使用狂犬病间接荧光抗体试验检测IgG和IgM抗体

摘要

本文的目的是探讨使用狂犬病间接荧光抗体试验来检测狂犬病特异性IgG和IgM抗体的方法。

摘要

间接荧光抗体（IFA）试验用于检测血清或脑脊液中多种特异性抗狂犬病抗体亚型。该试验可快速获得结果，适用于多种不同情况下的狂犬病抗体检测。狂犬病IFA试验尤其适用于快速、早期检测抗体，以评估已感染狂犬病患者的免疫应答。尽管其他抗狂犬病死后诊断方法具有更高优先级，但该试验仍可用于通过抗体检测证明近期曾暴露于狂犬病病毒。IFA试验不能提供病毒中和抗体（VNA）滴度，但可通过检测抗体的阳性或阴性结果来评估暴露前预防（PrEP）的免疫反应。该试验可用于多种场景，并可针对多个不同目标提供检测结果。在本研究中，我们使用了若干份接受过暴露前预防接种个体的配对血清样本，并通过IFA试验展示了其随时间推移的狂犬病抗体存在情况。

引言

狂犬病间接荧光抗体（IFA）检测用于检测血清或脑脊液中多种特异性抗狂犬病抗体的同种型。该检测是可用于监测活体狂犬病患者的一系列检测方法之一，尤其适用于早期检测抗体，以评估患者对狂犬病感染的免疫应答。当结合其他检测方法、病史及患者的疫苗接种情况时，IFA 检测有助于判断是否暴露于狂犬病毒或疫苗¹。由于 IFA 检测可测定 IgM 和/或 IgG，特异性抗体的数值可提示抗原暴露后的大致时间范围¹。该检测可能适用于所列应用，或其他尚未探索的应用场景。

目前有多种狂犬病血清学检测方法可供选择。快速荧光灶抑制试验（RFFIT）、荧光抗体病毒中和试验（FAVN）或其改良方法是检测狂犬病病毒中和抗体（RVNAs）的主要手段¹。然而，这些检测方法无法区分IgM和IgG抗体。当需要区分抗体亚型以监测狂犬病免疫反应时，可采用狂犬病免疫荧光试验（IFA）和狂犬病酶联免疫吸附试验（ELISA），但这些方法并不检测RVNAs。尽管IFA和ELISA可用于确定样本中是否存在特异性抗狂犬病抗体，但两者在操作上存在一些差异。IFA试验以细胞培养的活病毒作为抗原底物，而典型的狂犬病ELISA检测则使用一种或多种病毒蛋白作为抗原。在具备培养狂犬病病毒能力的实验室中，相比购买或培养单一病毒蛋白用于ELISA，执行IFA试验可能更为简便。在选择具体检测方法时，应充分考虑检测....

方案

以下方案已获得纽约州卫生部沃兹沃思中心批准，用于检测方法开发中人体样本的伦理使用，方案批准编号 #03-019。

1. 安全

1. 穿戴个人防护装备（PPE），至少包括眼部防护（眼镜或面罩）、外科口罩和非乳胶手套。
2. 确保工作人员已接种狂犬病疫苗，并且在过去6个月内检测显示抗体滴度≥0.5 IU/mL。

2. 抗原玻片制备

注意：所有病毒、脑脊液和血清操作均须在生物安全柜（BSC）中进行，并采用通用预防措施。

1. 将鼠神经母细胞瘤细胞或BHK-21细胞制备成20 mL悬液，浓度为3.0 × 10⁵ 个细胞/mL，使用添加10%胎牛血清的Eagle最小必需培养基（EGM）配制，并置于低温保存直至使用。
2. 将CVS-11病毒用EGM稀释至工作浓度为每毫升1.0 × 10^6.5 50%组织培养感染剂量（TCID₅₀），置于低温保存直至使用。
   注：TCID₅₀采用先前发表的Reed和Muench方法测定⁵。
3. 用70%乙醇清洁湿度培养载片室和聚四氟乙烯（P....

结果

所有血清样本均在暴露前预防（PrEP）后的相近时间段内从患者采集。样本来自五名不同患者，采集时间点分别为：狂犬病疫苗最后一针接种后2周、狂犬病疫苗全程接种后6个月，以及狂犬病疫苗全程接种后18个月。每份血清样本均进行系列稀释，并根据方案步骤5.2和5.3所述方法，对IgM和IgG的存在情况进行分级检测。所确定的抗体效价为样本达到1-2+终点级别的稀释倍数。

暴露前预防（PrEP）后各时间点的检测结果表明，该检测方法能够检测出不同水平的抗体存在。初次接种疫苗后不久，患者样本中即存在较高水平的IgM和IgG，如图1所示。明亮的绿色荧光细胞染色区域表明抗体呈阳性；红色细胞为狂犬病抗体阴性细胞，无抗体结合。接种疫苗约6个月后，患者样本中IgM和IgG的水平均显著降低，但IgM几乎完全消失。在最后一个时间点，即接种疫苗后18个月，所有患者样本中均未检测到IgM抗体，如图2所示，未观察到绿色荧光细胞染色。然而，IgG水平持续存在，并保持在与接种后6个月时间点相似的水平，相较于.......

讨论

免疫荧光检测（IFA）利用抗原-抗体复合物，通过标记位点来可视化狂犬病特异性抗体。将神经母细胞瘤细胞或BHK细胞接种于多孔聚四氟乙烯（PTFE）涂层载玻片上，并接种狂犬病病毒实验室毒株CVS-11。待细胞单层融合且感染率达到约50%的理想水平后，将载玻片保存备用⁶。

将患者血清或脑脊液加入感染的细胞单层，孵育以使任何特异性抗狂犬病抗体与病毒抗原结合⁷。洗涤后，加入荧光标记的抗人IgG或IgM抗体，该抗体将与样本中结合于病毒的抗体结合。随后可在荧光显微镜下观察标记的抗体。

在准备进行本实验时，确定患者样本、对照品和结合物的最佳处理方式至关重要。初始患者样本以较低稀释倍数或未经稀释进行筛查，以检测是否存在抗体。对于成对样本或既往筛查显示抗体水平较高的样本，则进一步稀释至终点。IgG检测的初始患者样本使用市售的免疫荧光分析稀释液进行配制；IgM检测样本则首先使用市售的IgG阻断试剂进行处理。两种检测后续的系列稀释均在磷酸盐缓冲液（PBS）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25x55mm 玻璃盖玻片	任意
丙酮	任意
标记偶联抗人 IgG 抗体	Sigma-Aldrich	F9512
标记偶联抗人 IgM 抗体	SeraCare	5230-0286
吸液移液器吸头	任意
BHK-21 细胞	ATCC	CCL-10
BION IFA 稀释液	MBL BION	DIL-9993
细胞培养用水	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin 染色缸	任意
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
带 FITC 滤光片的荧光显微镜	任意
甘油	Sigma-Aldrich	G7893	封片剂
Gullsorb IgM 灭活试剂	Fisher Scientific	23-043-158	IgG 灭活试剂
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
最低必需培养基 Eagle – 含 Earle’s 盐、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸，不含碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
小鼠神经母细胞瘤细胞	ATCC	CCL-131
多孔聚四氟乙烯（PTFE）涂层玻片	任意
PBS	任意		pH 7.6
青霉素	Sigma	P-3032	EGM
狂犬病直接荧光抗体偶联物	Millipore Sigma	5100, 5500, 6500, RU5100, 或 RU5500
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
氯化钠晶体	Sigma-Aldrich	S5886	封片剂
无菌滴管	任意
硫酸链霉素	Sigma	S9137	EGM
Trizma 预置 pH 9.0 晶体	Sigma-Aldrich	S9693	封片剂
胰蛋白胨磷酸盐肉汤	BD	260300	EGM
维生素混合物	Sigma-Aldrich	M6895	EGM