦理使用，方案批准编号 #03-019。
1. 安全
- 穿戴个人防护装备（PPE），至少包括眼部防护（眼镜或面罩）、外科口罩和非乳胶手套。
- 确保工作人员已接种狂犬病疫苗，并且在过去6个月内检测显示抗体滴度≥0.5 IU/mL。
2. 抗原玻片制备
注意：所有病毒、脑脊液和血清操作均须在生物安全柜（BSC）中进行，并采用通用预防措施。
- 将鼠神经母细胞瘤细胞或BHK-21细胞制备成20 mL悬液，浓度为3.0 × 105 个细胞/mL，使用添加10%胎牛血清的Eagle最小必需培养基（EGM）配制，并置于低温保存直至使用。
- 将CVS-11病毒用EGM稀释至工作浓度为每毫升1.0 × 106.5 50%组织培养感染剂量（TCID50），置于低温保存直至使用。
注：TCID50采用先前发表的Reed和Muench方法测定5。 - 用70%乙醇清洁湿度培养载片室和聚四氟乙烯（PTFE）涂层载片孔，然后在生物安全柜（BSC）中自然晾干。
- 向载片室内的吸水纸条上加入蒸馏水（dH2O），以确保整个操作过程中湿度保持恒定。
- 使用铅笔在每张待用载片上标记批号、日期、细胞类型及其他储存所需的识别信息，并将载片放入载片室中。
注：大多数记号笔、笔或标签无法耐受后续的丙酮固定步骤（步骤2.9）。 - 使用重复移液器向载片上的每个孔中加入50 µL病毒稀释液，然后向每个孔中加入50 µL细胞稀释液，注意避免移液器吸头接触孔中已存在的病毒而造成污染。
- 关闭湿度载片室，并将其置于34–36 °C的湿化培养箱中。24小时后评估细胞感染性。
注：步骤2.8–2.12仅在一张载片上进行。 - 从湿度室中取出载片，小心吸除上清液。将载片在盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的Coplin染色缸中清洗2分钟，然后让其自然晾干。
- 将载片放入Coplin染色缸中，置于-20 °C专用于易燃材料的冰箱中，用冷丙酮固定至少1小时。所有丙酮倾倒和晾干操作均应在通风橱中进行。
- 让丙酮迅速挥发并使载片干燥。按照制造商说明书配制狂犬病直接荧光抗体（DFA）结合物，将其加入载片各孔中，在34–36 °C湿化培养箱中孵育30分钟。
- 将载片在盛有PBS的Coplin染色缸中清洗两次，每次2分钟。自然晾干载片。
- 用含0.05 M Tris、0.15 M NaCl（pH 9.0）和20%甘油的封片剂封片，并在荧光显微镜下以200倍放大倍数观察载片以评估感染性。若细胞感染率未达到约50%，则于次日重复步骤2.7–2.12，直至达到所需感染水平。
注：细胞感染性通过目视评估载片孔中阴性细胞与狂犬病阳性细胞的比例进行估算。阴性细胞呈红色，阳性细胞则显示绿色荧光染色。 - 从培养箱和湿度室中取出其余载片。小心吸除各孔中的上清液，然后将载片放入盛有PBS的Coplin染色缸中浸泡1–2分钟。自然晾干约30分钟。将载片储存于-80 °C，直至使用。
3. 样品制备
- 准备用于检测的患者血清或脑脊液样本稀释液。将必要的偶联物用含0.05%伊文思蓝的PBS稀释至适当的工作浓度。
注意：在使用前应将偶联物避光保存，以维持荧光素的完整性
4. 免疫荧光分析（IFA）操作步骤
- 取出每项检测所需数量的预制抗原载玻片，使其完全解冻并彻底干燥。
- 将载玻片放入Coplin染色缸中，在-20 °C专用于易燃材料的冰箱中，用冷丙酮固定2小时至过夜。从丙酮中取出载玻片，使其自然风干。
- 将载玻片放入生物安全柜内的湿盒中，并放置经dH2O浸润的吸水条以维持湿度。向预先确定的每个孔中加入50 µL的各样本稀释液、对照样本或PBS。
注意：每张载玻片必须包含适当数量的患者样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔以及PBS细胞对照孔。 - 将封闭的湿盒置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中。孵育30分钟后，将湿盒从培养箱中取出，并放入生物安全柜中。
- 使用吸液头小心吸去每个孔中的上清液，注意不要破坏细胞单层。用无菌滴管向每个孔中加入一滴PBS。
- 再次小心吸去液体，然后将每张载玻片放入盛有PBS的Coplin染色缸中，总共清洗两次，历时15分钟。
- 将载玻片重新放回湿盒中，向每个孔中加入50 µL适当的抗人抗体偶联物。重复步骤4.4至4.6。
- 让载玻片自然风干，用封片剂封片，并在荧光显微镜下观察结果。
5. 载玻片分析
- 根据染色模式和荧光强度，将样本与已确认具有高抗狂犬病抗体滴度的阳性对照样本进行比较，进行分级。
- 将样本按阴性、1+、2+、3+ 和 4+ 的等级进行评分，其中阴性结果无荧光染色，4+ 表示呈现明亮的苹果绿色荧光，且染色模式与阳性对照样本相似1。
注：苹果绿色仅适用于 FITC 标记的抗体；荧光颜色因所选荧光染料的不同而有所差异。 - 将样本的终点值定为显示 1-2+ 等级时的稀释倍数。若初始检测中未达到终点，应以更高的稀释倍数对样本进行测试。
结果
所有血清样本均在暴露前预防（PrEP）后的相近时间段内从患者采集。样本来自五名不同患者，采集时间点分别为：狂犬病疫苗最后一针接种后2周、狂犬病疫苗全程接种后6个月，以及狂犬病疫苗全程接种后18个月。每份血清样本均进行系列稀释，并根据方案步骤5.2和5.3所述方法，对IgM和IgG的存在情况进行分级检测。所确定的抗体效价为样本达到1-2+终点级别的稀释倍数。
暴露前预防（PrEP）后各时间点的检测结果表明，该检测方法能够检测出不同水平的抗体存在。初次接种疫苗后不久，患者样本中即存在较高水平的IgM和IgG，如图1所示。明亮的绿色荧光细胞染色区域表明抗体呈阳性；红色细胞为狂犬病抗体阴性细胞，无抗体结合。接种疫苗约6个月后，患者样本中IgM和IgG的水平均显著降低，但IgM几乎完全消失。在最后一个时间点，即接种疫苗后18个月，所有患者样本中均未检测到IgM抗体，如图2所示，未观察到绿色荧光细胞染色。然而，IgG水平持续存在，并保持在与接种后6个月时间点相似的水平，相较于接种后2周的时间点有所下降。接种后2周、6个月和18个月采集的样本中IgG和IgM检测结果分别列于表1、表2和表3中。图3展示了实验执行阶段的流程图。
图1：狂犬病IgM免疫荧光检测阳性染色。 在完成暴露前预防接种（PrEP）系列疫苗后不久，患者血清在1:8稀释度下显示出阳性染色模式。图像中的比例尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：狂犬病IgM免疫荧光检测阴性染色结果。 一名患者在完成暴露前预防接种（PrEP疫苗）系列约18个月后，其血清在1:2稀释度下未显示阳性染色。图像中的比例尺代表100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：狂犬病免疫荧光检测流程图。 该流程图展示了免疫荧光检测（IFA）主要步骤的执行阶段，有助于对整个流程进行可视化理解。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 患者样本 | IgM | IgG |
| PS1-1 | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 | 1:16 | 1:128 |
表1：接种疫苗后2周的结果。 在完成PrEP疫苗接种系列后约2周采集的血清样本的患者检测结果。
| 患者样本 | IgM | IgG |
| PS1-2 | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 | 1:1 | 1:32 |
表2：接种疫苗后6个月的结果。 在完成PrEP疫苗接种系列约6个月后采集的血清样本的患者检测结果。
| 患者样本 | IgM | IgG |
| PS1-3 | 未检出 | 1:128 |
| PS2-3 | 未检出 | 1:128 |
| PS3-3 | 未检出 | 1:64 |
| PS4-3 | 未检出 | 1:64 |
| PS5-3 | 未检出 | 1:32 |
表3：接种疫苗后18个月的结果。 在完成PrEP疫苗系列接种后约18个月采集的血清样本的患者检测结果。
讨论
免疫荧光检测（IFA）利用抗原-抗体复合物，通过标记位点来可视化狂犬病特异性抗体。将神经母细胞瘤细胞或BHK细胞接种于多孔聚四氟乙烯（PTFE）涂层载玻片上，并接种狂犬病病毒实验室毒株CVS-11。待细胞单层融合且感染率达到约50%的理想水平后，将载玻片保存备用6。
将患者血清或脑脊液加入感染的细胞单层，孵育以使任何特异性抗狂犬病抗体与病毒抗原结合7。洗涤后，加入荧光标记的抗人IgG或IgM抗体，该抗体将与样本中结合于病毒的抗体结合。随后可在荧光显微镜下观察标记的抗体。
在准备进行本实验时，确定患者样本、对照品和结合物的最佳处理方式至关重要。初始患者样本以较低稀释倍数或未经稀释进行筛查，以检测是否存在抗体。对于成对样本或既往筛查显示抗体水平较高的样本，则进一步稀释至终点。IgG检测的初始患者样本使用市售的免疫荧光分析稀释液进行配制；IgM检测样本则首先使用市售的IgG阻断试剂进行处理。两种检测后续的系列稀释均在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行。
用于检测的对照样本取自已知接受过狂犬病暴露前预防接种（PrEP）的个体，或从未接种过狂犬病疫苗的个体。所有对照样本在使用前均经过抗体存在的检测。IgG 阳性对照样本来自一名狂犬病疫苗接种者，其狂犬病中和抗体滴度已通过 FAVN 检测确认。IgM 阳性对照样本来自一名完成疫苗接种约 2 周后的狂犬病疫苗接种者。
选择合适的共轭物是进行间接免疫荧光试验（IFA）的另一个关键方面。每个试验所使用的共轭物取决于该检测所针对的抗体同种型。本实验中采用了 commercially available FITC 标记的抗人 IgG 和抗人 IgM 抗体。工作用抗体共轭物的稀释度在检测前根据生产商的建议确定。
该实验流程中有几个关键步骤可确保免疫荧光检测（IFA）的成功实施，其中最重要的可能是抗原玻片的制备。当感染率达到约50%时，可为可用抗体提供充足的结合位点，同时在读取和判读样本时获得更清晰的结果。狂犬病阴性细胞形成对比背景，有助于更好地观察标记的抗体。在使用复杂样本基质（如血清）进行荧光染色时，非特异性染色也可能成为问题。使用IgG灭活试剂（例如Gullsorb）有助于减少干扰性IgG抗体引起的非特异性染色，从而更准确地评估IgM的存在8。正确准备实验材料，并将特殊试剂合理纳入实验流程，有助于减少染色问题，同时保持高质量的检测结果。
已开发出多种检测方法，用于狂犬病抗体的检测、定量和鉴定。每种检测方法所提供的结果均可根据所需信息以不同方式加以利用。狂犬病免疫荧光检测（IFA）是一种用于鉴定病毒特异性抗体亚型的有力工具，与其他检测方法（如RFFIT和FAVN检测）相比，其结果可在相对较短的时间内获得。
尽管间接免疫荧光试验（IFA）能够检测样本中的狂犬病抗体，但它无法对抗体进行标准化定量。IFA试验仅提供抗体检测消失时的血清稀释倍数。相比之下，快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和荧光抗体病毒中和试验（FAVN）可定量检测样本中抗体的中和能力，结果以国际单位（IU）表示，提供更为详细且标准化的结果。FAVN或RFFIT试验的结果反映的是中和抗体的存在，这些抗体已被确定为IgG类抗体9。由于IgM的结构特点，其在中和活性中的作用被认为非常有限10。因此，这些试验并不特异性地检测IgM抗体的存在。
在将检测方法及其结果应用于特定问题时，可能会遇到一些问题。目前，针对狂犬病病毒感染的抗体保护水平这一概念已不再用于评估狂犬病疫苗接种后的免疫反应。过去，保护性免疫反应被定义为抗体水平≥0.5 IU。然而，当前的文献通常将免疫后的抗体反应描述为“可接受”（≥0.5 IU）或“不可接受”（<0.5 IU）。如前所述，IFA检测无法提供以IU为单位的抗体滴度，因此不应将其用于判断对狂犬病的保护水平。在评估已出现狂犬病症状的患者时，由于疾病过程中免疫反应存在个体差异，IFA检测并不总能检出阳性抗体结果。鉴于狂犬病感染的致死率接近100%，在解读检测结果时，必须慎重考虑所用检测方法及其所能安全提供的信息量11。基于上述原因，在特定情况下，始终应全面评估所有狂犬病抗体检测方法，并确定最适用的一种。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢纽约州卫生部瓦兹沃思中心对本项目的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25x55mm 玻璃盖玻片 | 任意 | ||
| 丙酮 | 任意 | ||
| 标记偶联抗人 IgG 抗体 | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| 标记偶联抗人 IgM 抗体 | SeraCare | 5230-0286 | |
| 吸液移液器吸头 | 任意 | ||
| BHK-21 细胞 | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA 稀释液 | MBL BION | DIL-9993 | |
| 细胞培养用水 | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin 染色缸 | 任意 | ||
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| 带 FITC 滤光片的荧光显微镜 | 任意 | ||
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7893 | 封片剂 |
| Gullsorb IgM 灭活试剂 | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG 灭活试剂 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| 最低必需培养基 Eagle – 含 Earle’s 盐、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸，不含碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| 小鼠神经母细胞瘤细胞 | ATCC | CCL-131 | |
| 多孔聚四氟乙烯（PTFE）涂层玻片 | 任意 | ||
| PBS | 任意 | pH 7.6 | |
| 青霉素 | Sigma | P-3032 | EGM |
| 狂犬病直接荧光抗体偶联物 | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, 或 RU5500 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| 氯化钠晶体 | Sigma-Aldrich | S5886 | 封片剂 |
| 无菌滴管 | 任意 | ||
| 硫酸链霉素 | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma 预置 pH 9.0 晶体 | Sigma-Aldrich | S9693 | 封片剂 |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 | BD | 260300 | EGM |
| 维生素混合物 | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
参考文献
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