使用寿命机进行高通量行为衰老与寿命分析

摘要

成像平台“寿命机器”（The Lifespan Machine）可实现对大规模群体的终生自动化观察。我们展示了进行寿命、应激抵抗、致病性以及行为衰老检测所需的操作步骤。该系统所获得数据的质量和广度使研究人员能够在存在生物和环境变异的情况下，深入研究衰老干预措施。

摘要

在恒定环境中饲养的遗传背景相同的动物仍表现出显著差异的寿命分布，反映出衰老过程存在一个在所有被研究生物中保守的、巨大的非遗传性随机成分。这一随机性意味着，为了理解衰老机制并确定能够延长寿命或改善健康的有效干预措施，研究人员必须同时监测大量实验动物群体。传统的手动死亡评分方法限制了大规模假设检验所需的通量和规模，从而推动了高通量寿命测定自动化技术的发展。寿命机器（Lifespan Machine, LSM）是一种高通量成像平台，它将改良的平板扫描仪与定制的图像处理及数据验证软件相结合，实现对线虫整个生命周期的持续追踪。该平台是一项重大的技术进步，能够在前所未有的规模上，从大量动物群体中获取高时间分辨率的寿命数据，其统计精确度和准确性与经验丰富的研究人员进行的手动测定相当。最近，LSM 进一步发展为可量化衰老过程中出现的行为和形态变化，并将其与寿命相关联。本文中，我们描述了如何使用 LSM 规划、运行和分析自动化寿命实验。我们还强调了成功采集行为数据和高质量生存曲线所需的关键步骤。

引言

衰老是一个复杂且多方面的过程，其特征是生物体生理功能的衰退，从而导致随着时间推移疾病风险和死亡概率增加¹。寿命通常被定义为从出生或成年期开始到死亡的时间，是衰老的一个明确结局指标²，也是衡量不同群体间相对衰老速率的一种间接但严格量化的代理指标³。衰老研究通常依赖于对寿命的精确测量，类似于临床试验，通过比较接受干预的群体与未接受干预的对照群体之间的结局来进行评估。然而，目前衰老研究普遍存在可重复性问题，有时是由于统计效力不足的实验设计⁴，而更多情况下则是因为寿命测定本身对环境中的细微变化具有高度敏感性⁵。可靠的实验需要对大规模群体进行多次重复，而这一过程尤其受益于自动化所提供的实验可扩展性⁶。

寿命测定实验的严格要求源于衰老过程本身的不可预测性。在相同环境中饲养的同基因型个体表现出不同的死亡时间和生理衰退速率⁷，这表明寿命具有高度的随机性^7,8。因此，需要使用大样本群体来定量测量衰老过程中的变化，例如平均寿命或最大寿命的变化，并克服....

方案

1. 软件和硬件要求

1. 平板扫描仪：原则上，寿命成像系统（LSM）可使用多种成像设备实现。有关扫描仪改装和聚焦的详细说明可参见其他文献¹³。LSM硬件装置如补充图1所示。
2. 数据分析工具：LSM软件包含三个相互关联的组件：基于Linux的扫描仪控制软件包、基于网页浏览器的元数据管理软件包，以及适用于Windows和Linux的客户端图像分析软件包。有关安装这些软件工具的说明，请参阅GitHub代码仓库中发布的指南（https://github.com/nstroustrup/lifespan）。
3. 数据可视化与验证软件：使用Worm Browser（一种客户端程序）来安排实验、验证图像分析结果、对线虫运动进行手动标注，并输出生存数据。Worm Browser为Windows 7、Windows 8和Windows 10提供了二进制可执行文件，也可在Linux或Apple iOS系统上从源代码编译运行。上述GitHub代码仓库中提供了安装指南。

补充图1：寿命成像仪硬件。 一台平板扫描仪，其盖子打开以显示已加载的培养板，这些培养板倒置放置在橡胶垫上切割出的16个孔中。橡胶垫放置在玻璃扫描仪表面。培养板的条件标签书写在板的侧面，以避免图像分析时出现问题。带有编号....

结果

寿命测定实验的可重复性具有挑战性，需要严格控制实验条件并使用大量样本群体，以获得足够的统计分辨率^4,36。寿命监测系统（LSM）特别适用于在恒定环境中以高时间分辨率对大量动物群体进行监测。为了展示LSM的能力、突出分析中的关键步骤，并帮助研究人员合理分配工作精力，我们展示了一项已发表的最优实验中的部分数据²³。由于本实验为剂量-反应测定，需使用大量动物才能可靠地检测寿命变化。若采用人工操作，该实验将需要多名研究人员投入大量时间；若缩小规模，则会导致统计效能不足。该数据集测量了去除信使RNA转录所必需的RNA聚合酶II（b）亚基基因（RPB-2）后寿命的定量变化。利用在C. elegans中建立的生长素诱导降解系统³⁷，将RPB-2的内源位点标记上降解决定子（degron）序列，从而可在不同浓度生长素（α-萘乙酸）存在下实现RPB-2的条件性泛素化与降解。实验使用菌株AMP100 [r.......

讨论

本文提供了一个使用最新版寿命机器（Lifespan Machine）进行实验的详细且易于操作的实验方案。我们已证明，获得分辨清晰的生存曲线的关键步骤是在图像采集后的手动排除非线虫物体。手动标注死亡时间对生存曲线的整体形态影响较小，表明即使不进行人工标注，全自动死亡时间估计也具有较高效率（图8）。相反，若要获取高质量的行为衰老数据，则需要更精确地标注死亡时间，尤其是在长寿个体中（图9）。因此，手动分镜标注所需的时间最终取决于所测量的具体指标。总体而言，我们发现使用LSM时，研究人员的主要精力应集中于实验设计阶段，其次为图像采集后的分析阶段。最后，我们强调高通量、自动化检测在生成高分辨率的生存数据和行为衰老数据方面的价值，同时可提高研究人员的工作效率，并支持实验的可重复性。

LSM 将线虫培养在琼脂平板上，在自动化环境中重现了传统的手工寿命测定方法。已有其他工具被开发用于通过不同的线虫限制方法，实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命测定的自动化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-萘乙酸  生长素（吲哚乙酸）	Sigma	N0640	将生长素溶于1 M氢氧化钾中，然后加入熔化的琼脂
5-氟-2-脱氧尿苷（FUDR）	Sigma	F0503	27.5 μ使用 g/mL 浓度的氟脱氧尿苷（FUDR）以消除在紫外线灭活细菌种群上的子代
玻璃清洁剂	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
疏水性防雾玻璃处理	Rain-X 玻璃清洁剂	C. 059140
橡胶垫	当地工匠		在高强度三元乙丙橡胶板材上进行切割
扫描仪玻璃	本地五金供应商		9" ×11.5" 英寸玻璃板
扫描仪平板	生命科学	351006	50 mm × 9 mm，聚苯乙烯培养皿
USB参考温度计	USB Brando	ULIFE055500	用于校准扫描仪的温度