此处，我们介绍用于操作的实验方案 罗伊氏乳杆菌 DSM20016，详细描述了菌株生长、质粒转化、菌落PCR、荧光报告蛋白检测以及质粒小提的有限操作，同时涵盖常见问题及解决方案。这些实验方案可用于在DSM20016中检测报告蛋白的表达，或进行验证 通过 若不涉及报告基因，则采用菌落PCR。
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摘要
摘要
Lactobacillus 是一个极为庞大且多样的细菌属，包含 261 个物种，其中一些为共生菌株，具有作为合成生物学工程载体在胃肠道内应用的潜力。由于该属内存在广泛的表型和基因型变异，近期已对其进行重新分类，并建立了 23 个新的属。
由于旧属内存在广泛的变异，某一成员中展示的实验方案可能无法在其他成员中达到预期效果。缺乏关于如何精确操作特定菌株的集中化信息，导致了一系列问题 特设的 方法通常借鉴自其他细菌家族，这可能使刚进入该领域的研究人员难以判断哪些信息适用于或不适用于其选定的菌株。
本文旨在整合一系列已验证成功的实验方案，特别针对 的 Limosilactobacillus reuteri 菌株编号 F275（其他保藏编号：DSM20016、ATCC23272、CIP109823），并提供常见问题的解决方案及可能遇到的典型问题。这些实验方案应能使缺乏或几乎没有相关操作经验的研究人员 L. reuteri DSM20016 转化质粒、确认转化及在酶标仪中测量系统反馈 通过 报告蛋白
引言
历史上，Lactobacillus 属被归类为革兰氏阳性、杆状、不形成芽孢的细菌，属于兼性厌氧菌或微需氧菌，能够将糖类分解为主要产生乳酸1。这些较为宽泛的分类标准导致 Lactobacillus 属在表型和基因型上表现出极高的多样性。这种广泛的分类最终促使该属被重新分类，并于2020年引入了23个新的属2。
旧的广义属包含主要的共生和益生菌物种，通常被认为可安全食用（GRAS）3。该 乳杆菌科 该菌属因被报道具有多种健康益处，故在公众认知中保持着“有益菌”的形象 通过 不同菌株的消耗4,5,6,7它们穿越胃肠道的便捷性8 及其公众接受度共同决定了其定位 乳杆菌科 将菌株作为可摄入药物、治疗或诊断应用的理想底盘生物候选者。
特征的广泛多样性存在于 乳杆菌科 家族的延续导致了目前这种没有 事实上的 模式生物菌株；研究团队往往倾向于选择与其特定研究目标最相关的物种。（例如，乳品发酵实验室可选择 L. lactis；研究蔬菜发酵时可能会选择 植物乳杆菌；益生菌研究可能侧重于 L. acidophilus；等等。
这种在不同物种间广泛存在的特性差异，导致了大量实验方案和操作步骤的积累，这些方案可能对乳杆菌科（Lactobacillaceae）中的某一亚群效果良好，但在其他亚群中则需要优化才能有效运行（甚至可能完全无法运行）9。这种在科内不同成员之间甚至同一物种不同菌株之间所需的优化，可能会使不熟悉该领域的研究人员感到困扰。此外，发表于论文方法部分的实验方案往往包含作者自身的修改10，从而导致实验方案分散、缺乏统一整合。
L. reuteri 被认为是一种广泛存在的脊椎动物共生菌，在哺乳动物和鸟类中 consistently 被发现11 和鱼类12 胃肠道（GI） L. reuteri 亚型菌株通常具有特定的遗传特性， 通过 黏液黏附蛋白适应，以更持久地定植于特定的天然宿主8,11,13消化道 Limosilactobacillus 物种可在非原生宿主中被分离，但通常更倾向于呈现短暂性存在8.
由于对人类宿主的特异性适应，L. reuteri DSM20016 非常适合作为在人体胃肠道任何部位进行诊断或治疗应用的底盘菌株，与更短暂定植的菌株相比，DSM20016 菌株可能为干预措施提供更持久的作用窗口。
在本文中，我们概述了一系列已被证实具有有效性的实验方案 Limosilactobacillus reuteri （菌株编号：F275；其他保藏编号：DSM20016、ATCC23272、CIP109823），并整合来自其他来源的该菌株的集中信息，以支持分子生物学与系统生物学应用。本文所述操作步骤可使无先前经验的研究人员成功培养 L. reuteri制备电转感受态菌株，筛选转化子菌落，验证转化结果 通过 菌落聚合酶链式反应（PCR），并测定设计系统的响应 通过 荧光报告蛋白
我们注意到，已有相关方案涵盖了CRISPR-Cas9辅助的ssDNA基因组重组工程 L. reuteri （菌株：ATCC-PTA-6475）14，以及CRISPR-Cas9切口酶辅助的多基因组编辑罗伊氏乳杆菌，乳杆菌科 家族染色15,16；然而，这些并未解决 L. reuteri 我们在此关注的DSM20016菌株。
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方案
1. 制备L. reuteri DSM20016 感受态细胞
注意：本实验方案基于 Berthier 等人17 的方法，离心速度参数参考了 Rattanachaikunsopon 等人.18 的研究。
- 在50 mL离心管中接种 L. reuteri 从甘油菌种中挑取菌落接种至6 mL deMan Rogosa Sharpe（MRS）液体培养基中，于37 °C静置培养箱中需氧培养过夜。
- 次日早晨，将4 mL过夜培养物接种到200 mL MRS肉汤中（1:50稀释）。
- 在37 °C恒温静置培养箱中进行有氧培养，直至600 nm处的光密度值（OD600）达到0.5–0.85；此过程大约需要2–3小时。
- 当达到合适的 OD600 值后，立即将培养基倒入 50 mL 离心管中，置于冰上平衡管重。
- 5,000 × g 离心 5 分钟 g 在预冷的4 °C离心机中。
- 弃去上清液，将每份沉淀重悬于 50 mL 预冷（0 °C 至 4 °C）的 ddH₂O 中2O，并以与上一步相同的条件再次离心。尽可能将细胞保持在冰上。
- 重复步骤 1.6。
- 将每个沉淀重悬于25 mL ddH₂O中2O：0.5 M 蔗糖，10% 甘油。在 5,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞重新置于冰上。
- 将所有沉淀重悬于相同的 2 mL ddH₂O 中2O：0.5 M 蔗糖，10% 甘油。
- 分装至预冷的微量离心管中，每管50 µL至100 µL；于-80 °C保存，以备后续使用。
2. 罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）的电穿孔
注意：以下步骤中应尽量避免移液操作。建议设置一个不添加质粒的对照电穿孔实验，以确保抗生素筛选是有效的。
- 取一整份电转化感受态 L. reuteri 样品，在冰上解冻。
- 将 5 µL 至 10 µL 质粒（最终质粒浓度 >6 nM）轻轻混入已解冻的样品中，尽量避免移液操作。
- 转移至预冷的、间隙为 1 mm 的电穿孔比色皿中。
- 在 1.25 kV、400 Ω 和 25 µF 条件下进行电穿孔。
- 加入 1 mL 室温（RT）MRS 肉汤，通过倒置比色皿一至两次进行混匀。
- 将比色皿放入 37 °C 静态培养箱中孵育 2.5–3 小时，以恢复细胞活性。
- 将全部菌液涂布于多个含适当选择性标记的 MRS 琼脂平板上。
- 将平板放入完全密封的容器中，容器内放置一支点燃的小蜡烛（"tealight"）和一个厌氧环境生成袋。
- 在 37 °C 培养 2–3 天，或直至可见菌落形成。
3. 耐酸荧光报告蛋白 mCherry2 的测定
- 挑选所需测量的菌落，接种于96孔储存微孔板中，每孔加入1.5 mL过滤除菌（非高压灭菌）的MRS肉汤及适当的选择性抗生素。
- 在37 °C下有氧培养24小时，过夜，不振荡。
注意：此储存用微量滴定板应保留用于第4节（菌落PCR）。 - L. reuteri 将在静止期从培养基中沉淀析出；重悬过夜培养物 通过 移液
- 将200 µL转移至平底透明96孔板中，将该板放入酶标仪，测定mCherry2（激发[Ex]：589 nm；发射[Em]：610 nm）或其他相关报告分子的OD值和荧光。
4. 质粒摄取的验证 通过 菌落PCR
- 从第3节的96孔储存微孔板中，转移5 µL至PCR管。
注意：如果>5分钟已过，可能需要再次重悬L. reuteri。 - 在便携式台式微量离心机中离心，直至可见沉淀（约2,000 x g离心2分钟），弃去上清液，并将沉淀重悬于20 µL的20 mM NaOH中。
- 在95 °C下煮沸5分钟，涡旋振荡，再重复煮沸一次。
- 立即冰浴冷却样品；在后续步骤中应尽可能保持样品处于冰上，以降低模板降解和PCR抑制的可能性。
- 在便携式台式微量离心机中以2,000 x g离心2分钟，使细胞碎片沉淀，然后取1 µL上清液，加入99 µL预冷的无DNase和RNase的ddH2O中（进行100倍稀释）。
- 将100倍稀释后的样品作为模板DNA，使用质粒特异性引物进行标准PCR反应。同时设置阳性对照，加入来源于E. coli质粒小量提取物的质粒。
- 将样品放回冰上，并加入适量的上样染料至终浓度为1x。
- 在TAE缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸[EDTA]）中，于1%琼脂糖凝胶中以110 V电泳30分钟。必要时进行成像。
5. 罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）质粒小提方案，随后通过PCR确认质粒的存在
注意：本实验方案旨在与材料表中列出的小量提取试剂盒配合使用。
- 接种 L. reuteri 加入含有适当抗生素的10 mL MRS肉汤中，于37 °C静置培养箱中需氧培养过夜。
- 在 5,000 x g 条件下离心 g 在预冷的4 °C离心机中离心10分钟。
- 用2 mL标准P1缓冲液（试剂盒提供）重悬沉淀 为了消除可能干扰后续步骤的酸性，以先前所述相同条件离心，并弃去上清液。
- 将沉淀重悬于250 µL含有10 mg/mL溶菌酶和100 U/mL溶壁酶的改良P1缓冲液中，以裂解细菌细胞。在37 °C孵育1–2小时。
- 加入250 µL P2缓冲液，通过倒置混匀4至6次，并在室温下孵育不超过5分钟。
- 加入350 µL缓冲液N3（试剂盒中提供），立即轻柔颠倒混匀4至6次。
- 以 10,000 x g 10 分钟。
- 尽可能将上清液转移至离心柱中，于10,000 x g条件下离心 g 60 秒。弃去滤过液。
- 用500 µL PB缓冲液（试剂盒中提供）洗涤离心柱，然后在10,000 x g 60 秒。弃去滤过液。
- 用750 µL的PE缓冲液（试剂盒中提供）洗涤离心柱，然后在10,000 x g 60秒。弃去流出液，再离心60秒以去除残留缓冲液。
- 将离心柱置于一个1.5 mL 微量离心管中。加入20–30 µL无DNA酶和RNA酶的ddH₂O2将溶液加入离心柱的滤膜中，静置1-2分钟，然后在10,000 x g条件下离心。 g 60 秒。
- 使用质粒特异性引物（pTRKH3_pTUSeq_F：CACCCGTTCTCGGAGCA，pTRKH3_pTUSeq_R：CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA）进行标准PCR反应，以洗脱液作为模板DNA。同时设置含有源自该质粒的阳性对照 E. coli 小量制备
注意：本研究中使用的PCR程序为：98 °C 预变性5 min，(98 °C 变性30 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸45 s) 共30个循环，72 °C 最终延伸2 min，4 °C 保存。具体参数高度依赖于使用者所采用的DNA聚合酶、扩增片段长度以及特定引物序列。
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结果
转化效率
L. reuteri 无需使用 dcm-/dam- 非甲基化质粒，这一点与其他 Lactobacillaceae 家族菌株的观察结果一致19,20（见图1）。将10 µL 8.5 kb质粒pTRKH3_mCherry2（含pAMβ1 theta复制起点）通过电穿孔转入L. reuteri DSM20016时，转化效率约为80个菌落形成单位（CFU）/µg（每200 µL涂布量可形成5至8个菌落），且不受质粒甲基化状态的影响。通过选择性消除内源质粒并重新转化，可获得转化效率显著提高的突变型L. reuteri菌株21，使用pTRKH3_mCherry2时转化效率可达约4 × 103 CFU/µg（每200 µL涂布量可形成200–...
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讨论
L. reuteri DSM20016 转化过程中最关键的步骤是在转化子涂布后建立厌氧生长条件；在有氧条件下获得的菌落极为稀少，且通常在接种至MRS肉汤后无法生长。还应将全部恢复体积进行涂布，以最大化菌落生长的概率。即使采取了这两个关键步骤，转化效率仍限制着实验的进行，因为每次转化所获得的预期菌落数量可能每板仅有1至2个（见图1）。
商用食品容器最初被使用，但发现无法为持续的O2 排除。该大学机械车间设计的厌氧舱的CAD文件可在 补充文件 1由于这些箱子有时会因接缝处存在微小间隙而导致空气渗入，建议在首次使用前用水（不密封）填充，以检查是否存在泄漏；通常情况下，后续无需再次检查。这些箱子应具有O2 替代系统而非O2 螯合系统，因为尚未对其进行加压测试。
可能出现培养基问题；高压灭菌的MRS肉汤具有选择性，但具有强烈的自发荧光特性，会干扰低荧光信号的检测...
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致谢
我们非常感谢威斯康星大学麦迪逊分校的 J.P. van Pijkeren 教授提供的宝贵建议，他对使用 L. reuteri ATCC PTA 6475 的指导为本文所述方法奠定了基础。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1 mL 分光光度计比色皿 | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| 琼脂糖 | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R（制冷离心机） | Beckman Allegra | N/A | 已停产 |
| AnaeroGen 2.5 L 厌氧袋 | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX ECM 399 电穿孔系统 | VWR | 58017-984 | |
| 离心管（50 mL） | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA 凝胶上样缓冲液（6×） | NEB | B7024S | |
| 电穿孔比色皿 | Fisherbrand | FB101 | |
| 红霉素 | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| 凝胶电泳槽/电泳装置 | VWR | 76314-748 | |
| 甘油 | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | 菌株编号 F275 |
| 溶菌酶 | BioShop | LYS702.5 | |
| 微量离心管（1.7 mL） | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| 质粒小提试剂盒（Qiagen） | Qiagen | 27106 | slpGFP 被替换为组成型表达、密码子优化的 mCherry2 报告蛋白 |
| MRS 肉汤（脱水培养基） | Thermo Scientific | CM0359B | |
| 溶壁酶 | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 移液器 | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 移液器 | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 移液器 | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 移液器 | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 移液器 | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR 管 | FroggaBio | STF-A120S | |
| 台式微型离心机 | Genlantis | E200100 | |
| 培养皿 | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 梯度 PCR 仪 | MJ Research | N/A | 已停产 |
| pTRKH3_slpGFP（修饰型） | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 分光光度计 | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| 储存用微孔板 | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| 蔗糖 | BioShop | SUC507 | |
| TAE 缓冲液（50×） | Thermo Scientific | B49 | |
| 涡旋振荡器 | VWR | 58816-121 | 已停产 |
| VWR 1500E 培养箱 | VWR | N/A | 已停产 |
参考文献
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