本方案介绍了一种基于位点特异性重组的基因座特异性染色质分离方法，用于从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中纯化处于天然染色质环境下的单拷贝目标基因座。
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本文内容
摘要
摘要
真核生物染色质的基本结构单位是核小体核心颗粒（NCP），其由DNA在组蛋白八聚体周围缠绕约1.7圈构成。染色质定义为核小体核心颗粒以及包括转录因子、染色质重塑和修饰酶在内的多种其他蛋白质复合物的总和。目前仍不清楚在细胞周期不同阶段，这些蛋白质-DNA相互作用如何在特定基因组位点水平上被精确调控。这主要是由于现有技术的局限性，使得对这类动态相互作用进行精确测量具有挑战性。本文描述了一种改进的方法，将位点特异性重组与高效的单步亲和纯化方案相结合，以分离处于天然染色质状态的单拷贝目标基因座。该方法可实现目标位点相对于全基因组染色质的显著富集，从而使该技术成为以无偏倚且系统的方式识别和定量蛋白质相互作用的有效策略，例如通过质谱分析。除了此类组成性分析之外，通过该方法纯化的天然染色质很可能真实反映了体内核小体定位和组蛋白修饰的情况，因此适用于对酵母中几乎任意基因组位点来源的染色质进行进一步的结构和生化分析。 在体内 关于核小体定位和组蛋白修饰的情况，因此适用于对酵母中几乎所有基因组位点来源的染色质进行进一步的结构和生化分析。
引言
真核生物基因组动态地组织成染色质，既将DNA压缩以适应细胞核的空间限制，又确保基因表达所需的动态性以及调控因子的可及性。这种多功能性部分由核小体介导，核小体是染色质的基本单位，包含一个核心颗粒，其中147 bp的DNA围绕组蛋白八聚体缠绕约1.7圈1。核小体在组成上具有高度动态性，其N端和C端组蛋白尾部存在多种组蛋白变体及翻译后修饰（PTMs）。此外，真核生物染色质还与多种其他关键组分相互作用，如转录因子、DNA和RNA加工机器、结构蛋白、参与染色质重塑和修饰的酶类，以及与染色质结合的RNA分子。所有参与转录、复制和修复的关键分子机器都需要接触染色质，而染色质正是这些过程的天然底物。因此，要理解这些DNA相关活动背后的分子机制，就必须精确界定在这些分子机器聚集并推动生物学反应的特定基因组区域中染色质结构的整体变化。
尽管通过遗传学和蛋白质-蛋白质相互作用研究已鉴定出大量染色质因子，但在特定基因组位点上进行直接、无偏倚且全面的染色质相互作用分析仍是一个重大挑战2,3。最初，只有基因组中丰度极高的区域（例如重复序列位点）或多拷贝质粒能够被分离出足够数量和纯度的样品，用于质谱鉴定其相关蛋白4,5
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方案
有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。所用溶液、缓冲液和培养基的列表见表1。
1. 重组酵母菌株的构建
- 为构建具有重组能力的酵母菌株，将经 SbfI 酶切的质粒 K238 转化至一种酵母菌株中，该菌株在目标位点处已整合有 LexA 结合位点和 RS 重组位点13,14。
注意：转化的 SbfI 限制性片段包含一个必需的表达盒，用于组成型表达 LexA-TAP 融合蛋白和 R-重组酶，同时含有酵母 1 号染色体的同源序列，可通过同源重组将该表达盒整合到基因组中（图 1）。 - 为构建对照菌株，选用一个遗传背景相同但未整合 RS 和 LexA 结合位点的酵母菌株，在与重组能力菌株相同的条件下，将其转化经 SbfI 酶切的 K238 质粒。
- 根据 SCD-LEU 琼脂平板上的 LEU2 筛选标记筛选转化成功的酵母细胞14。
2. 将IgG抗体偶联至环氧活化磁珠
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结果
约1.4 kb的ARS316染色质区域的纯化由组成型表达的LexA-TAP衔接蛋白介导。作为阴性对照，我们使用了一种同源菌株进行纯化实验，该菌株表达LexA-TAP，但不含有整合的RS序列和LexA结合位点。图3展示了在对照菌株和具有重组能力、靶向ARS316位点的菌株上进行的标准纯化实验的DNA分析结果。在提取DNA并用限制性内切酶消化以线性化环状DNA分子后，通过qPCR分析评估ARS316靶位点相对于无关基因组对照位点PDC1的纯化效率。
此外，还对ARS316位点在总染色质中的富集程度进行了定量分析（图3A，B）。阴性对照菌株在除粗细胞提取物、上样样品和穿流组分以外的任何组分中均未检测到ARS316或PDC1位点的回收，表明在TEV酶切洗脱和变性洗脱组分中均未观察到特异性富集。相反，在重组菌株中，ARS316位点在穿流组分中几乎完全耗尽，并可在TEV酶切洗脱及变性洗脱后从磁珠中回收。TEV酶切洗脱后，磁珠上仍保留较高比例的.......
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讨论
鉴定特定基因组靶区域的相关因子及其染色质景观仍是染色质研究中的一个主要挑战18。本方案描述了一种高效系统，可特异性地切除并纯化来自酵母染色体的特定染色质区域。据我们所知，这种单步纯化方法在纯度和得率方面克服了现有基因座特异性染色质纯化技术的诸多局限，从而能够实现靶向基因座相对于其他非相关基因组区域的高度富集。
由于使用了位点特异性R重组酶的额外切除步骤，另一个优点是，可以根据基因组中重组位点的精确位置，准确确定被纯化的基因组区域。相比之下，其他方法依赖于超声波对DNA的剪切，从而产生长度不均一的分子片段；这种异质性使得这些方法在纯化明确定义的目标基因座方面精确度较低。
最后，该纯化策略采用天然条件，不使用甲醛等化学交联剂，因此通过此方法获得的分离产物适用于结构与功能分析。纯化方案中的一个关键步骤是TEV蛋白酶切洗脱的效率，其强烈依赖于多个参数，包括TEV蛋白酶的活性、反应条件和反应体积。在所示实验中，洗脱体积被设定为最小值，这影响了洗脱效率。然而，增加洗脱体积和TEV蛋白酶用量可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.H. 实验室的工作得到了德国研究基金会（DFG）通过SFB1064（项目编号213249687）、欧洲研究理事会（ERC起始资助852798 ConflictResolution）以及亥姆霍兹学会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酵母菌株 | |||
| 对照菌株： MATa；ura3Δ0；leu2Δ0；his3Δ1；met15Δ0；bar1::kanMX4；Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | 第1节，参见参考文献13和14 | ||
| 重组菌株： MATa；ura3Δ0；leu2Δ0；his3Δ1；met15Δ0；bar1::kanMX4；RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS；Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | 第1节，参见参考文献13和14 | ||
| 质粒 | |||
| K238 质粒 | 第1节，参见参考文献13 储存条件：-20℃保存 °C | ||
| K071 Spike-in 质粒 DNA | 第7.1节，参见参考文献13 储存：于 -20 ℃ 保存 °C | ||
| 试剂 | |||
| 丙酮 | 卡尔·罗斯 | 5025.1 | 第2节 储存条件：室温保存 |
| 乙酸铵（NH₄OAc）4乙酰化) | Sigma Aldrich | A7262 | 第6节和第7.1节 储存条件：室温保存 |
| 氨溶液（NH₄OH）4OH) 25% | 默克密理博 | 533003 | 第6节 储存条件：室温保存 |
| 硫酸铵 | Santa Cruz | Sc-29085 | 第2节 储存条件：室温保存 |
| Bacto 琼脂 | BD（VWR） | 90000-760 | 第3节 储存条件：室温保存 |
| 胰蛋白胨 | BD（VWR） | 211820 | 第3节 储存条件：室温保存 |
| β-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | 07604 | 第 7.2 节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 化学发光底物试剂盒 | ThermoFisher | 34580 | 第 7.2 节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 十二水合磷酸氢二钠 | 默克 | 1.06579.1000 | 第2节和第7.1节 储存条件：室温保存 |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | 第4节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 乙醇 | 默克 | 100983 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma Aldrich | ED | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 半乳糖（20% (w/v) 储液） | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | 第3节 储存条件：室温保存 |
| 上样缓冲液（6x） | BioLabs | B7024A | 第 7.1 节 储存：于 -20 ℃ 保存 °C |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 部分 储存条件：室温保存 |
| 甘氨酸 | 卡尔·罗斯 | .0079.4 | 第2节 储存条件：室温保存 |
| 糖原（5 mg/mL） | Invitrogen | AM9510 | 第 7.1 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 盐酸（HCl） | PanReac AppliChem | 182109.1211 | 第2、4和7.1节 储存条件：室温保存 |
| 乙酸镁（MgAc） | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | 第4节 储存条件：室温保存 |
| 氯化镁（MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | 第6节 储存条件：室温保存 |
| Nu PAGE LDS 样品缓冲液 (4x) | Invitrogen | 2399549 | 第 7.2 节 储存条件：室温保存 |
| 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 v/v） | Invitrogen | 15593-031 | 第 7.1 节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 氯化钾（KCl） | Sigma | P9541 | 第4节 储存条件：室温保存 |
| 放射性标记的 α-32P dATP（3,000 Ci/mmol，10 mCi/mL） | Hartmann Analytic | SRP-203 | 第 7.1 节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| RadPrime标记系统 | ThermoFisher | 18428-011 | 第 7.1 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 棉子糖（20% (w/v) 储存液） | SERVA | 34140.03 | 第3节 储存条件：室温保存 |
| 氯化钠（NaCl） | 默克 | K53710504142 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 柠檬酸钠（Na3C6H5O7） | Sigma-Aldrich | 71402 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma Aldrich | S5881 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS）（5% 储液（w/v）） | Alfa Aesar | A11183 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71496 | 第2节和第7.1节 储存条件：室温保存 |
| 钠 叠氮化物 | Santa Cruz 生物技术 | sc-208393 | 第2节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 三乙胺 | Sigma Aldrich | 90340 | 第2节 储存条件：室温保存 |
| Tris 碱 | Chem Cruz | SC-3715B | 第2节和第4节 储存条件：室温保存 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | 第2节和第4节 储存条件：室温保存 |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | 第4节 储存条件：室温保存 |
| 酵母提取物 | BD（VWR） | 212720 | 第3节 储存条件：室温保存 |
| 酵母交配因子 alpha (1 µg/mL 储液 | 生物分子 | Y2016.5 | 第3节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 酵母合成型完全培养基补充剂（不含亮氨酸） | Sigma Aldrich | Y1376 | 第1节，参见参考文献14 |
| 酶 | |||
| HpaI 限制性内切酶（5,000 U/mL） | NEB | R0105S | 第 7.1 节 储存：于 -20 ℃ 保存 °C |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100倍浓缩液） | ThermoFisher Scientific | 78446 | 第4节 储存：在4℃保存 °C |
| 蛋白酶K（10 mg/mL） | SERVA | 33756 | 第 7.1 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| RNase A（10 mg/mL） | ThermoFisher | EN0531 | 第 7.1 节 储存：于 -20 ℃ 保存 °C |
| TEV 蛋白酶（10000 U/µL) | NEB | P8112S | 第5节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 材料 | |||
| BcMag 环氧活化磁珠 | Bioclone Inc. | FC-102 | 第2节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 干冰 | 第4节 | ||
| 低吸附离心管 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | 第4节 |
| Microspin G-25 柱 | Cytiva | 27-5325-01 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| Parafilm | 默克 | P7793 | 第4节 |
| 正电尼龙膜 | Biozol | 11MEMP0001 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| PVDF 转膜膜 | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | 第 7.2 节 储存条件：室温保存 |
| SDS-PAGE 凝胶 4-12% bis-tris（15 孔，1.5 mm） | Invitrogen | NP0336BOX | 第 7.2 节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 注射器（25 mL，带鲁尔接头） | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | 第3节 |
| Whatman 滤纸（Grade 3MM CHR 纤维素 Western 印迹膜片） | Cytiva | 3030-917 | 第 7.1 节 储存条件：室温保存 |
| 抗体 | |||
| 抗LexA，兔多克隆IgG，DNA结合区抗体 | 默克密理博 | 06-719 | 第 7.2 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | G21234 | 第 7.2 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 兔源过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）抗体，用于检测TAP标签蛋白 | Sigma Aldrich | P1291-500UL | 第 7.2 节 储存条件：-20℃保存 °C |
| 兔IgG抗体 | Sigma | I5006-100MG | 第2节 储存：4 ℃ 保存 °C |
| 引物（10 µM) | |||
| ARS316 fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT，rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | 第 7.1 节 | ||
| K071 Spike-in 质粒 DNA： fwd：5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT，rev 5'-CATTTTCGTCCTCCCAACAT | 第 7.1 节 | ||
| 以酵母基因组DNA为模板的PCR片段 用于 ARS316 扩增（用于 Southern 印迹）： 前向引物 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT 第5版’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | 第 7.1 节 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA，rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | 第 7.1 节 | ||
| 设备 | |||
| 咖啡研磨机 | Gastroback | 42601 | 第4节 |
| 杜瓦瓶 | NAL基因 | 4150-2000 | 第3节 |
| DynaMag™-2 磁力架 | Invitrogen | 12321D | 第4、5和6节 |
| 杂交炉 | Hybaid Mini10 | Ri418 | 第2节 |
| 微型离心机 | Eppendorf | 5424R | 第4节和第7.1节 |
| 紫外交联仪 | Analytikjena | 95-0174-02 | 第 7.1 节 |
参考文献
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods
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