成像平台“寿命机器”（The Lifespan Machine）可实现对大规模群体的终生自动化观察。我们展示了进行寿命、应激抵抗、致病性以及行为衰老检测所需的操作步骤。该系统所获得数据的质量和广度使研究人员能够在存在生物和环境变异的情况下，深入研究衰老干预措施。
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摘要
摘要
在恒定环境中饲养的遗传背景相同的动物仍表现出显著差异的寿命分布，反映出衰老过程存在一个在所有被研究生物中保守的、巨大的非遗传性随机成分。这一随机性意味着，为了理解衰老机制并确定能够延长寿命或改善健康的有效干预措施，研究人员必须同时监测大量实验动物群体。传统的手动死亡评分方法限制了大规模假设检验所需的通量和规模，从而推动了高通量寿命测定自动化技术的发展。寿命机器（Lifespan Machine, LSM）是一种高通量成像平台，它将改良的平板扫描仪与定制的图像处理及数据验证软件相结合，实现对线虫整个生命周期的持续追踪。该平台是一项重大的技术进步，能够在前所未有的规模上，从大量动物群体中获取高时间分辨率的寿命数据，其统计精确度和准确性与经验丰富的研究人员进行的手动测定相当。最近，LSM 进一步发展为可量化衰老过程中出现的行为和形态变化，并将其与寿命相关联。本文中，我们描述了如何使用 LSM 规划、运行和分析自动化寿命实验。我们还强调了成功采集行为数据和高质量生存曲线所需的关键步骤。
引言
衰老是一个复杂且多方面的过程，其特征是生物体生理功能的衰退，从而导致随着时间推移疾病风险和死亡概率增加1。寿命通常被定义为从出生或成年期开始到死亡的时间，是衰老的一个明确结局指标2，也是衡量不同群体间相对衰老速率的一种间接但严格量化的代理指标3。衰老研究通常依赖于对寿命的精确测量，类似于临床试验，通过比较接受干预的群体与未接受干预的对照群体之间的结局来进行评估。然而，目前衰老研究普遍存在可重复性问题，有时是由于统计效力不足的实验设计4，而更多情况下则是因为寿命测定本身对环境中的细微变化具有高度敏感性5。可靠的实验需要对大规模群体进行多次重复，而这一过程尤其受益于自动化所提供的实验可扩展性6。
寿命测定实验的严格要求源于衰老过程本身的不可预测性。在相同环境中饲养的同基因型个体表现出不同的死亡时间和生理衰退速率7，这表明寿命具有高度的随机性7,8。因此，需要使用大样本群体来定量测量衰老过程中的变化，例如平均寿命或最大寿命的变化，并克服个体差异带来的偏差。此外，高通量寿命测定能力对于研究生存曲线的形态以及衰老动态模型至关重要9。
线虫 Caenorhabditis elegans 是衰老研究中不可或缺的模式生物，因其寿命短、遗传背景清晰且世代周期快，非常适合开展高通量的衰老与寿命测定实验。传统上，C. elegans 的寿命测定方法是通过在固体培养基上同步培养约50–100条线虫的小群体，随时间推移记录每条个体的死亡时间。随着线虫衰老并逐渐丧失运动能力，人工判定死亡时间需要逐条用工具轻触线虫并观察其头部或尾部是否仍有微小活动。这一过程通常十分繁琐且耗费人力，尽管已有研究尝试对其进行加速10,11,12。重要的是，实验流程的缓慢会阻碍人们对衰老机制的理解以及对干预措施有效性的评估进展。
为了满足衰老研究对定量数据的需求，已开发出多种技术以实现数据采集的自动化，包括从微流控腔室到平板扫描仪在内的多种方法，这些技术在文献中已有广泛报道13,14,15,16,17,18。LSM 与其他方法的不同之处在于其对高精度和高准确度寿命数据采集的全面优化，这一目标通过精心设计的设备校准流程以及一套功能完善的软件系统得以实现，该软件系统允许用户验证、修正并优化自动化分析结果13。尽管该软件在理论上可应用于多种成像方式，但在实际应用中，大多数用户采用经过改装的平板扫描仪，以实现对环境温度和湿度的精细调控——这两个因素对寿命具有显著影响，因此至关重要19。LSM 会以每20分钟一次的频率对线虫进行成像，持续时间可从数天至数月不等，具体取决于环境条件和基因型。相比人工检测所获得的数据，LSM 产生的数据具有更高的时间分辨率，所采集的图像还提供了线虫在整个生命周期中位置变化的永久可视化记录。通过机器学习方法，系统可自动判定每个个体的死亡时间。这些结果可通过名为 "Worm Browser" 的客户端软件快速进行人工验证。得益于其硬件与软件的协同设计，LSM 生成的生存曲线在统计学上与经验丰富的研究人员手动评分的结果无显著差异，同时具备工作量更小、可扩展性更高的优势13。
LSM 的最新版本还可通过在整个线虫生命周期中收集形态学和行为学数据，并将其与每个个体的寿命一并报告，从而实现对行为衰老的研究。特别是，LSM 能够记录每只动物剧烈运动停止（VMC）的时间，这一标志常被用来量化个体的"健康寿命"，以区别于其寿命。通过同时收集寿命和行为衰老数据，LSM 支持研究那些可能对衰老的不同表型结果产生差异性影响的干预措施20。多种肉眼可观察的表型可用于研究行为衰老，例如身体运动或咽部泵动21、组织完整性22，以及运动速度或刺激诱导的转向行为17。不同衰老表型之间的比较有助于分析衰老过程的因果结构。例如，最近通过对 VMC 与寿命的比较，揭示了 C. elegans 中两种不同的衰老过程23。
尽管最初是为测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命而开发，LSM 技术也支持从多种线虫物种中收集生存和行为数据，包括C. briggsae、C. tropicalis、C. japonica、C. brenneri和P. pacificus23。该技术有助于研究生物和环境干预对寿命、抗应激能力及抗病原体能力的影响，并可与靶向 RNA 干扰检测或生长素诱导的蛋白质降解系统等实验工具联用。迄今为止，该技术已在科学文献中被广泛应用于多种研究场景6,24,25,26,27,28,29,30。
本文概述了使用琼脂平板进行寿命机器（Lifespan Machine）实验的逐步操作流程，从实验初始设置到最终生成生存曲线的全过程。LSM 的一个显著特点是工作量主要集中于前期，即研究人员的大部分时间花费在实验设置阶段，以及在较小程度上用于图像采集后的处理。整个实验过程中，数据收集完全自动化，使研究人员能够实现 “免手动干预”""的操作体验。此处描述的步骤适用于多种不同类型的生存实验——寿命、热耐受性、氧化应激以及致病性实验均采用相同的实验设置。在代表性结果部分，我们讨论了近期发表的一篇论文中的部分数据，以说明分析流程的有效性，并重点阐述图像分析过程中的关键步骤23。
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方案
1. 软件和硬件要求
- 平板扫描仪：原则上，寿命成像系统（LSM）可使用多种成像设备实现。有关扫描仪改装和聚焦的详细说明可参见其他文献13。LSM硬件装置如补充图1所示。
- 数据分析工具：LSM软件包含三个相互关联的组件：基于Linux的扫描仪控制软件包、基于网页浏览器的元数据管理软件包，以及适用于Windows和Linux的客户端图像分析软件包。有关安装这些软件工具的说明，请参阅GitHub代码仓库中发布的指南（https://github.com/nstroustrup/lifespan）。
- 数据可视化与验证软件：使用Worm Browser（一种客户端程序）来安排实验、验证图像分析结果、对线虫运动进行手动标注，并输出生存数据。Worm Browser为Windows 7、Windows 8和Windows 10提供了二进制可执行文件，也可在Linux或Apple iOS系统上从源代码编译运行。上述GitHub代码仓库中提供了安装指南。
补充图1：寿命成像仪硬件。 一台平板扫描仪，其盖子打开以显示已加载的培养板，这些培养板倒置放置在橡胶垫上切割出的16个孔中。橡胶垫放置在玻璃扫描仪表面。培养板的条件标签书写在板的侧面，以避免图像分析时出现问题。带有编号（“1”）和/或设备名称（“Jabba”）的标记胶带有助于在使用多个扫描仪设备时后续核对样本位置。有关LSM硬件组件的更多细节见其他文献13。请点击此处下载该文件。
2. 实验当天前的准备工作
- 培养箱温度校准：C. elegans 寿命的主要决定因素之一是环境温度19。为了获得准确的结果，应在经过精确校准且在整个实验过程中保持恒定的温度下进行图像采集。为此，在实验开始前数天，测量并校准每台扫描仪在运行期间表面的温度。使用高精度热电偶，具体方法见其他文献31（参见材料表）。
- 扫描仪培养板布局：在实验开始前，规划每台扫描仪上培养板的最佳布局。
注意：此步骤的目的是避免因扫描仪之间以及每台扫描仪表面不同位置之间的温度差异而引入混杂因素。不同扫描仪的平均表面温度存在细微差异，且每台扫描仪表面也存在轻微的温度偏差31。- 扫描仪培养板位置：为在后续数据分析中控制这些热效应，应将生物学协变量关于扫描仪位置进行随机化处理，并在所有扫描仪之间标准化培养板的位置。
- 跨扫描仪的样本数量：使用16孔橡胶垫布局时（参见材料表），每台扫描仪中每个条件放置四块培养板，总共至少使用四台扫描仪。这可确保每个实验条件分布在多个扫描仪上，从而使数据处理过程中能够识别并消除扫描仪温度带来的混杂效应13。为使该分析更简便，建议在每台扫描仪上设置一个共用的参照条件（例如野生型样本）。
注意：通常由于扫描仪风扇的布局，橡胶垫右上角的培养板更容易发生干燥。如有需要，可将该位置留空。
- 培养板与样本制备
- 培养板制备：为使扫描用培养板（参见材料表）达到最佳干燥效果，应在接种线虫前4天倒入琼脂培养基。尽管扫描仪的焦距可调节以适应不同体积的琼脂，但标准培养板的琼脂体积为8 mL。
注意：对于大规模实验，使用蠕动泵倒板可能更为方便。 - 接种培养板：至少在实验开始前2天将所需细菌接种至培养板，以确保细菌菌膜充分干燥和生长。通常，200 µL细菌培养液足以形成可支持40条线虫数周摄食的菌膜。
注意：用于成像的培养板通常比标准的培养皿密封更严密；因此建议在生物安全柜内进行接种和干燥，通常约需1小时或直至完全干燥。
- 培养板制备：为使扫描用培养板（参见材料表）达到最佳干燥效果，应在接种线虫前4天倒入琼脂培养基。尽管扫描仪的焦距可调节以适应不同体积的琼脂，但标准培养板的琼脂体积为8 mL。
- 线虫操作
- 种群数量：单个培养板上可稳定成像的线虫数量取决于基因型、接种时线虫的年龄以及每板添加的食物量。对于从早期成虫阶段开始的寿命实验，每板接种约40条线虫。该数量可保证充足的食物供应并避免过度拥挤。
- 大规模种群培养：为进行种群扩增和同步化，应根据所选的同步化方法准备适当数量的线虫种群（见下文）。目标是在动物产卵量最高的年龄阶段进行同步化处理，对于野生型N2线虫，此阶段为成虫第2天32。
注意：选择成虫第2天的个体进行种群同步化的另一个原因是消除母体年龄对种群异质性的贡献。研究表明，C. elegans 的母体年龄会影响后代的多种适合度性状，其中成虫第2天的野生型个体产生的后代质量最高33。 - 年龄同步化操作：为获得准确结果，应尽可能精确地同步动物的年龄。本方案采用改良的次氯酸盐处理法进行年龄同步化34。其他方法包括通过产卵、L1幼虫滞育或手动挑选L4幼虫进行同步化。
注意：采用次氯酸盐处理进行年龄同步化时，预计每条成年雌雄同体可获得3至4个卵。 - 维持无后代种群：在L4晚期阶段使用5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）处理线虫，以维持无后代种群35。
注意：低剂量FuDR对发育中的胚胎具有致死作用，但不会在生殖系中引起肉眼可见的变化，也不会改变卵细胞的生成速率。其他方法包括使用温度敏感型不育突变体、使用导致不育的RNAi构建体，或简单地等待至生殖后期衰老阶段再将线虫转移至成像用培养板。 - 种群转移：在大量线虫（数千条）转移过程中，使用铂/铱丝的传统方法较为繁琐。采用线虫液体悬浮法可简化转移过程并提高效率。使用M9 + Mg缓冲液（Na2HPO4 42.27 mM，KH2PO4 22.05 mM，NaCl 85.56 mM，MgSO4 1 mM）收集线虫，在线虫依靠重力沉降后减少总体积，然后迅速将线虫转移至用于成像的培养板。
注意：采用液体悬浮法转移线虫可能导致每板接种数量出现差异。应尽量保持每板线虫数量一致，以避免实验变异性。 - 施加干预措施：在实验过程中暂停和重启图像采集会增加图像分析的复杂性（见讨论部分）。因此，应在完成所有必要的线虫操作后，再开始LSM实验。
- 橡胶垫灭菌：将多个橡胶垫分别用铝箔包裹后，同时进行高压灭菌。
注意：为避免真菌或细菌污染物积累，橡胶垫在每次使用之间应进行灭菌。大多数常用类型的橡胶会被高浓度乙醇处理降解。
3. 实验当天的准备工作
- 培养皿支撑架与扫描仪玻璃的准备：为简化培养皿的操作，不要将培养皿直接放置在扫描仪表面，而应使用由玻璃板支撑的橡胶垫固定培养皿（参见材料表）。通过该玻璃板对样品进行成像，因此需保持玻璃清洁，并涂有防雾、疏水和消毒涂层（参见材料表）。
- 在将培养皿放入培养箱之前，使用防雾玻璃清洁剂清洁培养皿支撑玻璃的两面。
- 在将培养皿放置到支撑玻璃上之前，需在玻璃表面施加一层保护性疏水玻璃处理剂（参见材料表），以减少与橡胶垫接触一侧的玻璃表面起雾。均匀涂抹该处理剂，并在进行下一步操作前静置5–10分钟。涂抹后需用力擦拭，以彻底清除残留物。
- 使用70%乙醇对将与橡胶垫接触的玻璃表面进行消毒。静置1至2分钟，然后用布或纸巾擦除。
- 将培养皿装载至扫描仪
- 首先，将经过高压灭菌的橡胶垫放置在已处理的培养皿支撑玻璃上方。
- 取用于成像且已接种线虫的培养皿，打开皿盖，将其放置在橡胶垫上，使培养皿底部朝向玻璃表面。确保橡胶垫紧密密封所有培养皿，例如可在上方再覆盖一块玻璃板并确保其平整，或轻敲每个培养皿顶部进行检查（松动的培养皿会轻微移动并撞击玻璃，发出声响；而固定牢固的培养皿在轻敲时不会移动）。
注意：建议使用标记胶带为每块培养皿支撑玻璃单独标注，注明培养皿内容物及计划使用的扫描仪信息。该数据可在实验结束后用于解决有关培养皿位置的任何潜在疑问。 - 在将培养皿装入扫描仪之前，先拔掉扫描仪风扇电源，以保护操作人员手指安全。
- 轻轻将培养皿及其支撑玻璃板滑动至扫描仪表面。
注意：避免直接对橡胶垫施加压力，否则会导致垫子在支撑玻璃上滑动。当垫子滑动时，培养皿常会从垫子上脱落。 - 重新启动扫描仪风扇，并目视确认前部和侧面风扇已通电运行。若扫描仪此前处于关闭状态，此时应将其开启。
4. 采集图像前的准备
注意：图中展示了在图像采集过程中所有基于软件操作步骤的综合流程图 图1.
图1：Lifespan Machine图像分析流程的图示概览。 图像采集前、采集中和采集后的步骤主要在网页界面（WI，红色）和Worm Browser（WB，绿色）上完成。部分步骤在其他平台（O，蓝色）上进行，例如步骤3a中的TXT文档、步骤4b中的Photoshop或等效软件，以及步骤13中的JMP或等效软件。请点击此处查看该图的放大版本。
- 图像采集设置：生成一个文件，用于指定实验时间表以及各扫描仪上培养板的位置，以配置图像采集。
注意：该文件包含重要元数据，例如实验标题、图像采集频率以及实验总时长。通常情况下，该文件不会自动生成 从头合成 每次实验并不重新创建文件，而是重复使用之前实验的实验文件作为模板。对于用户的首次实验，将提供一个模板文件（补充文件 1).- 请求预览捕获：提供每台扫描仪上所有培养板的位置。为加快此过程，提供了多种工具。首先，使用扫描仪获取整个扫描表面的图像，称为“预览捕获”。确保预览捕获图像清晰显示每个待成像培养板的整个表面图2A无条纹或平板边缘裁剪。
- 使用网页界面，查找 图像采集 主页面的“部分”，并点击名为 捕获设备与图像服务器. 在该页面上，点击标有 寻找新设备 （即扫描仪）在 图像采集与处理服务器 盒子。通过点击来监控服务器检测扫描仪的进度 [log] 链接位于服务器旁边。
注意：执行此步骤前，请确保所需的扫描仪已接通电源并连接至服务器。 - 在同一网页的Web界面中，确保连接到服务器的每台扫描仪均出现在 图像采集设备 盒子。“当前状态”下的“缺失”标签在设备成功被检测到后将不再显示。选中每个已加载新培养皿的扫描仪对应的复选框。
- 在底部的 图像采集设备 切片，点击 申请预览捕获 按钮。1 分钟或 2 分钟内，扫描仪应亮起并开始扫描。
注意：通常需要调整玻璃支撑板的初始位置，以使所有培养板均处于可视范围内。可通过检查预览扫描图像，并对培养板位置进行调整后重新获取预览图像，以校正位置。如果扫描速度极慢（单次扫描耗时数分钟）或预览图像中出现长条状白色条纹，则表明有培养板、橡胶垫或其他物体遮挡了扫描仪校准区域（扫描仪表面以白色箭头标示）。应重新调整所有物体位置，确保仅有玻璃支撑板位于该区域内。
- 使用网页界面，查找 图像采集 主页面的“部分”，并点击名为 捕获设备与图像服务器. 在该页面上，点击标有 寻找新设备 （即扫描仪）在 图像采集与处理服务器 盒子。通过点击来监控服务器检测扫描仪的进度 [log] 链接位于服务器旁边。
- 定义扫描区域：在 Worm Browser 中按照以下步骤操作，以分析预览捕获图像，并将其拼接为一幅完整的复合图像，用于在数据分析中指定每块孔板的位置。确保最终图像与以下示例相似 图2B.
- 首先，使用 Worm Browser，通过选择菜单选项打开每个预览捕获图像 文件 > 打开图像，并选择所需的图像。
- 在每张图像上，单击以选择有板的区域所在的列（如果橡胶垫有 16 个板位，则选择 4 列）。
注意：扫描区域应设置为高而窄的列状区域（而非宽而短的行状区域），因为扫描仪对较宽区域的捕获速度较慢，可能导致线虫移动而产生模糊图像。 - 定义所有图像后，通过选择菜单项将区域规格导出到磁盘 图像采集 > 定义扫描区域 > 将选定的扫描区域保存到磁盘 并选择所需的位置。
- 生成实验时间表：
- 遵循以下格式 补充文件 1，整理一个文件，其中包含实验名称、各列在扫描仪上的物理位置（从步骤 4.1.2.3 生成的扫描区域文件中复制）、实验总时长以及图像采集频率，并将该文件同时保存为 TXT 和 XML 格式。
- 然后，在 Worm Browser 中，点击 图像采集 > 提交实验计划安排，选择生成的 XML 文件。Worm Browser 将询问是否输出时间表摘要或运行实验。点击 生成摘要文件.
- 验证摘要文件：提交实验计划后，Worm Browser 将输出该计划的摘要。此摘要会显示在屏幕上并写入磁盘。请仔细阅读并核对计划中捕获图像的日期，以及扫描仪的位置、名称和数量。
- 提交实验时间表：当对摘要文件满意后，通过选择菜单选项，将实验时间表的 XML 文件再次加载到 Worm Browser 中 图像采集 > 提交实验计划表. 蛔虫浏览器将再次提示是输出时间表摘要还是运行实验。此次请点击 运行! .
注意：实验提交后几分钟内，建议使用网页界面确认实验已成功提交，并且所有扫描仪均正在进行数据采集。在大型实验中，最初几次扫描遗漏是常见现象。 - 在网页界面中组织实验：繁忙的扫描仪集群可产生由众多不同用户采集的数百个实验数据集。为便于管理此列表，可将实验分配至不同的组，例如根据负责该实验的用户姓名进行分组。
- 创建新组或修改现有组：通过单击网页界面中的选项来创建新组 管理实验分组 在名为的框下方 图像采集. 在将出现的新页面上，添加所需的名称 创建新组 并点击 创建要修改现有组的名称，请在同一对话框中，选择目标组旁边的选项 修改现有组，然后选择 修改.
- 将实验分配至组别：若要将新实验分配至特定组别，请进入网页界面，找到目标实验，默认情况下该实验将被分配至 无分组 实验列表底部的组。点击实验部分右侧的链接，其中显示 编辑，然后使用下拉列表选择要使用的组的名称。接着，选择 保存.
- 取消实验：
注意：激光扫描显微镜（LSM）将继续自主运行，直至实验计划中指定的最终扫描完成。实验计划结束后，LSM 默认将继续采集扫描图像，但会立即丢弃图像数据，此过程称为 自动扫描这些自动扫描用于防止扫描仪关闭和冷却，以维持标准的温度分布，从而确保在同一空间内运行的其他实验（即使来自不同的实验项目）不会因其他扫描仪的关闭而受到影响。- 停止自动扫描：要在网页界面上停止正在进行的实验中的自动扫描，请点击 编辑 在所需实验旁边，然后 取消待处理的扫描，并选择 取消预定的采集.
- 请求预览捕获：提供每台扫描仪上所有培养板的位置。为加快此过程，提供了多种工具。首先，使用扫描仪获取整个扫描表面的图像，称为“预览捕获”。确保预览捕获图像清晰显示每个待成像培养板的整个表面图2A无条纹或平板边缘裁剪。
图2预览捕获图像与扫描区域选择 (A) 针对实验中的每台扫描仪，均生成一幅预览捕获图像. (B一次选择一行培养板（红色框），可提高扫描速度，并避免因扫描区域过宽而导致的线虫运动模糊。 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. 图像采集
注意：以下步骤可在实验运行期间或实验结束后进行。
- 输出实验的掩膜文件：扫描仪获取的原始图像数据包含许多无需处理的区域（如平板以外的区域）。为了单独聚焦于每个平板的分析，需创建一个“掩膜”，用于指定每个扫描仪图像上各平板所占据的区域。通过在扫描仪采集的图像上绘制每个平板的位置作为叠加层，生成该掩膜。
- 在 Worm Browser 中，通过选择 文件 > 选择当前实验，然后点击实验名称，来选定目标实验。
- 再次在 Worm Browser 中，选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 生成实验掩膜合成图，并将掩膜保存至指定位置。确保生成的文件与 图 3A 相似。
图3使用样品掩膜确定每台扫描仪的板位位置。 为确保对所示列选择中各孔板进行独立分析 图1，必须通过生成图像掩膜复合体来识别各个孔板。A使用图像处理软件打开扫描仪的扫描图像（注意在扫描区域上方标注的扫描仪名称“han”，以及代表各列的“a-d”）。B) 生成用于标记掩模复合图像中每块板位置的掩模时，各步骤均需将背景设置为黑色，(C) 通过背景的扩张随后收缩，去除锯齿状边缘以及未选定孔板的边缘，以及（D) 选择前景区域并用白色像素完全填充该区域. (E为使LSM识别扫描行中的各个孔板，每行中的每个白色区域均填充不同深浅的灰色，通常按亮度递增。F）在此阶段，保存掩膜图像（若在Photoshop中生成，则采用LZW压缩且不包含图层）。随后，Worm Browser对掩膜进行扫描，并由软件生成掩膜的可视化图像。正确的掩膜可视化应显示每块板上有一个定义明确的方块，方块中心带有一个小十字，且每一行颜色不同。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 标注实验的掩膜：使用图像处理程序（如 Photoshop 或 GIMP）打开上一步生成的文件，以标记图像中每块孔板的位置。以下简要介绍使用 Photoshop 进行掩膜编辑的全部步骤。
- 在 Photoshop 中，选择 填充 将容差设为零，选择“连续的”，取消选择“消除锯齿”。单击灰色背景，将其完全设置为黑色。确保生成的图像与以下内容相似 图3B.
- 使用魔棒工具选择黑色背景，取消抗锯齿，容差设为0，并选择连续区域。为平滑边缘，单击以将选中的背景区域扩展30像素 选择 > 修改 > 扩增。然后，将选区向内收缩 20 像素 选择 > 修改 > 合同确保最终图像与之相似 图3C.
- 用黑色像素完全填充平滑后的背景，例如通过设置 填充 将工具容差设为255并填充选定区域。然后，单击 选择 > 逆 反向选择，选中前景区域。使用白色像素完全填充新选中的区域，例如，将填充工具的容差设置为255，并用白色填充该区域。确保最终图像与 图3D.
- 为了分离单个区域内的每块板，使用亮度逐渐增加的不同灰度填充每一行。可通过填充工具选择所需颜色，并将容差设置为0来实现。确保最终图像与以下示例相似 图3E以 LZW 压缩格式保存，且不指定“图层”。
注意：平板的排序由指定区域的颜色决定。若要将平板 1-4 按从上到下的顺序命名，请为每一行指定亮度递增的颜色。 - 在 Worm Browser 中选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 分析实验掩膜复合图像上绘制的孔板位置，选择上一步生成的文件。软件现在将用几分钟时间分析提交的掩膜。
- 线虫浏览器将显示一个掩膜可视化图像。请检查该掩膜文件中是否存在潜在错误。确保每行培养板均被不同颜色填充，并由彩色矩形框标出轮廓。确保最终图像与下图相似 图3F.
注意：如果单个平板上显示两个或更多圆圈，或两个圆圈颜色相同，请返回步骤 5.2 修正掩膜文件，并重新将其加载到 Worm Browser 中。 - 在确认掩膜可视化结果正确后，在 Worm Browser 中选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 将分析后的实验掩模复合图像提交至集群图像分析服务器现在将分析实验中所有培养板的位置。
- 应用掩膜：激光扫描显微镜（LSM）使用掩膜将原始图像数据分割为单独的孔板。要启动此过程，请通过网页界面安排掩膜应用任务。
- 提交任务前，请确认所有扫描仪均已识别出掩膜中的区域。转至网页界面的主页面，找到实验名称及名为 图像分析，然后点击 运行分析. 确认所有设备均处于 实验样本 已确定区域。
- 应用掩膜时，在同一界面中单击 所有样本的新任务名为的盒子上 为单张图像安排任务，选择该复选框 应用掩膜，然后 保存职位.
注意：该掩膜将应用于所有已采集的图像，以及未来采集的任何图像。
- 进行平板质量控制：
注意：在此阶段的图像分析中，受污染、干燥或起雾的平板将被剔除。受污染、干燥、起雾及最佳状态平板的示例如下所示： 图4其他需要剔除的原因包括饥饿、空培养皿或无菌种群中的幼虫。无效的培养皿中常含有复杂形状，仪器可能会将其误识别为线虫。在此步骤中排除无效培养皿非常重要，以避免在后续图像分析步骤中造成过长的处理时间。- 使用网页界面，通过查找目标实验和名为 标注培养板信息 并选择 按图像.
- 要检查培养皿，请点击 显示图像.
注意：如果显示图像的步骤无法正常工作，可能是 Linux 服务器未正确配置。相关配置说明可在上述 GitHub 仓库中的软件安装指南中找到。 - 要排除某些孔板，请勾选复选框标记 审查，从名为下拉框中选择一个选项 审查原因，然后点击 保存 每页
- 添加元数据信息：元数据用于描述实验中每块板的内容。该信息将被包含在后续生成的所有统计数据分析文件中。
- 要添加与品系、基因型、温度、食物等相关的元数据信息，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及名为 标注培养皿信息，并选择 按位置.
- 输入标签，并通过点击选择要保存元数据的扫描仪 保存至设备 在左下角。
- 要在不同扫描仪之间重复使用元数据而无需重新输入所有标签，请前往 从设备加载 在右上角，选择要从中重用元数据的扫描仪，然后单击 从设备加载.
- 指定“零龄时间：默认情况下，LSM 以 UNIX 纪元的起始时刻为基准测量时间。这种方式通常不便于使用，因此需要指定一个参考时间（例如，所有个体孵化或达到成年的时间点）。
- 为指定零年龄时间信息，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及名为 图像分析，然后选择 运行分析.
- 在出现的新页面上，选择 所有地区的全新职位. 在名为 更新区域信息，选择 动物年龄为0的时间点，添加信息，然后点击 更新所选字段.
注意：如果所有动物的零龄时间不一致，则应选择其他方法 特定动物类型的新用途，并对每组重复上述步骤。
- 安排线虫检测：激光扫描显微镜（LSM）可根据线虫在培养皿上的位置自动检测每条线虫。
- 要开始对每张图像中的线虫进行自动化检测，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及名为 图像分析，并选择 运行分析.
- 在新出现的页面上，点击 所有地区的全新职位，然后在名为 为单张图像安排任务，然后选中复选框 中值滤波器 > 阈值 > 线虫检测 > 保存职位这些任务将应用于所有已拍摄和未来拍摄的图像。
注意：若要仅为特定菌株或条件安排任务，请点击 特定动物类型的工作岗位使用存储为文件的SVM模型执行对象分类 模型 LSM 长期存储目录的子文件夹。LSM 的 V2.0 线虫检测参数集可从 GitHub 仓库下载。
图 4：利用网页界面进行平板质量控制。 在进行线虫运动分析之前，通过网页界面剔除不符合要求的平板，对于加快图像处理流程至关重要。需要剔除的平板示例包括存在（A）干燥、（B）污染或（C）起雾等情况的平板，而（D）则为符合标准、可用于后续分析的优质平板。预览图像上叠加了10 mm的比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。
6. 图像采集后处理
注意：完成线虫检测后，必须将实验中收集的所有数据随时间进行整合，以追踪每只个体的整个生命周期并确定所有个体的死亡时间。需等待实验中所有动物均已死亡，且所有线虫检测任务均已完成，然后执行以下步骤：
- 安排运动分析：
- 运动分析会随时间整合所有实验数据，以估算死亡时间。要启动此项任务，请进入网页界面的主页面，在名为 图像分析 的列中找到目标实验，然后点击链接 运行分析。
- 在新出现的页面上，点击链接 为所有区域创建新任务，然后在下拉菜单 为整个区域安排任务 中选择 分析线虫运动，并点击按钮 保存任务。
- LSM 图像采集服务器将自动开始对所有培养板进行运动分析。
注意：运动分析是计算量最大的单一任务。在现代多核处理器上，对一个持续一个月寿命实验的每块培养板进行分析可能需要 20 分钟或更长时间。
- 生成故事板：运动分析完成后，LSM 故事板允许用户手动验证自动化结果，确保软件对线虫形态和行为的判断正确。
- 在网页界面的主页面上，找到目标实验及 图像分析 列，点击 运行分析。在新出现的页面上，点击 新建实验任务。然后在 为整个区域安排任务 部分选择 生成动物故事板，并点击 保存任务。
- LSM 完成故事板生成后，进入 Worm Browser 并选择目标实验。返回主菜单，选择 验证 > 浏览整个实验 > 每条线虫死亡后立即查看。
- 在 Worm Browser 上标注故事板：Worm Browser 上的典型故事板应如 图 5 所示。
- 标注“非线虫”对象
注意：运动检测过程中识别出的每个对象都会按估计死亡时间顺序显示在故事板上。除非用户另行指定，否则每个对象都将被纳入最终的生存曲线中。LSM 的对象分类被有意校准为较高的假阳性率，以此作为减少漏检线虫数量的权衡策略。排除非线虫对象对于获得高质量的生存曲线至关重要（参见代表性结果）。通常在故事板的第一页和最后一页会发现大量非线虫对象，这些对象可快速批量手动排除。- 要从故事板中排除非线虫对象，请在其图像上单击右键一次。被排除的对象将由白色方框标出。若要同时排除多个对象，可按住控制键，然后在任一对象上单击右键一次，即可排除该故事板页面上的所有对象。
- 排除对象后，可通过再次双击右键将其重新纳入分析。
- 保存故事板标注时，请点击 保存 按钮。建议在标注过程中频繁保存进度。
- 标注死亡时间：
注意：在无用户干预的情况下，LSM 能够准确估算大多数群体的死亡时间。但建议通过手动验证每个实验中随机选取的个体子集，常规性地确认自动化结果的准确性。应特别关注寿命最短和最长的个体，因为自动化分析中的误差往往集中在这两类个体中。- 在故事板上任一对象上单击左键一次，将打开一个新窗口，显示该对象的详细时间序列信息。此窗口允许查看实验期间采集的所有该对象图像，以及对其运动动态和形态的量化结果。使用相同界面可手动标注死亡时间。死亡时间标注界面如 图 6 所示。
- 要手动标注死亡时间，请在底部时间轴上对应死亡时间的位置单击左键。可使用空格键及键盘上的左右箭头键浏览时间帧，或直接在时间轴上点击目标时间点。
注意：该可视化图示以类似水平条形图的形式展示动物随时间的运动状态，横轴表示时间。粉红色/紫色部分表示对象剧烈运动的时间段，黄色表示微弱运动，红色表示无运动状态，绿色表示与死亡相关的身体膨胀期。线虫表现出特征性的与死亡相关的形态学事件：通常在死亡前出现逐渐的身体收缩，随后在死亡时或死亡后立即发生快速的身体膨胀（图 6B）。非线虫对象（如灰尘或阴影）不会表现出这种体型变化动态，而是通常随时间呈现线性、渐进的尺寸和强度变化。这些不同的体型动态变化为快速分类和手动排除提供了简便方法。 - 根据分析方法的不同，死亡时间可定义为运动停止的时间（运动可视化图中红色条的起点），或定义为与死亡相关的膨胀时间（运动可视化图中的绿色条）。要手动标注收缩和膨胀事件，请在底部时间轴的目标时间点单击右键。
- Worm Browser 客户端内嵌提供了一些基本的死亡率数据可视化功能。每个故事板中存在的群体均会显示其生存曲线和死亡时间诊断图（图 7）。请查看故事板左侧的生存曲线，以及右侧将每个个体剧烈运动停止时间（VMC）与死亡时间进行比较的散点图。
注意：可通过在底部时间轴上对特定品系、扫描仪或培养板等条件进行子集划分，按不同实验参数对这些结果进行分组。可通过在 VMC 与死亡时间散点图中单击左键选择特定个体。
- 标注“非线虫”对象
- 将死亡率数据写入磁盘：LSM 以 CSV 文件形式生成死亡率数据。可将输出的生存曲线导入 R、SAS、STATA 或 JMP 等任意统计软件中进行绘图和分析。
- 要生成这些文件，请在 Worm Browser 中选择实验，在菜单中选择 数据文件，死亡时间，然后点击 为当前实验生成死亡时间。LSM 将生成包含该实验生存数据的输出文件，并保存至结果目录。
- 如果已在故事板上进行了手动标注，Worm Browser 将弹出提示，询问如何处理手动标注。点击“立即”以将手动标注包含在输出的死亡时间文件中。
注意：死亡率数据文件将写入 imageserver.ini 文件中指定的结果目录。会生成多种文件，但最常用的是 "survival_simple/survival=machine_hand" 版本，该文件包含使用故事板进行的所有手动标注。 - 使用所选的统计软件分析死亡率数据。
图5动物在蠕虫浏览器中的故事板。 (A所有静止的线虫均按机器标注的死亡时间的先后顺序显示。要浏览故事板，请按下（B）右下角，以及（C) 经常保存注释。D背景非灰色的图像显示了两次线虫死亡事件（早期死亡为绿色，较晚死亡为红色），这些事件可能发生在两条线虫彼此靠近死亡时，也可能发生在死亡的线虫被路过的线虫移动后被再次检测为死亡的情况下. (E) 图像右下角的红色标签用于标识已检测到死亡时间的线虫；F绿色标签表示物体未保持静止足够长时间，因而无法记录死亡时间. (G同一画面中的多条虫可通过按住 Shift 键并单击鼠标左键进行标记。H通过右键单击排除非线虫物体的分析。(I爆裂的蠕虫通过点击相应图像（手动注释窗口将打开），然后按住 Shift 键并右键单击，直到出现“animal exploded”消息，从而从分析中排除. 在 Worm Browser 窗口的截图上叠加了 0.5 mm 的比例尺和标签。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：在 Worm Browser 中检查对象并标注死亡时间。 在 Worm Browser 故事板上的任意对象上单击左键，将打开一个新界面，允许用户查看该对象的运动动态。在右侧，(A) 显示的是运动评分，用于量化对象的运动情况；该评分通过连续观察帧之间像素强度的变化来估算。此外，在右侧还显示了(B) 总对象强度的变化，用于量化对象大小的变化。在左侧，上方的条形显示的是(C) 机器估算的死亡时间，而下方的条形为(D) 人工手动标注的死亡时间。单击条形图上的任意点并按下空格键，用户即可浏览线虫成像的时间帧序列。在这些条形图中，粉红色表示剧烈运动的时间段，红色表示死亡时间段，黄色表示介于两者之间的状态。死亡时间之后伸展与收缩所持续的时间以绿色显示。图中标注叠加在 Worm Browser 窗口的截图上。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：Worm Browser 上的群体汇总统计。 针对扫描仪设备“obiwan”的群体统计数据，左侧面板显示生存曲线，右侧面板显示剧烈运动停止时间（VMC）与死亡时间的散点图。图中展示的是（A）一个条件下的数据，来源于（B）一台扫描仪，该数据通过首先选择（C）按品系分组的生存数据获得。（D）散点图中的方形标记表示人工标注的事件，而（E）圆形标记表示机器自动标注的事件。（F）对于早期发生的死亡事件，或（G）剧烈运动停止时间与死亡时间重合的事件，通常需要人工标注。标签叠加在 Worm Browser 窗口的截图上。请点击此处查看此图的放大版本。
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结果
寿命测定实验的可重复性具有挑战性，需要严格控制实验条件并使用大量样本群体，以获得足够的统计分辨率4,36。寿命监测系统（LSM）特别适用于在恒定环境中以高时间分辨率对大量动物群体进行监测。为了展示LSM的能力、突出分析中的关键步骤，并帮助研究人员合理分配工作精力，我们展示了一项已发表的最优实验中的部分数据23。由于本实验为剂量-反应测定，需使用大量动物才能可靠地检测寿命变化。若采用人工操作，该实验将需要多名研究人员投入大量时间；若缩小规模，则会导致统计效能不足。该数据集测量了去除信使RNA转录所必需的RNA聚合酶II（b）亚基基因（RPB-2）后寿命的定量变化。利用在C. elegans中建立的生长素诱导降解系统37，将RPB-2的内源位点标记上降解决定子（degron）序列，从而可在不同浓度生长素（α-萘乙酸）存在下实现RPB-2的条件性泛素化与降解。实验使用菌株AMP100 [r...
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讨论
本文提供了一个使用最新版寿命机器（Lifespan Machine）进行实验的详细且易于操作的实验方案。我们已证明，获得分辨清晰的生存曲线的关键步骤是在图像采集后的手动排除非线虫物体。手动标注死亡时间对生存曲线的整体形态影响较小，表明即使不进行人工标注，全自动死亡时间估计也具有较高效率（图8）。相反，若要获取高质量的行为衰老数据，则需要更精确地标注死亡时间，尤其是在长寿个体中（图9）。因此，手动分镜标注所需的时间最终取决于所测量的具体指标。总体而言，我们发现使用LSM时，研究人员的主要精力应集中于实验设计阶段，其次为图像采集后的分析阶段。最后，我们强调高通量、自动化检测在生成高分辨率的生存数据和行为衰老数据方面的价值，同时可提高研究人员的工作效率，并支持实验的可重复性。
LSM 将线虫培养在琼脂平板上，在自动化环境中重现了传统的手工寿命测定方法。已有其他工具被开发用于通过不同的线虫限制方法，实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命测定的自动化...
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我们感谢 Julian Ceron 和 Jeremy Vicencio（IDIBELL 巴塞罗那）构建了 rpb-2(cer135) 等位基因。本项目由欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号 No. 852201）、西班牙经济、工业与竞争力部（MEIC）对 EMBL 合作关系的资助、塞韦罗·奥乔亚卓越中心（CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033）、CERCA 计划/加泰罗尼亚自治区政府、MEIC 卓越奖 BFU2017-88615-P 以及 Glenn 医学研究基金会的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-萘乙酸 生长素（吲哚乙酸） | Sigma | N0640 | 将生长素溶于1 M氢氧化钾中，然后加入熔化的琼脂 |
| 5-氟-2-脱氧尿苷（FUDR） | Sigma | F0503 | 27.5 μ使用 g/mL 浓度的氟脱氧尿苷（FUDR）以消除在紫外线灭活细菌种群上的子代 |
| 玻璃清洁剂 | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
| 疏水性防雾玻璃处理 | Rain-X 玻璃清洁剂 | C. 059140 | |
| 橡胶垫 | 当地工匠 | 在高强度三元乙丙橡胶板材上进行切割 | |
| 扫描仪玻璃 | 本地五金供应商 | 9" ×11.5" 英寸玻璃板 | |
| 扫描仪平板 | 生命科学 | 351006 | 50 mm × 9 mm，聚苯乙烯培养皿 |
| USB参考温度计 | USB Brando | ULIFE055500 | 用于校准扫描仪的温度 |
参考文献
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