单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

Atiqa Sajid; Stephan Hamperl

doi:10.3791/65460

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方法文章

单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

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DOI：

10.3791/65460

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2023年11月17日

Atiqa Sajid¹ , Stephan Hamperl¹

¹Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

本文内容

摘要

本方案介绍了一种基于位点特异性重组的基因座特异性染色质分离方法，用于从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中纯化处于天然染色质环境下的单拷贝目标基因座。

摘要

真核生物染色质的基本结构单位是核小体核心颗粒（NCP），其由DNA在组蛋白八聚体周围缠绕约1.7圈构成。染色质定义为核小体核心颗粒以及包括转录因子、染色质重塑和修饰酶在内的多种其他蛋白质复合物的总和。目前仍不清楚在细胞周期不同阶段，这些蛋白质-DNA相互作用如何在特定基因组位点水平上被精确调控。这主要是由于现有技术的局限性，使得对这类动态相互作用进行精确测量具有挑战性。本文描述了一种改进的方法，将位点特异性重组与高效的单步亲和纯化方案相结合，以分离处于天然染色质状态的单拷贝目标基因座。该方法可实现目标位点相对于全基因组染色质的显著富集，从而使该技术成为以无偏倚且系统的方式识别和定量蛋白质相互作用的有效策略，例如通过质谱分析。除了此类组成性分析之外，通过该方法纯化的天然染色质很可能真实反映了体内核小体定位和组蛋白修饰的情况，因此适用于对酵母中几乎任意基因组位点来源的染色质进行进一步的结构和生化分析。 在体内 关于核小体定位和组蛋白修饰的情况，因此适用于对酵母中几乎所有基因组位点来源的染色质进行进一步的结构和生化分析。

引言

真核生物基因组动态地组织成染色质，既将DNA压缩以适应细胞核的空间限制，又确保基因表达所需的动态性以及调控因子的可及性。这种多功能性部分由核小体介导，核小体是染色质的基本单位，包含一个核心颗粒，其中147 bp的DNA围绕组蛋白八聚体缠绕约1.7圈¹。核小体在组成上具有高度动态性，其N端和C端组蛋白尾部存在多种组蛋白变体及翻译后修饰（PTMs）。此外，真核生物染色质还与多种其他关键组分相互作用，如转录因子、DNA和RNA加工机器、结构蛋白、参与染色质重塑和修饰的酶类，以及与染色质结合的RNA分子。所有参与转录、复制和修复的关键分子机器都需要接触染色质，而染色质正是这些过程的天然底物。因此，要理解这些DNA相关活动背后的分子机制，就必须精确界定在这些分子机器聚集并推动生物学反应的特定基因组区域中染色质结构的整体变化。

尽管通过遗传学和蛋白质-蛋白质相互作用研究已鉴定出大量染色质因子，但在特定基因组位点上进行直接、无偏倚且全面的染色质相互作用分析仍是一个重大挑战²^,³。最初，只有基因组中丰度极高的区域（例如重复序列位点）或多拷贝质粒能够被分离出足够数量和纯度的样品，用于质谱鉴定其相关蛋白⁴^,⁵^,⁶^,⁷。近年来，一系列新方法开始揭示酵母和哺乳动物基因组中单拷贝位点的蛋白质组，这些方法包括：直接将捕获探针杂交至染色质化DNA、利用CRISPR-dCas9系统进行邻近生物素标记，或通过序列特异性衔接蛋白结合目标位点⁸^,⁹^,¹⁰。然而，所有这些方法均需使用甲醛交联以稳定蛋白质-DNA相互作用，并通过超声处理将染色质溶解，以便后续纯化。这两步操作共同排除了对所纯化染色质进行后续结构与功能研究的可能性。

为克服这些局限性，我们此前设计了一种方法，利用位点特异性重组从酵母中提取特定的染色体区域¹¹^,¹²本质上，感兴趣的基因组区域被位点特异性R-重组酶的识别位点（RS）所包围 Zygosaccharomyces rouxi 同时在相同区域插入一组三个DNA结合位点，用于原核转录阻遏蛋白LexA（LexA）。酵母细胞含有一个表达盒，可同时表达R-重组酶以及与串联亲和纯化（TAP）标签融合的LexA蛋白。在诱导R-重组酶表达后，该酶可高效地将染色体上的靶向区域以环状染色质结构域的形式切除。该结构域可被纯化通过 LexA-TAP 衔接蛋白，该蛋白可结合 LexA DNA 结合位点以及亲和支持介质。该方法 recently 已被用于分离包含酵母 III 号染色体特定复制起点的不同染色质区域¹³.

这种ex vivo方法的一个主要优势在于，它允许对分离得到的材料进行功能分析。例如，利用该方法纯化的复制起点区域可应用于in vitro复制实验，从而在试管中评估源自天然in vivo组装染色质模板的复制起点激活效率。最终，通过对分离材料进行生化和功能表征，可能实现利用纯化的蛋白质与天然染色质模板共同重建核内过程。总之，该方法为染色质研究开辟了令人振奋的新途径，使研究人员能够追踪特定基因组区域在发生某种染色体事件过程中所伴随的整体性染色质组成与结构变化。

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方案

有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。所用溶液、缓冲液和培养基的列表见表1。

1. 重组酵母菌株的构建

为构建具有重组能力的酵母菌株，将经 SbfI 酶切的质粒 K238 转化至一种酵母菌株中，该菌株在目标位点处已整合有 LexA 结合位点和 RS 重组位点¹³^,¹⁴。
注意：转化的 SbfI 限制性片段包含一个必需的表达盒，用于组成型表达 LexA-TAP 融合蛋白和 R-重组酶，同时含有酵母 1 号染色体的同源序列，可通过同源重组将该表达盒整合到基因组中（图 1）。
为构建对照菌株，选用一个遗传背景相同但未整合 RS 和 LexA 结合位点的酵母菌株，在与重组能力菌株相同的条件下，将其转化经 SbfI 酶切的 K238 质粒。
根据 SCD-LEU 琼脂平板上的 LEU2 筛选标记筛选转化成功的酵母细胞¹⁴。

2. 将IgG抗体偶联至环氧活化磁珠

注意：根据以下已发表的方案¹¹，将IgG抗体偶联到环氧活化磁珠上。

在50 mL锥形管中，将300 mg环氧活化磁珠悬浮于10 mL 50%丙酮中（300 mg约对应5.1 × 10¹⁰个磁珠），并在涡旋振荡器上剧烈振荡。
在4 °C条件下，以820 × g离心2 min，弃去上清液。
用20 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）洗涤磁珠3次，每次洗涤后均按照步骤2.2所述方法通过离心去除上清液。
将磁珠重悬于16 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中，在杂交炉中室温轻柔旋转孵育5 min。
将兔IgG（100 mg）溶解于7 mL dH₂O中（终浓度为14 mg/mL）。
在4 °C条件下，以13,000 × g离心10 min，澄清IgG悬浮液。
取3.5 mL上清液（相当于50 mg兔IgG），转移至新的50 mL锥形管中。
用9.85 mL 0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）稀释IgG溶液，然后在轻柔混匀条件下逐滴加入6.65 mL 3 M硫酸铵的0.1 M磷酸钠溶液（pH 7.4）。
注意：避免快速加入硫酸铵，局部高浓度盐会导致兔IgG沉淀。
在4 °C条件下，以820 × g离心3 min，将所得上清液加入磁珠悬浮液中。
在杂交炉中30 °C轻柔旋转孵育过夜或至少18 h。
按照步骤2.2所述方法去除上清液。
用20 mL 100 mM甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.5）洗涤磁珠，按照步骤2.2所述方法迅速去除溶液，以避免IgG多肽变性。
用20 mL 10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.8）洗涤磁珠一次，按照步骤2.2所述方法吸除上清液。
加入20 mL 0.1 M三乙胺溶液，在轻柔旋转条件下反应5–10 min，以灭活残余的环氧基团。按照步骤2.2所述方法去除上清液。
在轻柔旋转条件下，用20 mL PBS（pH 7.4）洗涤磁珠4次，每次5 min，每次洗涤后均按照步骤2.2所述方法去除上清液。
在杂交炉中轻柔旋转条件下，先用含0.5% Triton X-100（w/v）的PBS（pH 7.4）洗涤磁珠一次（5 min），再洗一次（15 min）。每次均按照步骤2.2所述方法去除上清液。
将磁珠重悬于终体积为16 mL的含0.02%叠氮化钠（w/v）的PBS（pH 7.4）中，分装为每份1 mL，4 °C保存备用。

3. 酵母细胞培养与收集

从YPD平板中接种对照和具有重组能力的酵母菌株至5 mL YPR培养基中，在30 °C、200 rpm条件下过夜培养。
将上述培养物2 mL接种到100 mL YPR培养基中，在30 °C、200 rpm条件下过夜培养。
对于每种菌株，将1,800 mL已灭菌的YP培养基和200 mL已灭菌的棉子糖溶液（20% w/v）分别加入两个5 L锥形瓶中（每种菌株共4 L培养基，分装于两个锥形瓶中）。
将生长中的酵母细胞以OD₆₀₀为0.2的浓度接种至相应的培养基中，并按照步骤3.1所述条件培养约6小时，或直至细胞达到目标OD₆₀₀值1.0。为确保细胞正常生长且无污染，每隔2小时检测一次OD值。
加入200 mL半乳糖（20% w/v）以诱导位点特异性重组。
同时加入YMFA 110 µL（终浓度50 ng/mL）（与步骤3.5中加入半乳糖同时进行），使细胞停滞在G1期，并继续培养2小时。
注意：是否向细胞中添加YMFA取决于具体的实验条件和所研究的生物学问题。本实验中，通过将细胞阻滞在G1期，可以获得具有已授权复制起点的同质细胞群体；在此过程中，前复制复合物在G1期结合到复制起点，为S期DNA复制的启动做准备。
将细胞悬液转移至1 L离心桶中，在4 °C、6,000 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10–15 mL去离子水（dH₂O）中。
用鲁尔塞密封一支25 mL注射器，并将其放入装有水的50 mL离心管中。将细胞悬液转移至该注射器组件中，在室温下以2,397 × g离心10分钟。弃去上清液。
取下注射器上的鲁尔塞，将细胞挤出至液氮中，形成细胞“意大利面”状细丝。
注意：使用4 L培养基可获得最终细胞沉淀湿重7–10 g。
将冷冻的细胞“意大利面”转移至50 mL离心管中，并于−80 °C保存，待后续使用。

4. 染色质位点纯化

注意：有关该位点特异性染色质纯化方案中各步骤的示意图，请参见图2。

通过剧烈摇晃商用咖啡研磨机两次，每次30秒，研磨30-50 g干冰来冷却研磨机。冷却完成后，弃去干冰粉末。
将3 g冷冻的酵母细胞“意大利面状物”与约30-50 g干冰混合，放入预冷的咖啡研磨机中。
用封口膜密封研磨机盖子与机体之间的连接处，以防止研磨过程中酵母细胞粉末损失。
对酵母细胞与干冰的混合物进行10次研磨，每次30秒，每次间隔30秒（总时间预计约10分钟）。为避免干冰和细胞粉末粘附在咖啡研磨机内壁上，研磨过程中需持续轻敲研磨机外壁。
使用洁净干燥的刮勺将所得的酵母细胞-干冰粉末转移至塑料烧杯中。
将烧杯置于室温下，使干冰完全挥发。
待干冰完全挥发后，向酵母细胞粉末中加入2.25 mL MB缓冲液（含1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂，用量为每克酵母细胞750 µL）。
剧烈吹打细胞-缓冲液混合物，确保细胞完全悬浮于缓冲液中，随后转移至15 mL锥形管中。
从所得细胞悬液（粗细胞提取物 [CCE]）中取样用于DNA（0.1%）和蛋白质（0.05%）分析。样品储存于−20 °C，待后续处理（见第7节）。
将细胞悬液转移至低吸附性2 mL反应管中，在4 °C条件下以21,130 × g离心30分钟，以分离细胞碎片与粗细胞裂解液。
将所有管中的上清液合并至一个15 mL锥形管中。
从合并后的上清液中取样（输入样品 [IN]）用于DNA（0.1%）和蛋白质（0.05%）分析。样品储存于−20 °C，待后续处理（见第7节）。
将500 µL IgG偶联磁珠悬液（每种酵母菌株对应一份）用含1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液在4 °C、20 rpm旋转条件下洗涤两次，每次500 µL、5分钟，进行平衡。每次洗涤后使用磁力架弃去上清液。
将IgG偶联磁珠在500 µL含1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液中，于4 °C、20 rpm旋转孵育1小时。孵育结束后使用磁力架弃去上清液。
将平衡后的磁珠悬液与细胞裂解液混合，在4 °C、20 rpm旋转条件下孵育2小时。
将完整的磁珠-细胞裂解液悬浮液转移至低吸附性反应管中。
使用磁力架将已结合目标染色质环的磁珠从细胞裂解液中分离出来。
将每管中的剩余流穿液（FT）转移至新的15 mL锥形管中，并取样用于DNA（0.1%）和蛋白质（0.05%）分析。样品储存于−20 °C，待后续处理（见第7节）。
将每管中的磁珠用300 µL不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液重悬，并合并至同一反应管中。在4 °C、20 rpm旋转条件下，用750 µL含1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液洗涤5次，每次10分钟。最后一次洗涤使用750 µL不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液。
将磁珠重悬于40 µL不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷MB缓冲液中。
注意：洗脱液体积可根据预期的下游应用进行调整。TEV洗脱通常在100–300 µL范围内效率较高。

5. TEV 蛋白酶介导的洗脱

为将LexA-CBP染色质环复合物从磁珠上释放，将磁珠与2 µL 6x His标签重组TEV蛋白酶在4 °C、450 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育过夜。
使用磁力架将磁珠与最终洗脱液分离。将含有切割后染色质环的洗脱液转移至新的1.5 mL离心管中。
再次将离心管置于磁力架上，以分离最终洗脱液中残留的磁珠。
将磁珠（TB）重悬于750 µL预冷的AC缓冲液中，并取样用于DNA（0.1%）和蛋白质（0.05%）分析。样品于−20 °C保存，待后续处理（见第7节）。
从最终洗脱液（TE）中取样用于DNA（0.5%）和蛋白质（0.25%）分析。样品于−20 °C保存，待后续处理（见第7节）。
注意：由于最终洗脱液体积较小，为在分析过程中更准确地反映其蛋白质和DNA含量，所取用于DNA和蛋白质分析的样品比例有所增加。

6. 变性洗脱

将珠子用 750 µL 冷 AC 缓冲液在 4 °C、20 rpm 条件下旋转洗涤 2 次，每次 20 分钟。
为提取剩余结合的 LexA-染色质复合物，向珠子中加入 500 µL 0.5 M NH₄OH 进行变性洗脱，并在室温下孵育 30 分钟。
使用磁力架将珠子从悬浮液中分离，并将洗脱液转移至低吸附反应管中。
再次按照步骤 6.2 的条件孵育珠子，以最大限度回收洗脱液中的染色质位点。
使用磁力架将珠子从悬浮液中分离，并将所得洗脱液合并至与步骤 6.3 相同的管中。
将珠子（DB）重悬于 750 µL dH₂O 中，并取样用于 DNA（0.1%）和蛋白质（0.05%）分析。
从最终洗脱液（DE）中取样用于 DNA（0.5%）和蛋白质（0.25%）分析。

7. DNA 和蛋白质分析

DNA分析
1. 样品制备
  1. 向DNA样品中加入 100 µL 加入IRN缓冲液，并用dH₂O定容至相应体积₂O至最终体积 200 µL.
  2. 加入1 ng的K071 spike-in质粒DNA。
  3. 添加 1 µL RNase A（10 mg/mL）处理，并在指定条件下孵育 37 °C 1小时。
  4. 添加 5 µL 蛋白酶K（10 mg/mL）和 10 µL 20% 的 SDS，37°C 下孵育 1 小时 56 °C.
  5. 添加 200 µL 加入苯酚/氯仿/异丙醇（25:24:1），充分涡旋振荡，每次10秒，共2次。
  6. 将样品在 21,130 × g 离心 × g 7分钟，以分离有机相和水相。
  7. 将上清液转移至含有新 1.5 mL 离心管中 1.5 µL 5 mg/mL 糖原和 2.5 倍体积 100% 乙醇。
  8. 将试管在 −20 °C 至少2小时，最长过夜，以沉淀DNA。
  9. 在 21,130 离心 × g, 4 °C 孵育45分钟。弃去上清液。
  10. 添加 150 µL 用70%乙醇洗涤DNA沉淀，切勿重悬，再次于21,130 × g离心 × g 在 4 °C 10 分钟。
  11. 将DNA沉淀在室温下干燥10–15分钟，然后重悬于 40 µL 的 dH₂O.
  12. 使用HpaI限制性内切酶对步骤7.1.1.11中分离得到的DNA进行限制性酶切消化，使其线性化。对于一个 50 µL 反应体系，孵育 40 µL DNA 提取物 + 2 µL HpaI 酶 + 5 µL 限制性内切酶缓冲液 + 3 µL 的 dH₂过夜孵育于 37 °C.
2. qPCR分析
  1. 将经限制性酶切的DNA按1:5的比例稀释（10 µL 步骤 7.1.1.12 获得的经限制性酶切消化的 DNA 40 µL 的 dH₂O)
  2. 使用针对 ARS316 区域、PDC1 和 spike-in 质粒 DNA 设计的引物对。
  3. 使用指定程序运行 qPCR 表 2.
  4. 使用ARS316区域和加标质粒DNA作为目标，PDC1（或任何其他基因或基因组区域）作为参考位点，通过相对定量分析qPCR结果。
  5. 通过将 ARS316 和 PDC1 引物的相对定量值根据各样品所取流分体积的百分比进行归一化，评估 ARS316 位点相对于 PDC1 的回收率百分比。例如，对于流穿组分的 0.1%，乘以 1,000 倍校正因子；对于 TEV 洗脱组分的 0.5%，乘以 200 倍校正因子。
  6. 使用内参质粒DNA的相对定量值对ARS316和PDC1的回收率百分比进行归一化处理。
  7. 通过使用公式（评估获得的相对定量目标/参照值，分析ARS316位点在总染色质中的富集程度1).
    (1)
3. Southern印迹分析
  1. 至 20 µL 限制性内切酶消化的DNA样品，加入 5 µL 上样缓冲液
  2. 在1%琼脂糖凝胶中以110 V电压电泳约3小时。
  3. 将凝胶转移至托盘中，加入变性溶液，在轻微振荡条件下浸泡20分钟。
  4. 用去离子水冲洗凝胶₂O，并在变性溶液中振荡浸泡15分钟。弃去变性溶液。
  5. 将凝胶置于变性溶液中，在温和振荡条件下浸泡15分钟。
  6. 用去离子水冲洗凝胶₂O，并用转移缓冲液轻轻洗涤2次，每次15分钟振荡。
  7. 用1-1.5 L转移缓冲液填满一个托盘，并将其置于稳定的平台上。
  8. 剪取一段较长的Whatman滤纸，将其放置在平台上，使滤纸的两端浸入转移缓冲液中。
  9. 裁剪一条与凝胶大小相同的正电尼龙膜和四条Whatman滤纸。
  10. 将两张用转移缓冲液浸湿的Whatman滤纸放在平台上。
  11. 将凝胶底面朝上放置在Whatman滤纸片上。
  12. 在凝胶上方放置正极尼龙膜，随后放上用转移缓冲液浸泡过的剩余两张Whatman滤纸。确保用转移缓冲液保持整个层析结构湿润。
  13. 使用玻璃棒滚动去除困住的气泡。
  14. 在组装好的堆叠物上方放置一叠纸巾，然后放上一个0.5 kg的物体（例如玻璃瓶）。
  15. 室温下过夜孵育以完成转膜。
  16. 转膜后，使用总能量输出为 1,200 J/cm 的紫外线交联仪对膜进行交联处理².
  17. 对于 ARS316 位点的检测，使用参考的 DNA 标记系统合成的放射性探针进行 Southern 印迹杂交。
    注意：除非另有说明，后续所有步骤均需在冰上进行。
  18. 在低吸附反应管中，将25-40 ng PCR片段（探针）稀释于 19 µL 的 dH₂O，并在指定条件下孵育 95 °C 5 分钟。立即在冰上冷却。
  19. 添加 1 µL 每一个 500 µM dCTP 500 µM dGTP，以及 500 µM 将 dTTP 加入离心管中。
  20. 添加 20 µL 试剂盒中提供的含有随机六核苷酸的缓冲液。
  21. 添加 5 µL 放射性标记的核苷酸[α-³²将P标记的dATP加入管中。所有涉及放射性标记材料的操作均须在符合放射性安全标准的防护环境下进行。
  22. 添加 1 µL Klenow片段，并在 37 °C 在恒温混匀仪中孵育15分钟，以合成单链DNA。
  23. 添加 5 µL 加入终止缓冲液以终止反应。
  24. 离心尺寸排阻柱2分钟，转速为1,500 × g 去除储存缓冲液。弃去流出液，并将柱子放入新的离心管中。
  25. 将探针混合物通过层析柱，以去除未掺入的放射性核苷酸。在1,500 × g下离心30秒。 × g 收集探针。
  26. 添加 150 µL 鲑鱼精子DNA（1:100）以阻断探针与膜的非特异性结合。
  27. 将探针混合物孵育于 95 °C 5分钟以变性双链DNA。
  28. 在冰上速冻数秒，然后在500 ×g下离心数秒 × g 使凝结在盖子上的水滴落下。
  29. 用杂交缓冲液在旋转摇床上短暂清洗Southern印迹膜5-10分钟。
  30. 用杂交缓冲液在1 h内预杂交膜 55 °C 旋转后弃去杂交缓冲液。
  31. 加入15 mL新鲜杂交缓冲液（预先在 55 °C)与制备好的探针一同加入膜上，4℃孵育过夜 55 °C 旋转。
  32. 用0.3x SSC、0.1% SDS溶液进行杂交后漂洗，每次15分钟，共2次 55 °C 旋转。
  33. 用0.1x SSC、0.1% SDS溶液进行杂交后漂洗，每次15分钟，共2次 55 °C 旋转。
  34. 用0.1x SSC、1.5% SDS溶液进行杂交后漂洗，每次15分钟，共2次 55 °C 旋转。
  35. 从杂交管中取出膜，并将膜暴露于磷屏成像仪屏幕最多3天，以获得膜上的放射性印记。
  36. 使用磷屏成像激光扫描系统获取薄膜的图像。
蛋白质分析
1. 样品制备
  1. 将所有蛋白质样品调整至最终体积（200 µL, 100 µL, 100 µL, 20 µL，以及 20 µL 分别向粗制细胞提取物、上样样品、穿流组分、珠子和洗脱组分样品中加入 1 µL 的 β-巯基乙醇，PAGE LDS 样品缓冲液（1x），和 dH₂O₂O.
  2. 变性样品于 95 °C 5 分钟。
2. Western印迹分析
  注意：采用标准方案进行SDS-PAGE和蛋白质印迹实验¹⁵^,¹⁶.
  1. 加载 15 µL 将每个样品加入到一块1.5 mm SDS-PAGE凝胶的每个孔中。
  2. 使用 PAP（1:2,000）和 LexA（1:1,000）抗体对印迹进行免疫染色，4 °C 过夜孵育 4 °C用5%脱脂奶粉/PBST溶液稀释。
    注意：PAP 分析后，可使用温和的洗脱程序对印迹膜进行洗脱¹⁷ 在使用第二种 LexA 抗体进行免疫染色之前。

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结果

约1.4 kb的ARS316染色质区域的纯化由组成型表达的LexA-TAP衔接蛋白介导。作为阴性对照，我们使用了一种同源菌株进行纯化实验，该菌株表达LexA-TAP，但不含有整合的RS序列和LexA结合位点。图3展示了在对照菌株和具有重组能力、靶向ARS316位点的菌株上进行的标准纯化实验的DNA分析结果。在提取DNA并用限制性内切酶消化以线性化环状DNA分子后，通过qPCR分析评估ARS316靶位点相对于无关基因组对照位点PDC1的纯化效率。

此外，还对ARS316位点在总染色质中的富集程度进行了定量分析（图3A，B）。阴性对照菌株在除粗细胞提取物、上样样品和穿流组分以外的任何组分中均未检测到ARS316或PDC1位点的回收，表明在TEV酶切洗脱和变性洗脱组分中均未观察到特异性富集。相反，在重组菌株中，ARS316位点在穿流组分中几乎完全耗尽，并可在TEV酶切洗脱及变性洗脱后从磁珠中回收。TEV酶切洗脱后，磁珠上仍保留较高比例的...

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讨论

鉴定特定基因组靶区域的相关因子及其染色质景观仍是染色质研究中的一个主要挑战¹⁸。本方案描述了一种高效系统，可特异性地切除并纯化来自酵母染色体的特定染色质区域。据我们所知，这种单步纯化方法在纯度和得率方面克服了现有基因座特异性染色质纯化技术的诸多局限，从而能够实现靶向基因座相对于其他非相关基因组区域的高度富集。

由于使用了位点特异性R重组酶的额外切除步骤，另一个优点是，可以根据基因组中重组位点的精确位置，准确确定被纯化的基因组区域。相比之下，其他方法依赖于超声波对DNA的剪切，从而产生长度不均一的分子片段；这种异质性使得这些方法在纯化明确定义的目标基因座方面精确度较低。

最后，该纯化策略采用天然条件，不使用甲醛等化学交联剂，因此通过此方法获得的分离产物适用于结构与功能分析。纯化方案中的一个关键步骤是TEV蛋白酶切洗脱的效率，其强烈依赖于多个参数，包括TEV蛋白酶的活性、反应条件和反应体积。在所示实验中，洗脱体积被设定为最小值，这影响了洗脱效率。然而，增加洗脱体积和TEV蛋白酶用量可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

S.H. 实验室的工作得到了德国研究基金会（DFG）通过SFB1064（项目编号213249687）、欧洲研究理事会（ERC起始资助852798 ConflictResolution）以及亥姆霍兹学会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
酵母菌株
对照菌株： MATa；ura3Δ0；leu2Δ0；his3Δ1；met15Δ0；bar1::kanMX4；Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			第1节，参见参考文献13和14
重组菌株： MATa；ura3Δ0；leu2Δ0；his3Δ1；met15Δ0；bar1::kanMX4；RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS；Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			第1节，参见参考文献13和14
质粒
K238 质粒			第1节，参见参考文献13 储存条件：-20℃保存 °C
K071 Spike-in 质粒 DNA			第7.1节，参见参考文献13 储存：于 -20 ℃ 保存 °C
试剂
丙酮	卡尔·罗斯	5025.1	第2节储存条件：室温保存
乙酸铵（NH₄OAc）₄乙酰化)	Sigma Aldrich	A7262	第6节和第7.1节储存条件：室温保存
氨溶液（NH₄OH）₄OH) 25%	默克密理博	533003	第6节储存条件：室温保存
硫酸铵	Santa Cruz	Sc-29085	第2节储存条件：室温保存
Bacto 琼脂	BD（VWR）	90000-760	第3节储存条件：室温保存
胰蛋白胨	BD（VWR）	211820	第3节储存条件：室温保存
β-巯基乙醇	Sigma Aldrich	07604	第 7.2 节储存：4 ℃ 保存 °C
化学发光底物试剂盒	ThermoFisher	34580	第 7.2 节储存：4 ℃ 保存 °C
十二水合磷酸氢二钠	默克	1.06579.1000	第2节和第7.1节储存条件：室温保存
二硫苏糖醇 (DTT)	ThermoFisher	15508013	第4节储存：4 ℃ 保存 °C
乙醇	默克	100983	第 7.1 节储存条件：室温保存
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	ED	第 7.1 节储存条件：室温保存
半乳糖（20% (w/v) 储液）	Sigma Aldrich	G0625-1KG / 5KG	第3节储存条件：室温保存
上样缓冲液（6x）	BioLabs	B7024A	第 7.1 节储存：于 -20 ℃ 保存 °C
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	部分储存条件：室温保存
甘氨酸	卡尔·罗斯	.0079.4	第2节储存条件：室温保存
糖原（5 mg/mL）	Invitrogen	AM9510	第 7.1 节储存条件：-20℃保存 °C
盐酸（HCl）	PanReac AppliChem	182109.1211	第2、4和7.1节储存条件：室温保存
乙酸镁（MgAc）	Bernd Kraft	15274.2600/C035	第4节储存条件：室温保存
氯化镁（MgCl₂)	Sigma Aldrich	M8266	第6节储存条件：室温保存
Nu PAGE LDS 样品缓冲液 (4x)	Invitrogen	2399549	第 7.2 节储存条件：室温保存
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 v/v）	Invitrogen	15593-031	第 7.1 节储存：4 ℃ 保存 °C
氯化钾（KCl）	Sigma	P9541	第4节储存条件：室温保存
放射性标记的 α-32P dATP（3,000 Ci/mmol，10 mCi/mL）	Hartmann Analytic	SRP-203	第 7.1 节储存：4 ℃ 保存 °C
RadPrime标记系统	ThermoFisher	18428-011	第 7.1 节储存条件：-20℃保存 °C
棉子糖（20% (w/v) 储存液）	SERVA	34140.03	第3节储存条件：室温保存
氯化钠（NaCl）	默克	K53710504142	第 7.1 节储存条件：室温保存
柠檬酸钠（Na3C6H5O7）	Sigma-Aldrich	71402	第 7.1 节储存条件：室温保存
氢氧化钠（NaOH）	Sigma Aldrich	S5881	第 7.1 节储存条件：室温保存
十二烷基硫酸钠（SDS）（5% 储液（w/v））	Alfa Aesar	A11183	第 7.1 节储存条件：室温保存
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	71496	第2节和第7.1节储存条件：室温保存
钠叠氮化物	Santa Cruz 生物技术	sc-208393	第2节储存条件：-20℃保存 °C
三乙胺	Sigma Aldrich	90340	第2节储存条件：室温保存
Tris 碱	Chem Cruz	SC-3715B	第2节和第4节储存条件：室温保存
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	第2节和第4节储存条件：室温保存
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	第4节储存条件：室温保存
酵母提取物	BD（VWR）	212720	第3节储存条件：室温保存
酵母交配因子 alpha (1 µg/mL 储液	生物分子	Y2016.5	第3节储存条件：-20℃保存 °C
酵母合成型完全培养基补充剂（不含亮氨酸）	Sigma Aldrich	Y1376	第1节，参见参考文献14
酶
HpaI 限制性内切酶（5,000 U/mL）	NEB	R0105S	第 7.1 节储存：于 -20 ℃ 保存 °C
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	78446	第4节储存：在4℃保存 °C
蛋白酶K（10 mg/mL）	SERVA	33756	第 7.1 节储存条件：-20℃保存 °C
RNase A（10 mg/mL）	ThermoFisher	EN0531	第 7.1 节储存：于 -20 ℃ 保存 °C
TEV 蛋白酶（10000 U/µL)	NEB	P8112S	第5节储存条件：-20℃保存 °C
材料
BcMag 环氧活化磁珠	Bioclone Inc.	FC-102	第2节储存：4 ℃ 保存 °C
干冰			第4节
低吸附离心管 2.0 mL	Eppendorf	22431102	第4节
Microspin G-25 柱	Cytiva	27-5325-01	第 7.1 节储存条件：室温保存
Parafilm	默克	P7793	第4节
正电尼龙膜	Biozol	11MEMP0001	第 7.1 节储存条件：室温保存
PVDF 转膜膜	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	第 7.2 节储存条件：室温保存
SDS-PAGE 凝胶 4-12% bis-tris（15 孔，1.5 mm）	Invitrogen	NP0336BOX	第 7.2 节储存：4 ℃ 保存 °C
注射器（25 mL，带鲁尔接头）	Henke Sass Wolf	4200-000V0	第3节
Whatman 滤纸（Grade 3MM CHR 纤维素 Western 印迹膜片）	Cytiva	3030-917	第 7.1 节储存条件：室温保存
抗体
抗LexA，兔多克隆IgG，DNA结合区抗体	默克密理博	06-719	第 7.2 节储存条件：-20℃保存 °C
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）	Invitrogen	G21234	第 7.2 节储存条件：-20℃保存 °C
兔源过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）抗体，用于检测TAP标签蛋白	Sigma Aldrich	P1291-500UL	第 7.2 节储存条件：-20℃保存 °C
兔IgG抗体	Sigma	I5006-100MG	第2节储存：4 ℃ 保存 °C
引物（10 µM)
ARS316 fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT，rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			第 7.1 节
K071 Spike-in 质粒 DNA： fwd：5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT，rev 5'-CATTTTCGTCCTCCCAACAT			第 7.1 节
以酵母基因组DNA为模板的PCR片段用于 ARS316 扩增（用于 Southern 印迹）：前向引物 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT 第5版’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			第 7.1 节
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA，rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			第 7.1 节
设备
咖啡研磨机	Gastroback	42601	第4节
杜瓦瓶	NAL基因	4150-2000	第3节
DynaMag™-2 磁力架	Invitrogen	12321D	第4、5和6节
杂交炉	Hybaid Mini10	Ri418	第2节
微型离心机	Eppendorf	5424R	第4节和第7.1节
紫外交联仪	Analytikjena	95-0174-02	第 7.1 节

参考文献

Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).
Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674(2015).
Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).
Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111(2017).
Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).
Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).
Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

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单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

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