使用寿命机进行高通量行为衰老与寿命分析

摘要

成像平台“寿命机器”（The Lifespan Machine）可实现对大规模群体的终生自动化观察。我们展示了进行寿命、应激抵抗、致病性以及行为衰老检测所需的操作步骤。该系统所获得数据的质量和广度使研究人员能够在存在生物和环境变异的情况下，深入研究衰老干预措施。

摘要

在恒定环境中饲养的遗传背景相同的动物仍表现出显著差异的寿命分布，反映出衰老过程存在一个在所有被研究生物中保守的、巨大的非遗传性随机成分。这一随机性意味着，为了理解衰老机制并确定能够延长寿命或改善健康的有效干预措施，研究人员必须同时监测大量实验动物群体。传统的手动死亡评分方法限制了大规模假设检验所需的通量和规模，从而推动了高通量寿命测定自动化技术的发展。寿命机器（Lifespan Machine, LSM）是一种高通量成像平台，它将改良的平板扫描仪与定制的图像处理及数据验证软件相结合，实现对线虫整个生命周期的持续追踪。该平台是一项重大的技术进步，能够在前所未有的规模上，从大量动物群体中获取高时间分辨率的寿命数据，其统计精确度和准确性与经验丰富的研究人员进行的手动测定相当。最近，LSM 进一步发展为可量化衰老过程中出现的行为和形态变化，并将其与寿命相关联。本文中，我们描述了如何使用 LSM 规划、运行和分析自动化寿命实验。我们还强调了成功采集行为数据和高质量生存曲线所需的关键步骤。

引言

衰老是一个复杂且多方面的过程，其特征是生物体生理功能的衰退，从而导致随着时间推移疾病风险和死亡概率增加¹。寿命通常被定义为从出生或成年期开始到死亡的时间，是衰老的一个明确结局指标²，也是衡量不同群体间相对衰老速率的一种间接但严格量化的代理指标³。衰老研究通常依赖于对寿命的精确测量，类似于临床试验，通过比较接受干预的群体与未接受干预的对照群体之间的结局来进行评估。然而，目前衰老研究普遍存在可重复性问题，有时是由于统计效力不足的实验设计⁴，而更多情况下则是因为寿命测定本身对环境中的细微变化具有高度敏感性⁵。可靠的实验需要对大规模群体进行多次重复，而这一过程尤其受益于自动化所提供的实验可扩展性⁶。

寿命测定实验的严格要求源于衰老过程本身的不可预测性。在相同环境中饲养的同基因型个体表现出不同的死亡时间和生理衰退速率⁷，这表明寿命具有高度的随机性^7,8。因此，需要使用大样本群体来定量测量衰老过程中的变化，例如平均寿命或最大寿命的变化，并克服个体差异带来的偏差。此外，高通量寿命测定能力对于研究生存曲线的形态以及衰老动态模型至关重要⁹。

线虫 Caenorhabditis elegans 是衰老研究中不可或缺的模式生物，因其寿命短、遗传背景清晰且世代周期快，非常适合开展高通量的衰老与寿命测定实验。传统上，C. elegans 的寿命测定方法是通过在固体培养基上同步培养约50–100条线虫的小群体，随时间推移记录每条个体的死亡时间。随着线虫衰老并逐渐丧失运动能力，人工判定死亡时间需要逐条用工具轻触线虫并观察其头部或尾部是否仍有微小活动。这一过程通常十分繁琐且耗费人力，尽管已有研究尝试对其进行加速^10,11,12。重要的是，实验流程的缓慢会阻碍人们对衰老机制的理解以及对干预措施有效性的评估进展。

为了满足衰老研究对定量数据的需求，已开发出多种技术以实现数据采集的自动化，包括从微流控腔室到平板扫描仪在内的多种方法，这些技术在文献中已有广泛报道^{13,14,15,16,17,18}。LSM 与其他方法的不同之处在于其对高精度和高准确度寿命数据采集的全面优化，这一目标通过精心设计的设备校准流程以及一套功能完善的软件系统得以实现，该软件系统允许用户验证、修正并优化自动化分析结果¹³。尽管该软件在理论上可应用于多种成像方式，但在实际应用中，大多数用户采用经过改装的平板扫描仪，以实现对环境温度和湿度的精细调控——这两个因素对寿命具有显著影响，因此至关重要¹⁹。LSM 会以每20分钟一次的频率对线虫进行成像，持续时间可从数天至数月不等，具体取决于环境条件和基因型。相比人工检测所获得的数据，LSM 产生的数据具有更高的时间分辨率，所采集的图像还提供了线虫在整个生命周期中位置变化的永久可视化记录。通过机器学习方法，系统可自动判定每个个体的死亡时间。这些结果可通过名为 "Worm Browser" 的客户端软件快速进行人工验证。得益于其硬件与软件的协同设计，LSM 生成的生存曲线在统计学上与经验丰富的研究人员手动评分的结果无显著差异，同时具备工作量更小、可扩展性更高的优势¹³。

LSM 的最新版本还可通过在整个线虫生命周期中收集形态学和行为学数据，并将其与每个个体的寿命一并报告，从而实现对行为衰老的研究。特别是，LSM 能够记录每只动物剧烈运动停止（VMC）的时间，这一标志常被用来量化个体的"健康寿命"，以区别于其寿命。通过同时收集寿命和行为衰老数据，LSM 支持研究那些可能对衰老的不同表型结果产生差异性影响的干预措施²⁰。多种肉眼可观察的表型可用于研究行为衰老，例如身体运动或咽部泵动²¹、组织完整性²²，以及运动速度或刺激诱导的转向行为¹⁷。不同衰老表型之间的比较有助于分析衰老过程的因果结构。例如，最近通过对 VMC 与寿命的比较，揭示了 C. elegans 中两种不同的衰老过程²³。

尽管最初是为测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命而开发，LSM 技术也支持从多种线虫物种中收集生存和行为数据，包括C. briggsae、C. tropicalis、C. japonica、C. brenneri和P. pacificus²³。该技术有助于研究生物和环境干预对寿命、抗应激能力及抗病原体能力的影响，并可与靶向 RNA 干扰检测或生长素诱导的蛋白质降解系统等实验工具联用。迄今为止，该技术已在科学文献中被广泛应用于多种研究场景^{6,24,25,26,27,28,29,30}。

本文概述了使用琼脂平板进行寿命机器（Lifespan Machine）实验的逐步操作流程，从实验初始设置到最终生成生存曲线的全过程。LSM 的一个显著特点是工作量主要集中于前期，即研究人员的大部分时间花费在实验设置阶段，以及在较小程度上用于图像采集后的处理。整个实验过程中，数据收集完全自动化，使研究人员能够实现 “免手动干预”""的操作体验。此处描述的步骤适用于多种不同类型的生存实验——寿命、热耐受性、氧化应激以及致病性实验均采用相同的实验设置。在代表性结果部分，我们讨论了近期发表的一篇论文中的部分数据，以说明分析流程的有效性，并重点阐述图像分析过程中的关键步骤²³。

方案

1. 软件和硬件要求

1. 平板扫描仪：原则上，寿命成像系统（LSM）可使用多种成像设备实现。有关扫描仪改装和聚焦的详细操作说明可参见其他文献¹³。LSM 硬件结构如补充图1所示。
2. 数据分析工具：LSM 软件包含三个相互关联的组件：基于 Linux 的扫描仪控制软件包、基于网页浏览器的元数据管理软件包，以及适用于 Windows 和 Linux 平台的客户端图像分析软件包。有关安装这些软件工具的说明，请参阅 GitHub 代码仓库中发布的指南（https://github.com/nstroustrup/lifespan）。
3. 数据可视化与验证软件：使用 Worm Browser（一种客户端程序）来安排实验、验证图像分析结果、对线虫运动进行手动标注，并输出生存数据。Worm Browser 提供适用于 Windows 7、Windows 8 和 Windows 10 的二进制可执行文件，也可在 Linux 或 Apple iOS 系统上通过源代码编译运行。上述 GitHub 代码仓库中提供了安装指南。

补充图1：寿命成像仪硬件。 一台平板扫描仪，其盖子打开以显示已加载的培养板，这些培养板倒置放置在橡胶垫上切割出的16个孔洞中。橡胶垫放置在玻璃扫描仪表面。培养板侧面标注实验条件的标签，以避免图像分析时出现问题。带有编号（“1”）和/或设备名称（“Jabba”）的标记胶带有助于在使用多个扫描仪设备时后续核对样品位置。有关LSM硬件组件的更多细节见其他文献¹³。请点击此处下载该文件。

2. 实验当天前的准备工作

1. 培养箱温度校准：环境温度是决定 C. elegans 寿命的主要因素¹⁹。为获得准确结果，应在经过精确校准且在整个实验过程中保持恒定的温度下进行图像采集。为此，在实验开始前数天，测量并校准每台扫描仪在运行期间表面的温度。使用高精度热电偶，方法见其他文献³¹（参见材料表）。
2. 扫描仪培养板布局：在实验开始前，规划每台扫描仪上培养板的最佳布局。
   注：此步骤的目的是避免因扫描仪之间以及每台扫描仪表面不同位置之间的温度差异而引入混杂因素。各扫描仪的平均表面温度存在细微差异，且其表面温度分布也表现出轻微的偏差³¹。
   1. 扫描仪培养板位置：为在后续数据分析中控制这些热效应，应将生物学协变量关于扫描仪位置进行随机化处理，并在所有扫描仪之间标准化培养板的位置。
   2. 跨扫描仪的样本数量：使用16孔橡胶垫布局时（参见材料表），每台扫描仪中每个条件放置四块培养板，总共至少使用四台扫描仪。这可确保每个实验条件分布在多个扫描仪上，从而使数据处理过程中能够识别并消除扫描仪温度带来的混杂效应¹³。为使该分析更简便，建议在每台扫描仪上设置一个共用的参照条件（例如野生型样本）。
      注：通常由于扫描仪风扇的安装位置，橡胶垫右上角的培养板更容易发生干燥。如有需要，可将该位置留空。
3. 培养板与样本制备
   1. 培养板制备：为使扫描用培养板（参见材料表）达到最佳干燥效果，应在接种线虫前4天倒入琼脂培养基。尽管扫描仪的焦距可调节以适应不同体积的琼脂添加量，但标准培养板体积为8 mL。
      注：对于大规模实验，使用蠕动泵倒板可能更为方便。
   2. 接种培养板：至少在实验开始前2天将所需细菌接种至培养板，以保证细菌菌苔充分干燥和生长。通常，200 µL细菌培养液足以形成可维持40条线虫数周的食物菌苔。
      注：用于成像的培养板通常比标准的培养皿密封更严密；因此建议在生物安全柜内进行接种和干燥，通常约需1小时或直至完全干燥。
4. 线虫操作
   1. 种群数量：单个培养板上可稳定成像的线虫数量取决于基因型、接种时线虫的年龄以及每板添加的食物量。对于从早期成虫阶段开始的寿命实验，每板接种约40条线虫。该数量可保证充足的食物供应并避免过度拥挤。
   2. 大规模种群培养：为进行种群扩增和同步化，应根据所选的同步化方法准备适当数量的线虫种群（见下文）。目标是在动物产卵量最高的年龄阶段进行同步化处理，对于野生型N2线虫而言，即成虫第2天³²。
      注：选择成虫第2天的个体进行种群同步化的另一个原因是消除母体年龄对种群异质性的贡献。研究表明，C. elegans 的母体年龄会影响后代的多种适合度性状，其中成虫第2天的野生型个体产生的后代质量最高³³。
   3. 年龄同步化操作：为获得准确结果，应尽可能精确地同步动物的年龄。本方案采用改良的次氯酸盐处理法进行年龄同步化³⁴。其他方法包括通过产卵、L1幼虫停滞或手动挑选L4幼虫进行同步化。
      注：采用次氯酸盐处理进行年龄同步化时，预期每条成年雌雄同体可获得3至4个卵。
   4. 维持无后代种群：在L4晚期阶段使用5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）处理线虫，以维持无后代种群³⁵。
      注：低剂量FuDR对发育中的胚胎具有致死作用，但不会在生殖系中引起肉眼可见的变化，也不会改变卵母细胞的生成速率。其他方法包括使用温度敏感型不育突变体、不育RNAi构建体，或直接等到生殖期结束后进入衰老阶段时再将线虫转移至成像用培养板。
   5. 种群转移：在大量线虫转移过程中，使用铂/铱丝的传统方法较为繁琐。采用线虫液体悬浮法可简化转移过程并提高效率。使用M9 + Mg缓冲液（Na₂HPO₄ 42.27 mM，KH₂PO₄ 22.05 mM，NaCl 85.56 mM，MgSO₄ 1 mM）收集线虫，在线虫依靠重力沉降后减少总体积，然后迅速将线虫转移至用于成像的培养板。
      注：通过液体悬浮法转移线虫可能导致每板接种数量出现差异。应尽量保持每板线虫数量一致，以避免实验变异性。
   6. 施加干预措施：在实验过程中暂停和重启图像采集会增加图像分析的复杂性（见讨论部分）。因此，应在完成所有必要的线虫操作后，再开始LSM实验。
5. 橡胶垫灭菌：将多个橡胶垫分别用铝箔包裹后，同时进行高压灭菌。
   ​注：橡胶垫应在每次使用之间进行灭菌，以防止真菌或细菌污染物积累。大多数常用类型的橡胶会被高浓度乙醇处理降解。

3. 实验当天的准备工作

1. 培养皿支撑架与扫描仪玻璃的准备：为简化培养皿的操作，不要将培养皿直接放置在扫描仪表面，而应使用由玻璃板支撑的橡胶垫固定培养皿（参见材料表）。通过该玻璃板对菌群进行成像，因此需保持玻璃清洁，并涂有防雾、疏水和消毒涂层（参见材料表）。
   1. 在将培养皿装入培养箱之前，使用防雾玻璃清洁剂清洁培养皿支撑玻璃的两面。
   2. 在将培养皿放置到支撑玻璃上之前，需在玻璃表面施加一层保护性疏水玻璃处理剂（参见材料表），以减少与橡胶垫接触一侧的玻璃表面起雾。均匀涂抹该处理剂，并在下一步操作前静置5–10分钟。涂抹后需用力擦拭，彻底清除残留物。
   3. 使用70%乙醇对将与橡胶垫接触的玻璃表面进行消毒，静置1至2分钟，然后用布或纸巾擦除。
2. 将培养皿装载至扫描仪
   1. 首先，将经过高压灭菌的橡胶垫放置在已处理的培养皿支撑玻璃上方。
   2. 取用于成像且已接种线虫的培养皿，打开皿盖，将其放置在橡胶垫上，使培养皿底部朝向玻璃表面。确保橡胶垫紧密密封所有培养皿，例如可在其上方再覆盖一块玻璃板并确保其平整，或轻敲每个培养皿顶部进行检查（未固定牢固的培养皿会轻微移动并撞击玻璃，发出声响；而固定牢固的培养皿在轻敲时不会移动）。
      注意：建议使用标记胶带为每块培养皿支撑玻璃单独标注，注明培养皿内容物及目标扫描仪信息。该数据可在实验结束后用于解决任何关于培养皿位置的潜在疑问。
   3. 在将培养皿装入扫描仪前，先断开扫描仪风扇电源，以保护操作人员手指安全。
   4. 轻柔地将培养皿及其支撑玻璃板整体滑动至扫描仪表面。
      注意：避免直接对橡胶垫施加压力，否则会导致垫子在支撑玻璃上滑动。一旦垫子滑动，培养皿常会从垫子上脱落。
   5. 重新启动扫描仪风扇，并目视确认前方和侧面的风扇已通电运行。若扫描仪此前处于关闭状态，此时应将其开启。

4. 采集前图像

注意：图像采集过程中所有基于软件的操作步骤汇总于下图所示的综合流程图中 图1.

图1：Lifespan Machine图像分析流程的图示概览。 图像采集前、采集中和采集后的步骤主要在网页界面（WI，红色）和Worm Browser（WB，绿色）上完成。部分步骤在其他平台（O，蓝色）上进行，例如步骤3a中的TXT文档、步骤4b中的Photoshop或等效软件，以及步骤13中的JMP或等效软件。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 图像采集设置：生成一个文件，用于指定实验时间表以及各扫描仪上培养板的位置，以配置图像采集。
   注意：此文件包含重要元数据，如实验标题、图像采集频率以及实验总时长。通常情况下，此文件不会自动生成 从头合成 每次实验并不重新创建文件，而是重复使用之前实验的实验文件作为模板。对于用户的首次实验，将提供一个模板文件（补充文件 1).
   1. 请求预览捕获：提供每台扫描仪上所有培养板的位置。为此提供了多种工具以加快该过程。首先，使用扫描仪获取整个扫描表面的图像，称为“预览捕获”。确保预览捕获图像清晰显示每个待成像培养板的完整表面图2A无条纹或平板边缘裁剪现象。
      1. 使用网页界面，查找 图像采集 主页面的版块，然后点击名为 捕获设备与图像服务器. 在该页面上，点击标有 寻找新设备 （即扫描仪）在 图像采集与处理服务器 盒子。通过点击监控服务器检测扫描仪的进度 [log] 链接位于服务器旁边。
         注意：执行此步骤前，请确保所需的扫描仪已接通电源并连接至服务器。
      2. 在同一网页的Web界面中，确保连接到服务器的每台扫描仪均出现在 图像采集设备 盒子。如果设备成功被检测到，“当前状态”下的“缺失”标签将不再显示。选中每个已加载新载板的扫描仪对应的复选框。
      3. 在底部的 图像采集设备 部分，点击 申请预览捕获 按钮。1 或 2 分钟内，扫描仪应亮起并开始扫描。
         注意：通常需要调整玻璃支撑板的初始位置，以使所有培养板进入可视范围。可通过检查预览扫描图像，并对培养板位置进行调整后重新获取预览图像，以校正位置。如果扫描速度极慢（单次扫描耗时数分钟）或预览图像中出现长条状白色条纹，则表明培养板、橡胶垫或其他物体遮挡了扫描仪校准区域（扫描仪表面以白色箭头标示）的光线。应重新放置所有物品，确保仅有玻璃支撑板位于该区域内。
   2. 定义扫描区域：在 Worm Browser 中按照以下步骤操作，以分析预览捕获的图像，并将其拼接成一幅完整的组合图像，用于确定每块培养板在数据分析中的位置。确保最终图像与以下示例相似 图2B.
      1. 首先，使用 Worm Browser，通过选择菜单选项打开每个预览捕获图像 文件 > 打开图像，并选择所需的图像。
      2. 在每张图像上，单击以选择有板的区域所在的列（如果橡胶垫有16个板位，则选择4列）。
         注意：扫描区域应设置为高而窄的列状区域（而非宽而短的行状区域），因为扫描仪对较宽区域的捕获速度较慢，可能导致线虫移动而产生模糊图像。
      3. 定义所有图像后，通过选择菜单项将区域规格导出到磁盘 图像采集 > 定义扫描区域 > 将选定的扫描区域保存到磁盘 并选择所需的位置。
   3. 生成实验时间表：
      1. 遵循以下格式 补充文件 1，整理一个文件，其中包含实验名称、各列在扫描仪上的物理位置（从步骤 4.1.2.3 生成的扫描区域文件中复制）、实验总时长以及图像采集频率，并将该文件同时保存为 TXT 和 XML 格式。
      2. 然后，在 Worm Browser 中点击 图像采集 > 提交实验计划安排，然后选择生成的 XML 文件。Worm Browser 将询问是否输出时间表摘要或运行实验。点击 生成摘要文件.
   4. 验证摘要文件：提交实验时间表后，Worm Browser 将生成该时间表的摘要。此摘要会显示在屏幕上并保存至磁盘。请仔细阅读并核对计划捕获的日期，以及扫描仪的位置、名称和数量。
   5. 提交实验时间表：当对摘要文件满意后，通过选择菜单选项，将实验时间表的 XML 文件再次加载到 Worm Browser 中 图像采集 > 提交实验计划安排. 蛔虫浏览器将再次提示是输出时间表摘要还是运行实验。此次请点击 运行! .
      注意：实验提交后几分钟内，建议使用网页界面确认实验已成功提交，并且所有扫描仪均正在进行数据采集。在大型实验中，最初几次扫描遗漏是常见现象。
   6. 在网页界面中组织实验：繁忙的扫描仪集群可产生由众多不同用户采集的数百个实验数据集。为便于管理此列表，可将实验分配至不同的组，例如根据负责该实验的用户姓名进行分组。
      1. 创建新组或修改现有组：通过单击网页界面中的选项来创建新组 管理实验组 名为的方框下方 图像采集. 在将出现的新页面上，输入所需的名称 创建新组 并点击 创建. 若要修改现有组的名称，在同一对话框中，选择目标组旁边的组 修改现有组，然后选择 修改.
      2. 将实验分配至组别：要将新实验分配至特定组别，请进入网页界面，找到目标实验，该实验默认将被分配至 无分组 实验列表底部的组。点击实验部分右侧的链接，其中显示 编辑，然后使用下拉列表选择要使用的组的名称。接着，选择 保存.
   7. 取消实验：
      注意：激光扫描显微镜（LSM）将持续自主运行，直至实验计划中指定的最终扫描完成。实验计划结束后，LSM 默认将继续采集扫描图像，但会立即丢弃图像数据，此过程称为 自动扫描这些自动扫描用于防止扫描仪关闭和冷却，以维持标准的温度分布，从而确保在同一空间内运行的其他实验（即使来自不同的实验项目）不会因其他扫描仪的关闭而受到影响。
      1. 停止自动扫描：要在网页界面中停止正在进行的实验的自动扫描，请点击 编辑 在目标实验旁边，然后 取消待处理的扫描，并选择 取消已安排的采集.

图 2：预览图像采集与扫描区域选择。（A）针对实验中的每台扫描仪，生成一幅预览采集图像。（B）每次选择一行培养板（红色框），可提高扫描速度，并避免因扫描区域过宽而导致的线虫运动模糊。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 图像采集

注意：以下步骤可在实验运行过程中或实验结束后进行。

1. 输出实验的掩膜文件：扫描仪获取的原始图像数据包含许多无需处理的区域（如平板以外的区域）。为了单独聚焦于每个平板的分析，需创建一个“掩膜”，用于指定每个扫描仪图像上各平板所占据的区域。通过在扫描仪采集的图像上绘制每个平板的位置作为叠加层，生成该掩膜。
   1. 在 Worm Browser 中，通过选择 文件 > 选择当前实验 来选定目标实验，然后点击实验名称。
   2. 再次在 Worm Browser 中，选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 生成实验掩膜合成图，并将掩膜保存至指定位置。确保生成的文件与 图3A 相似。

图 3：使用样本掩膜确定各扫描仪的孔板位置。 为确保对 图 1 中所示列选择范围内的孔板进行独立分析，必须通过生成图像掩膜组合来识别各个孔板。(A) 使用图像处理软件打开扫描仪的扫描图像（注意扫描区域上方标注的扫描仪名称“han”，以及代表各列的“a-d”）。(B) 生成掩膜以标记掩膜组合中每个孔板位置的各个步骤，首先需将背景设为黑色；(C) 通过先扩展再收缩背景的方式，去除锯齿边缘及未选中孔板的边缘；(D) 选中前景中的孔板，并用白色像素完全填充其区域。 (E) 为使 LSM 能够识别扫描行中的各个孔板，需将每行中的每个白色区域填充为不同深浅的灰色，通常按亮度递增方式填充。(F) 此阶段将保存掩膜（若在 Photoshop 中生成，则采用 LZW 压缩且不包含图层）。随后，Worm Browser 对该掩膜进行扫描，并由软件生成掩膜的可视化图像。正确的掩膜可视化结果应为每个孔板显示一个清晰的方块，中心带有一个小十字，且每行具有不同的颜色。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 标注实验的掩膜：使用图像处理软件（如 Photoshop 或 GIMP）打开上一步生成的文件，以标记图像中每一块孔板的位置。以下将概述使用 Photoshop 进行掩膜编辑的所有步骤。
   1. 在 Photoshop 中，选择 填充 将容差设为零，选中“连续的”选项，取消选中“消除锯齿”。单击灰色背景，将其完全设置为黑色。确保生成的图像与以下示例相似 图3B.
   2. 使用魔棒工具选择黑色背景，关闭抗锯齿，容差设为0，并选择连续区域。为使边缘平滑，点击将选中背景区域向外扩展30像素 选择 > 修改 > 扩展。然后，将选区向内收缩 20 像素 选择 > 修改 > 合同确保最终图像与之相似 图3C.
   3. 用黑色像素完全填充平滑后的背景，例如通过设置 填充 将工具容差设为255并填充选定区域。然后，单击 选择 > 逆 反向选择，选中前景区域。使用白色像素完全填充新选中的区域，例如，将填充工具的容差设为255，并用白色填充该区域。确保最终图像与目标图像相似 图3D.
   4. 为分离单个区域内的每块板，使用亮度递增的不同灰度梯度填充每一行。可通过填充工具选择所需颜色实现，容差设置为0。确保最终图像与以下示例相似 图3E以 LZW 压缩格式保存，且不指定“图层”。
      注意：平板的排序由指定区域的颜色决定。若要将平板1-4按从上到下的顺序命名，请为每一行指定亮度递增的颜色。
   5. 在 Worm Browser 中选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 分析实验掩膜复合图上绘制的孔板位置，选择上一步生成的文件。软件现在将用几分钟时间分析提交的掩膜。
   6. 线虫浏览器将显示一个掩膜可视化图像。请检查该掩膜文件中是否存在潜在错误。确保每行培养板均被不同颜色填充，并由彩色矩形框标出轮廓。最终图像应与下图相似 图 3F.
      注意：如果单个平板上显示两个或更多圆圈，或者两个圆圈颜色相同，请返回步骤 5.2 修正掩膜文件，并重新将其加载到 Worm Browser 中。
   7. 在确认掩膜可视化结果正确后，在 Worm Browser 中选择 图像采集 > 定义样本掩膜 > 将分析后的实验掩模复合图像提交至集群图像分析服务器现在将分析实验中所有培养板的位置。
3. 应用掩膜：LSM 使用掩膜将原始图像数据分割为单独的孔板。要启动此过程，请通过网页界面安排一项掩膜应用任务。
   1. 提交作业前，验证所有扫描仪是否已在掩膜中识别出区域。转到网页界面的主页面，找到实验名称及名为 图像分析，然后点击 运行分析. 确认所有设备均处于 实验样本 已确定区域。
   2. 应用掩膜时，在同一界面中点击 所有样本的新任务名为的盒子上 为单张图像安排任务，选中该复选框 应用掩膜，然后 保存职位.
      注意：该掩膜将应用于所有已采集的图像，以及未来采集的任何图像。
4. 进行平板质量控制：
   注意：在此阶段的图像分析中，受到污染、干燥或起雾的平板将被剔除。图中展示了受污染、干燥、起雾及理想状态平板的示例。 图4其他需要剔除的原因包括饥饿、空培养皿或无菌种群中的幼虫。无效的培养皿中常含有复杂形状，仪器会试图将其识别为线虫。在此步骤中排除无效培养皿非常重要，以避免在后续图像分析步骤中造成过长的处理时间。
   1. 使用网页界面，通过查找目标实验和名为 标注平板信息 并选择 按图像.
   2. 检查平板时，单击 显示图像.
      注意：如果显示图像的步骤无法正常工作，可能是 Linux 服务器未正确配置。有关如何进行配置的说明，请参见上述 GitHub 仓库中的软件安装指南。
   3. 要排除某些孔板，请勾选复选框标记 审查，从名为的下拉框中选择一个选项 审查原因，然后点击 保存 每页
5. 添加元数据信息：元数据用于描述实验中每块板的内容。该信息将被包含在后续生成的所有统计数据分析文件中。
   1. 要添加与菌株、基因型、温度、食物等相关的元数据信息，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及其名为 标注培养板信息，并选择 按位置.
   2. 输入标签，并通过点击选择要为其保存元数据的扫描仪 保存至设备 在左下角。
   3. 要在不同扫描仪之间重复使用元数据而无需重新输入所有标签，请前往 从设备加载 在右上角，选择要从中重复使用元数据的扫描仪，然后单击 从设备加载.
6. 指定“零龄时间：默认情况下，LSM 以 UNIX 纪元的起始时刻为基准测量时间。这种方式通常不便于使用，因此需要指定一个参考时间点（例如，所有个体孵化或达到成年的时间）。
   1. 要指定零年龄时间信息，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及名为 图像分析，并选择 运行分析.
   2. 在出现的新页面上，选择 所有地区的全新职位名为 更新区域信息，选择 动物年龄为0的时间点，添加信息，然后点击 更新所选字段.
      注意：如果所有动物的零时年龄不一致，则应选择其他方法 特定动物类型的新用途，并对每组重复上述步骤。
7. 安排线虫检测：激光扫描显微镜（LSM）可根据线虫在培养皿上的位置自动检测每条线虫。
   1. 要开始对每张图像中的线虫进行自动检测，请进入网页界面的主页面，找到目标实验及名为 图像分析，并选择 运行分析.
   2. 在新出现的页面上，点击 所有地区的全新职位，然后在名为 为单张图像安排任务，然后选中复选框 中值滤波器 > 阈值 > 线虫检测 > 保存职位这些任务将应用于所有已拍摄和未来拍摄的图像。
      注意：若要仅为特定菌株或条件安排任务，请点击 特定动物类型的工作岗位使用存储为文件的SVM模型执行对象分类 模型 LSM 长期存储目录的子文件夹。LSM 的 V2.0 线虫检测参数集可从 GitHub 仓库下载。

图 4：通过网页界面进行平板质量控制。 在进行线虫运动分析之前，利用网页界面剔除不符合要求的平板，对于加快图像处理流程至关重要。需要剔除的平板示例包括存在（A）干燥、（B）污染或（C）起雾等情况的平板，而（D）符合标准的平板则应保留用于后续分析。预览图像上叠加了10 mm的比例尺。 请点击此处查看此图的放大版本。

6. 图像采集后处理

注意：完成线虫检测后，必须将实验中收集的所有数据随时间进行整合，以追踪每只个体的整个生命周期，并确定所有个体的死亡时间。需等待实验中所有动物均已死亡，且所有线虫检测任务均已完成，然后执行以下步骤：

1. 安排运动分析：
   1. 运动分析会随时间整合所有实验数据，以估算死亡时间。要启动此项任务，请进入网页界面的主页面，在名为 图像分析 的列中找到目标实验，点击链接 运行分析。
   2. 在新出现的页面上，点击链接 为所有区域创建新任务，然后在下拉菜单 为整个区域安排任务 中选择 分析线虫运动，并点击按钮 保存任务。
   3. LSM 图像采集服务器将自动开始对所有培养板进行运动分析。
      注意：运动分析是计算量最大的单一任务。在现代多核处理器上，对一个持续一个月寿命实验的每块培养板进行分析可能需要 20 分钟或更长时间。
2. 生成故事板：运动分析完成后，LSM 故事板允许用户手动验证自动化分析结果，确保软件对线虫形态和行为的判断正确。
   1. 在网页界面的主页面上，找到目标实验及 图像分析 列，点击 运行分析。在新出现的页面上，点击 新建实验任务。然后在 为整个区域安排任务 部分选择 生成动物故事板，并点击 保存任务。
   2. LSM 完成故事板生成后，进入 Worm Browser 并选择目标实验。返回主菜单，选择 验证 > 浏览整个实验 > 每条线虫死亡后立即查看。
3. 在 Worm Browser 上标注故事板：Worm Browser 上的典型故事板应如 图 5 所示。
   1. 标注“非线虫”对象
      注意：运动检测过程中识别出的每个对象都会按估计死亡时间顺序显示在故事板上。除非用户另行指定，否则每个对象都将被纳入最终的生存曲线中。LSM 的对象分类被有意校准为具有较高的假阳性率，以此作为减少漏检线虫数量的权衡。排除非线虫对象对于获得高质量的生存曲线至关重要（参见代表性结果）。通常在故事板的第一页和最后一页会发现大量非线虫对象，这些对象可快速批量手动排除。
      1. 要从故事板中排除非线虫对象，请在其图像上单击右键一次。被排除的对象将由白色方框标出。若要同时排除多个对象，请按住控制键，然后在任一对象上单击右键，即可排除该故事板页面上的所有对象。
      2. 排除对象后，可通过再次双击右键将其重新纳入分析。
      3. 为保存故事板标注过程中所做的注释，请点击 保存 按钮。建议在标注过程中频繁保存进度。
   2. 标注死亡时间：
      注意：在无用户干预的情况下，LSM 能够准确估算大多数群体的死亡时间。但建议通过手动验证每个实验中随机选取的个体子集，常规性地确认自动化结果的准确性。应特别关注寿命最短和最长的个体，因为自动化分析中的误差往往集中在这两类个体中。
      1. 在故事板上任一对象上单击左键一次，可打开一个新窗口，显示该对象的详细时间序列信息。该窗口允许查看实验期间采集的所有该对象图像，以及对其运动动态和形态的量化结果。使用相同界面可手动标注死亡时间。死亡时间标注界面如 图 6 所示。
      2. 要手动标注死亡时间，请在底部时间条上对应死亡时间的位置单击左键。可使用空格键及键盘上的左右箭头键浏览时间帧，或直接在时间条上点击目标时间点。
         注意：该可视化图示以类似水平条形图的形式展示动物随时间的运动状态，横轴表示时间。粉红色/紫色部分表示对象剧烈运动的时间段，黄色表示微弱运动，红色表示无运动状态，绿色表示与死亡相关的扩张期。线虫表现出特征性的与死亡相关的形态学事件：通常在死亡前出现逐渐的身体收缩，随后在死亡时或死亡后立即发生快速的身体扩张（图 6B）。非线虫对象（如灰尘或阴影）不会表现出这种体型变化动态，而是通常随时间呈现线性、渐进的尺寸和强度变化。这些不同的体型动态变化为快速分类和手动排除提供了简便方法。
      3. 根据分析方法的不同，死亡时间可定义为运动停止的时间（运动可视化图中红色条的起点），或定义为与死亡相关的扩张时间（运动可视化图中的绿色条）。要手动标注收缩和扩张事件，请在底部时间条的目标时间点上单击右键。
   3. Worm Browser 客户端内嵌提供了一些基本的死亡率数据可视化功能。每个故事板中存在的群体均会显示其生存曲线和死亡时间诊断图（图 7）。在故事板左侧查看生存曲线，在右侧查看将每个个体的剧烈运动停止时间（VMC）与死亡时间进行比较的散点图。
      注意：可通过在底部时间条上对特定品系、扫描仪或培养板等条件进行子集划分，按不同实验参数对这些结果进行分组。可通过在 VMC 与死亡时间散点图中单击左键选择特定个体。
4. 将死亡率数据写入磁盘：LSM 以 CSV 文件形式生成死亡率数据。可将输出的生存曲线导入 R、SAS、STATA 或 JMP 等任意统计软件中进行绘图和分析。
   1. 要生成这些文件，请在 Worm Browser 中选择实验，在菜单中选择 数据文件，死亡时间，然后点击 为当前实验生成死亡时间。LSM 将生成包含该实验生存数据的输出文件，并保存至结果目录。
   2. 如果已在故事板上进行了手动标注，Worm Browser 将弹出提示，询问如何处理手动标注。点击“立即”以将手动标注包含在输出的死亡时间文件中。
      注意：死亡率数据文件将写入 imageserver.ini 文件中指定的结果目录。会生成多种文件，但最常用的是 "survival_simple/survival=machine_hand" 版本，该版本包含使用故事板进行的所有手动标注。
   3. 使用所选的统计软件分析死亡率数据。

图5：蠕虫浏览器上的动物故事板。 (A所有静止的线虫均按机器标注的死亡时间的先后顺序显示。要浏览故事板，请按下（B）右下角，以及（C) 经常保存注释。D背景非灰色的图像显示了两次线虫死亡事件（早期死亡显示为绿色，较晚死亡显示为红色），这些事件可能发生在两条线虫彼此靠近死亡时，也可能发生在死亡的线虫被路过的线虫移动后被再次检测为死亡的情况下. (E) 图像右下角的红色标签用于标识已检测到死亡时间的线虫；F绿色标签表示物体未保持静止足够长时间，因而无法记录死亡时间. (G同一画面中的多条蠕虫可通过按住 Shift 键并单击左键进行标记。H通过右键单击排除非线虫物体的分析。(I爆炸的线虫通过点击相应图像（手动注释窗口将弹出），然后按住 Shift 键并右键点击，直至出现“animal exploded”提示信息，从而从分析中排除. 在 Worm Browser 窗口的截图上叠加了 0.5 mm 的比例尺和标签。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图6：在 Worm Browser 中检查对象及死亡时间的标注。 在 Worm Browser 故事板上的任意对象上单击左键，将打开一个新界面，允许用户查看该对象的运动动态。在右侧，(A) 显示的是运动评分，用于量化对象的运动情况；该评分通过连续观测之间像素强度的变化进行估算。此外，在右侧(B) 还显示了对象总强度的变化，用于量化对象大小的变化。在左侧，上方的条形图显示的是(C) 机器对死亡时间的估计值，而下方的条形图为(D) 人工手动标注的死亡时间。单击条形图上的任意点并按下空格键，用户即可浏览线虫成像的时间帧。在这些条形图中，粉红色表示剧烈运动的时间段，红色表示死亡时间段，黄色表示介于两者之间的状态。死亡时间之后的伸展与收缩所持续的时间以绿色显示。图中标签叠加在线虫浏览器窗口的截图上。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：Worm Browser 上的群体汇总统计信息。 针对扫描仪设备“obiwan”的群体统计数据，左侧面板显示生存曲线，右侧面板显示剧烈运动停止时间（VMC）与死亡时间的散点图。图中展示的内容包括：（A）一个实验条件的详细信息，该数据来源于（B）一台扫描仪，其首先通过选择（C）按品系分组的生存数据获得。在散点图中，（D）方形标记表示人工标注的事件，而（E）圆形标记表示机器自动标注的事件。（F）对于早期发生的死亡事件，或（G）剧烈运动停止时间与死亡时间重合的事件，通常需要进行人工标注。图中标签叠加在 Worm Browser 窗口的截图上。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

寿命测定实验的可重复性具有挑战性，需要严格控制实验条件并使用大样本量以获得足够的统计分辨率^4,36。寿命监测系统（LSM）特别适用于在恒定环境中以高时间分辨率检测大量动物群体。为了展示LSM的能力、突出分析中的关键步骤，并帮助研究人员合理分配工作精力，我们展示了一项已发表的最优实验中的部分数据²³。由于该实验为剂量-反应测定，因此需要大量动物才能可靠地检测寿命的变化。若采用人工操作，该实验将需要多名研究人员投入大量时间；若缩小规模，则会导致统计效能不足的结果。该数据集测量了去除信使RNA转录所必需的RNA聚合酶II（b）亚基基因（RPB-2）后寿命的定量变化。利用在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的生长素诱导降解系统³⁷，将RPB-2的内源位点标记上降解决定子（degron）序列，从而可在不同浓度生长素（α-萘乙酸）存在下条件性地泛素化并降解RPB-2。实验使用菌株AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1]，其中cer135对应于通过CRISPR插入的AID标签rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG²³。实验条件为20 °C培养温度，并使用紫外线灭活的NEC937（OP50 ΔuvrA; KanR）³⁸ E. coli 作为食物来源。通过在晚期L4阶段将线虫转移至含有5-氟-2-脱氧尿苷（FUdR）的培养板中实现雌雄同体的生殖系统抑制。成虫第2天将线虫转移至含有不同浓度生长素的培养板中。在原始研究中，作者证明在生长素存在下，RPB-2的降解以剂量依赖的方式缩短了线虫的寿命²³。

在此，我们展示了实验后数据验证与注释对最终生存曲线输出结果的贡献（图8）。在 Worm Browser 故事板图像分析的最后步骤中，我们将故事板注释前生成的原始生存曲线，与手动排除非线虫物体后生成的生存曲线，以及进一步对非线虫物体和个体死亡时间进行注释后生成的生存曲线进行了比较（图8A-C）。我们发现，在故事板注释前生成的初始生存曲线（图8A）因错误地包含了非线虫物体而发生扭曲，这一问题在生存曲线的尾部尤为明显。在手动注释之前，生存曲线包含了机器检测出的所有可能为线虫的物体，其中约有一半由于故意设置的高假阳性率而实为非线虫物体，需通过人工方式予以排除（图8D）。这是设计上的有意为之：算法被校准为具有相对较高的假阳性率，以避免出现假阴性，因为排除被错误包含的物体远比查找并恢复被错误排除的物体更为简便。在手动故事板注释过程中排除非线虫物体后，所得生存曲线的分辨率显著提高（图8B、E）；进一步在故事板上对死亡时间进行手动注释，仅导致估计的平均寿命发生不超过约4%的变化。因此，我们证明了在 LSM 图像分析流程中去除非线虫物体是获得高分辨率生存曲线的关键步骤。

图 8：手动数据验证对生存曲线的影响。 RPB-2 的降解在生长素（K-NAA：α-萘乙酸）存在的情况下以剂量依赖的方式缩短了C. elegans的寿命。(A) 根据 LSM 原始输出绘制的生存曲线，经过平板质量控制后，未在 Worm Browser 故事板上对线虫对象进行手动注释。(B) 在故事板上对线虫对象进行手动注释后绘制的生存曲线。(C) 在故事板上对线虫对象及其死亡时间进行手动注释后绘制的生存曲线。(D) LSM 检测到的所有对象的汇总。删失的线虫对象包括被系统自动排除的对象（例如，因线虫移出扫描区域）或实验人员手动排除的对象（例如，因线虫破裂）。(E) 手动注释线虫对象（左）及进一步手动注释死亡时间（右）后估计的平均寿命的表格表示。不同生长素浓度相邻组之间平均寿命的百分比差异以及检测的统计功效。所有图形均使用统计软件 JMP 绘制。本图数据经许可改编自 Oswal 等人²³。 请点击此处查看此图的放大版本。

在研究衰老时，我们不再局限于将寿命作为单一终点指标，而是进一步探讨了行为衰老，并分析了在实验后图像分析的各个步骤中，哪些步骤对于测量行为衰老最为关键。我们重点关注了剧烈运动停止（VMC）与寿命之间的关系，比较了图像分析和验证不同阶段的LSM输出结果（图9A-D）。我们发现，非线虫物体在表观VMC与寿命之间呈现出独特的关系，两者在每个物体中几乎被同时标注为发生事件（图9A）。相比之下，真正的线虫通常在其死亡时间前数天才停止剧烈运动（图9A）。这种VMC与寿命之间关系的差异，为快速识别并排除非线虫物体提供了另一种有效手段。

图9：手动数据验证对活跃运动停止（VMC）分析的影响。（A）未在Worm Browser故事板上对线虫对象进行手动标注的行为衰老数据，显示非线虫对象（黑色）与线虫对象（红色）的死亡时间与VMC时间之间的关系。（B）在故事板上对线虫对象进行手动标注后绘制的行为衰老数据。（C）在故事板上对线虫对象及死亡时间进行手动标注后绘制的行为衰老数据。（D）在图像分析流程的不同步骤中平均剩余寿命（ARL；由死亡年龄与VMC年龄的截距获得）的表格表示，以及线虫对象标注与进一步死亡时间标注之间ARL的百分比差异。（E）图像采集后分析不同步骤中估计ARL的图示，及其与线虫寿命的关系（该寿命依赖于生长素浓度：α-萘乙酸）。样条拟合采用三次样条法进行。所有图表均使用统计软件JMP绘制。本图数据经许可改编自Oswal等人的研究²³。请点击此处查看该图的放大版本。

我们发现，使用 Worm Browser 对非线虫物体进行注释和排除，足以粗略估计 VMC 与死亡时间之间的关系（图 9A-C），重现了线虫生理衰退的预期动态²³。为进一步探讨这一点，我们分析了相同的 RNA 聚合酶 II 数据集，并将每个亚群在 VMC 后的平均剩余寿命（ARL）估算为寿命与 VMC 之间线性回归模型的截距。为了理解数据注释对 ARL 的影响，我们在每一步数据注释后重新计算了 ARL（图 9E）。我们发现，在行为衰老分析中，对死亡时间的手动注释在寿命较长的线虫中尤为重要，例如本研究中暴露于最低浓度生长素的线虫（图 9D、E）。与对生存曲线影响甚微不同，死亡时间的手动注释对 VMC 与寿命之间的定量关系具有显著影响，例如在 0 µM 生长素条件下，死亡时间注释后 ARL 估计值从 8.09 天增加到 10.42 天，增幅达 29%。因此，我们发现，与仅测量寿命相比，由 ARL 所揭示的 VMC 与死亡时间之间的关系对手动注释死亡时间更为敏感。这种敏感性可通过 ARL 与寿命的相对持续时间差异来解释：对死亡时间的相同调整通常相对于寿命而言较小，但相对于 ARL 而言较大。因此，死亡时间的调整对 ARL 的相对影响大于对寿命的影响。

补充文件 1：Lifespan Machine 实验计划文件的结构。 实验计划包含三个部分。第一部分包括有关实验的基本信息，例如实验名称和采集参数。通常，每次新实验只需修改此部分中的实验名称。文档的第二部分是通过从 Worm Browser 导出扫描区域生成的，用于指定每个扫描仪的扫描区域物理位置（本示例中为 "asuna"、"bulma"、"moscow"、"rio"、"yuno" 和 "yuki"）。这些内容在每次新实验时都需要替换，并从步骤 4.1.2.3 中为每个扫描仪单独生成的 TXT 文件中复制。文档的第三部分提供有关实验持续时间的信息（每次新实验也应修改）以及采集频率。在整项实验期间，设备将以指定的时间间隔依次扫描每个定义的区域。请点击此处下载该文件。

讨论

本文提供了一个使用最新版寿命机器（Lifespan Machine）进行实验的详细且易于操作的实验方案。我们已证明，获得分辨清晰的生存曲线的关键步骤是在图像采集后的手动排除非线虫物体。手动标注死亡时间对生存曲线的整体形态影响较小，表明即使不进行人工标注，全自动死亡时间估计也具有较高效率（图8）。相反，若要获取高质量的行为衰老数据，则需要更精确地标注死亡时间，尤其是在长寿个体中（图9）。因此，手动分镜标注所需的时间最终取决于所测量的具体指标。总体而言，我们发现使用LSM时，研究人员的主要精力应集中于实验设计阶段，其次为图像采集后的分析阶段。最后，我们强调高通量、自动化检测在生成高分辨率的生存数据和行为衰老数据方面的价值，同时可提高研究人员的工作效率，并支持实验的可重复性。

LSM 将线虫培养在琼脂平板上，在自动化环境中重现了传统的手工寿命测定方法。已有其他工具被开发用于通过不同的线虫限制方法，实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命测定的自动化。这些方法包括将单个线虫饲养在固体培养基中（WorMotel¹⁵），或将其置于微流控装置内（Lifespan-on-a-chip¹¹），以及利用微流控技术追踪较大规模动物群体的方法（WormFarm¹⁴）。微流控平台的优势包括能够精确地实时控制环境条件，并通过尺寸排阻实现子代的自动清除。然而，上述设备迄今难以实现高通量扩展，因其通常需要大量人工操作，并且往往依赖实验人员每日手动触发图像或视频采集。其他平台，例如 Stress-Chip³⁹，则使用为 LSM 设计的改良平板扫描仪来成像定制的微流控装置。

与其他方法相比，寿命机器（LSM）具有完善的数据注释和验证功能，因此能够在高通量条件下系统地执行质量控制，以获取高分辨率、精确且准确的寿命数据¹³。该技术因其采用现有的基于琼脂平板的实验方案而具有良好的通用性，并且由于平扫式扫描仪的大规模阵列相对容易实现，因而为实验的可扩展性提供了独特优势。尽管LSM在初期需要投入一定时间用于设备搭建、运行以及对用户进行专用软件的操作培训，但其在寿命数据的稳健、高通量产出方面的优势可平衡这些成本。目前已有多个实验室部署了包含50台或更多扫描仪的寿命机器集群，持续运行超过十年⁴⁰。

LSM 存在一定的局限性。在自动采集生存数据期间，动物被饲养在扫描仪内，这限制了研究人员在观察的同时进行实验干预的能力，并且要求要么对动物进行灭菌处理，要么在秀丽隐杆线虫的生殖阶段结束后再开始实验。温度变化是实验干预受限情况下的一个罕见例外，因为环境温度可以在不打开扫描仪或接触动物的情况下进行调节。当需要在动物生命周期的中期进行手动干预时，常见的解决方案是延迟自动观察的开始时间，直至完成必要的操作处理。此外，培养板在单个扫描仪内部以及不同扫描仪之间的位置存在固有的差异。这些差异可能导致微小的局部环境条件变化（如温度、光照、通风等），从而可能影响 C. elegans 的寿命¹⁹。这种环境影响可通过加速失效时间回归模型进一步量化和研究⁴¹。减轻该效应的一种方法是简单地增加培养板和扫描仪的数量，以获得不受环境波动影响的严谨测量结果。通常情况下，相同实验条件的培养板会在每个扫描仪内随机分布，而跨扫描仪每种条件下个体数量超过 500 的群体已被证明可提供统计学上稳健的生存估计值³¹。

总之，LSM 能够实现高精度、大群体的生存与行为衰老数据采集，使得以往难以实现的筛选得以通过定量方式进行。通过这种方法，LSM 为生存曲线的标准化采集提供了重要的技术进步，并为线虫寿命与行为衰老的耦合研究提供了全新的框架。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-萘乙酸  生长素（吲哚乙酸）	Sigma	N0640	将生长素溶于1 M氢氧化钾中，然后加入熔化的琼脂
5-氟-2-脱氧尿苷（FUDR）	Sigma	F0503	27.5 μ使用 g/mL 浓度的氟脱氧尿苷（FUDR）以消除在紫外线灭活细菌种群上的子代
玻璃清洁剂	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
疏水性防雾玻璃处理	Rain-X 玻璃清洁剂	C. 059140
橡胶垫	当地工匠		在高强度三元乙丙橡胶板材上进行切割
扫描仪玻璃	本地五金供应商		9" ×11.5" 英寸玻璃板
扫描仪平板	生命科学	351006	50 mm × 9 mm，聚苯乙烯培养皿
USB参考温度计	USB Brando	ULIFE055500	用于校准扫描仪的温度