罗伊氏乳酸杆菌电穿孔和转化确认的方法DSM20016

乳酸杆菌属在历史上被归类为革兰氏阳性、杆状、非孢子形成、兼性厌氧菌或微需氧菌，其分解糖主要产生乳酸¹。这些松散的标准导致乳酸杆菌在表型和基因型上是一个极其多样化的属。这种广泛的分类导致该属被重新分类，在 2020 年引入了 23 个新属².

较老的、更广泛的属包括通常被认为可以安全食用的主要共生菌和益生菌物种 （GRAS）³。乳酸杆菌科保持着公众对"好细菌"的看法，因为许多报道通过食用^各种菌株4,5,6,7赋予健康益处。它们在胃肠道中导航的便利性⁸ 和公众的接受度相结合，使乳酸杆菌科菌株成为可摄入药用、治疗或诊断应用的底盘生物的有力候选者。

乳酸杆菌科内存在广泛的特征，导致没有事实上的模式生物菌株的情况;研究小组倾向于选择与其特定目标最相关的物种。（例如，乳品发酵实验室可以选择乳乳杆菌;蔬菜发酵研究可能会选择植物乳杆菌;益生菌研究可能集中在嗜酸乳杆菌上;等等。

跨物种的这种广泛特征导致了协议和程序的积累，这些协议和程序可能对 乳酸杆菌科 的一个子集有效，但需要优化才能在其他亚群中有效工作（或者可能根本起作用）⁹。这种在家族成员之间甚至同一物种的成员内部进行优化的需求可能会挫败不熟悉的研究人员的努力。发表在论文方法部分的协议也可以包括自己的修改¹⁰，导致碎片化，分散的协议集合。

罗伊氏乳杆菌被认为是一种广泛的脊椎动物共生动物，在哺乳动物、鸟类¹¹ 和鱼类¹² 胃肠道 （GI） 中始终存在。罗伊氏乳杆菌亚菌株通常在遗传上特化，通过粘液粘附蛋白适应，更永久地定植特定的天然宿主8,11,13。胃肠道 Limosilactobacillus属可以在其原生宿主以外的宿主中分离出来，但更倾向于短暂性⁸。

由于人类宿主的专业化， 罗伊氏乳杆菌 DSM20016很好地定位为人类胃肠道任何点的诊断或治疗应用的底盘，与更短暂的菌株相比，菌株DSM20016可以为干预提供更持久的效果窗口。

在本文中，我们概述了一系列在 罗伊氏利莫西乳杆菌 （菌株名称:F275;其他收集编号:DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中证明有效的协议，以及来自其他来源的菌株的集中信息，以帮助分子和系统生物学应用。本文列出的程序应使没有先前经验的研究人员能够培养 罗伊氏乳杆菌，创建电感受态储液，选择转化的菌落，通过菌落聚合酶链反应（PCR） 确认 转化，并通过荧光报告蛋白 测量 设计的系统反应。

我们注意到相关协议已经涵盖了罗伊氏乳杆菌（菌株:ATCC-PTA-6475）¹⁴中的CRISPR-Cas9辅助ssDNA基因组重组，以及多个非罗伊氏乳杆菌，乳杆菌科染色剂^15,16的CRSIPR-Cas9切口酶辅助基因组编辑;然而，这些并没有解决罗伊氏乳杆菌DSM20016菌株，这是我们在这里的重点。

1. 制备 罗伊氏乳杆菌 DSM20016电感受态细胞

注意:这是基于Berthier等人¹⁷的协议，离心速度由Rattanachaikunsopon等人告知。¹⁸.

1. 在 50 mL 离心管中，将来自甘油原液的 罗伊氏乳杆菌 接种到 6 mL 的 deMan Rogosa Sharpe （MRS） 肉汤中。在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 第二天早上，将 4 mL 过夜培养物接种到 200 mL MRS 肉汤中（1:50 稀释）。
3. 允许在静态37°C培养箱中有氧生长，直到600nm光密度值（OD 600）达到0.5-0.85;这大约需要2-3小时。
4. 一旦达到足够的OD 600值，将培养基倒入50 mL离心管中，并放在冰上，同时平衡管。
5. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心5分钟。
6. 弃去上清液，将每个沉淀重悬于50mL预冷（0°C至4°C）ddH₂O中，并以与上一步相同的设置再次离心。尽可能将细胞保持在冰上。
7. 重复步骤 1.6。
8. 将每个沉淀重悬于25mL ddH₂O:0.5 M蔗糖，10%甘油中。在4°C下以5,000× g 离心10分钟。弃去上清液并将细胞放回冰上。
9. 将所有沉淀重悬于相同的 2 mL ddH₂O 中:0.5 M 蔗糖，10% 甘油。
10. 在预冷的微量离心管中等分到 50 μL 至 100 μL 份中;储存在-80°C以备后用。

2. 罗伊氏乳杆菌的电穿孔

注意:在以下步骤中尽可能避免移液。建议加入不添加质粒的对照电穿孔，以确保抗生素选择充分。

1. 取整个电能力 罗伊氏乳杆菌 等分试样，在冰上解冻。
2. 将 5 μL 至 10 μL 质粒（最终质粒浓度 >6 nM）轻轻混合到解冻的等分试样中，尽可能避免移液。
3. 转移到冰冷的1毫米间隙电穿孔比色皿中。
4. 在 1.25 kV、400 Ω 和 25 μF 下电穿孔。
5. 加入 1 mL 室温 （RT） MRS 肉汤，将比色皿倒置一次或两次混合。
6. 将比色皿放入37°C的静态培养箱中2.5-3小时以允许恢复。
7. 将全部量接种到多个MRS琼脂平板上，并进行适当的选择。
8. 将盘子放在一个完全密封的容器中，用一根点燃的小蜡烛（"茶灯"）和一个产生厌氧气氛的小袋。
9. 在37°C下生长2-3天或直到存在可见菌落。

3. 耐酸荧光报告蛋白mCherry2的测量

1. 选择测量所需的任何菌落，并接种到96孔储存微孔板中，每孔含有1.5 mL过滤灭菌（非高压灭菌）MRS肉汤和适当选择的抗生素。
2. 在37°C下有氧孵育24小时过夜，不摇动。
   注意:该储存微孔板应保留用于第4节（菌落PCR）。
3. 罗伊氏乳杆菌 在固定相时会从培养基中沉淀出来;通过移液 重 悬过夜培养物。
4. 将 200 μL 转移到平坦、透明底部的 96 孔板中，将板转移到读板器中，并测量 mCherry2（激发 [Ex]:589 nm;发射 [Em]:610 nm）或其他相关报告基因的 OD 和荧光。

4. 通过菌落PCR 确认 质粒摄取

1. 从第 3 节的 96 孔储存微孔板中，将 5 μL 转移到 PCR 管中。
   注意:如果经过>5分钟，可能需要再次重悬罗 伊氏乳杆菌 。
2. 在便携式台式微量离心机中，向下旋转直至可以看到沉淀（在2,000 x g 下约2分钟），弃去上清液，并将沉淀重悬于20μL 20mM NaOH中。
3. 在95°C下煮沸5分钟，涡旋，然后再次重复煮沸。
4. 立即冷却样品;在以下步骤中，尽量将样品保持在冰上，以降低模板降解和PCR抑制的可能性。
5. 在便携式台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 2 分钟，直到细胞碎片沉淀，然后取 1 μL 上清液并稀释到 99 μL 冰冷的 DNase 和 RNase 不含 ddH₂O （100 倍稀释）。
6. 使用质粒特异性引物在标准PCR反应中使用100倍稀释液作为模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
7. 将样品放在冰上，并以1x浓度添加适当的上样染料。
8. 在TAE缓冲液（三乙酸酯-乙二胺四乙酸[EDTA]）中的1%琼脂糖凝胶中以110V运行30分钟。如有必要，图像。

5. 罗伊氏乳杆菌 的小型制备方案，然后进行PCR以确认质粒的存在

注意:用于 材料表中列出的小型制备试剂盒的协议。

1. 将 罗伊氏乳杆菌 接种到含有适当抗生素的10mLMRS肉汤中，并在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心10分钟。
3. 在 2 mL 标准 P1 缓冲液（包含在试剂盒中）中洗涤沉淀以消除可能干扰后续步骤的酸度，以与前面描述的相同设置离心，并弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于含有 10 mg/mL 溶菌酶和 100 U/mL 变溶素的 250 μL 改良 P1 缓冲液中，以裂解细菌细胞。在37°C孵育1-2小时。
5. 加入 250 μL 缓冲液 P2，倒置混合 4-6 次，并在室温下孵育不超过 5 分钟。
6. 加入 350 μL 缓冲液 N3（包含在试剂盒中），并立即轻轻倒置 4 至 6 次以混合。
7. 以10,000 x g 离心10分钟。
8. 将尽可能多的上清液转移到离心柱中，并以10,000 x g 离心60秒。丢弃流过。
9. 用 500 μL 缓冲液 PB（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过。
10. 用 750 μL 缓冲液 PE（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过并离心60秒以除去任何残留的缓冲液。
11. 将离心柱放入 1.5 mL 微量离心管中。将 20-30 μL 不含 DNA 酶和 RNA 酶的 ddH 2 O 施加到离心柱的过滤器中并放置_1-2分钟，然后以 10,000 x g 离心 60 秒。
12. 使用质粒特异性引物（pTRKH3_pTUSeq_F:CACCCGTTCGGAGCA，pTRKH3_pTUSeq_R:CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA）进行标准PCR反应，洗脱液提供模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
    注意:本研究中使用的PCR设置为:98°C5分钟，（98°C30秒，55°C30秒，72°C45秒）30个循环，72°C2分钟，4°C保持。参数高度依赖于所使用的聚合酶、片段长度以及使用该协议的任何人使用的确切引物。

转型效率
罗伊氏乳杆菌不需要dcm-/dam-非甲基化质粒，如其他乳酸杆菌科19,20所观察到的那样（见图1）。无论质粒甲基化条件如何，用 10 μL 8.5 kb 质粒pTRKH3_mCherry2（pAMβ1 theta 复制起源）电穿罗伊氏乳杆菌DSM20016应具有大约 80 个菌落形成单位 （CFU）/μg（每 200 μL 镀板 5 至 8 个菌落）的转化效率。通过选择性固化和再转化，可以获得具有更高转化效率的突变罗伊氏乳杆菌菌株21，观察到pTRKH3_mCherry2约为4 x 103 CFU/μg（每200μL镀200-250个菌落），允许更高通量的应用。报告基因mTFP1也观察到了类似的结果。还用pNZ123（pSH71滚动圆起源）进行了转化，不携带外源组成型报告蛋白，导致转化效率为3 x 104 CFU/μg DNA（补充图1）。

图 1:电穿孔效率。 从两个来源获得总共10 nM pTRKH3_mTFP1和80 nM pTRKH3_mCherry2质粒储备液:DH10β 大肠杆菌 和dcm-/dam- 甲基酶敲除 大肠杆菌。然后用10μL两种不同的甲基化模式质粒电穿孔罗 伊氏乳杆菌 并计数菌落。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。

转型增长条件
罗伊氏乳杆菌 耐空气，可以在正常大气条件下在肉汤和琼脂上生长。然而，转化的成功在很大程度上取决于铺板时厌氧生长环境的产生;这也许是转型成功的最重要条件。O2 泄漏可以通过包括一块未转化的 罗伊氏乳杆菌板来检测。在氧气存在下，菌落形态明显变化（见 图2）;或者，可以使用厌氧指示剂（见 材料表）。

图2: 罗伊氏乳杆菌 菌落形态。 菌落与pTRKH3_mCherry2质粒一起转化。（A）在不正确的低O2 条件下，菌落呈现白色，不透明，光滑，圆形，凸起和有光泽。（B）在部分或泄漏的O2 条件下，菌落呈现白色，不透明，波浪状（波浪形），圆形，伞形（圆形/多节）和有光泽。（C） 罗伊氏乳杆菌 菌落在大气O2 水平下没有质粒转化。菌落看起来不透明或半透明，伞形或扁平;它们总是呈叶状、圆形和干燥。 请点击此处查看此图的大图。

报告蛋白测量
野生型 罗伊氏乳杆菌 DSM20016报告蛋白表达和生长在菌落之间有所不同（见 图3A），使得准确推断系统活性变得困难。可以选择和治愈正确转化的野生型 罗伊氏乳杆菌 DSM20016;再转化可能会产生具有突变的菌株，从而实现更高的转化效率。 通过这种方法开发 的一种菌株在报告蛋白表达方面似乎更稳定（见 图3B）。建议在进行需要调谐蛋白表达的工作之前， 通过 质粒固化和再转化来寻找此类突变。

图 3:转化的 罗伊氏乳杆菌的生长、报告荧光和菌落 PCR 结果。 两个实验都使用80 nM pTRKH3_mCherry2质粒。（一，二）三个子图中每个子图的每一列都指同一菌落的OD值，荧光值（例如:589nm;Em:610 nm）和PCR结果（实心块表示观察到正确的条带）。（A）来自 罗伊氏乳杆菌 的所有菌落DSM20016转化选择（对照转化=零菌落）。菌落在过滤的MRS肉汤中孵育24小时，然后以增益100测量。（B）从 罗伊氏乳杆菌 DSM20016菌株中挑选的总共88个菌落具有更高的转化效率，更一致的报告蛋白生产和更低的PCR抑制（对照转化=零菌落）。菌落在过滤的MRS肉汤中孵育24小时，然后以增益200测量。对照为蓝色，C = 未转化DSM20016细胞对照，M = 过滤的仅 MRS 肉汤培养基对照，误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。

菌落聚合酶链反应
菌落PCR不应用作推断正确转化的唯一方法，因为即使稀释并保持冷冻样品，它们也可能不可靠（见 图4）。如果转化中包含的无质粒对照显示零菌落，则意味着所有菌落都具有携带抗生素耐药性的质粒。但是，如果需要菌落PCR，此处列出的优化条件可以大大提高成功率。

图4:转化的 罗伊氏乳杆菌的菌落PCR。 （A） 罗伊氏乳杆菌 DSM20016菌落筛查PCR阳性条带;获得6个并接种到新鲜高压灭菌的MRS肉汤中。接种后不同时间点采集的 5 μL 样品以指定的稀释水平再次进行 PCR。每个时间/稀释框中的颜色表示PCR回收成功:绿色=观察到正确的条带;红色 = 未观察到波段。（B）固定100倍稀释的结果表明，改变制备温度导致不同的PCR成功率:样品在冰上制备并立即PCR-ed（89.77%），在室温下制备并立即PCR-ed（75%），或在室温下制备，然后在PCR前在37°C下孵育30分钟（27.27%）。（C） （1） 8 个来自 RT 条件下的 100 倍正稀释样品 （R1-8）。（2）在室温下放置48小时后，对样品进行第二次PCR，显示~1.1 kb处没有条带;阳性和阴性对照（泳道 +/-）是 C （2） 中最右侧的泳道。使用的分子量标准为1 kb加上DNA分子量标准，列在 材料表中。 请点击此处查看此图的大图。

罗伊氏乳杆菌 迷你准备
罗伊氏乳杆菌的小型制备是有限的，仅用作替代质粒转化确认方法。之前的出版物指出，一些菌株被变位溶血素22 更有效地裂解;发现双溶菌酶-变位溶血素作用对罗伊氏乳杆菌DSM20016最有效。通过琼脂糖凝胶运行小型制备洗脱液会导致涂片而不是可观察到的条带。然而，随后的PCR应该会产生预期的条带大小（见图5）。

图 5:PCR 和小型制备产物的琼脂糖凝胶电泳。图4A中的相同六个菌落使用本文中规定的方案进行小型制备。（底行）小型洗脱液显示涂片。（上排）使用洗脱液作为DNA模板进行PCR后，观察到清晰的阳性条带。使用的分子量标准为1 kb加上DNA分子量标准，列在材料表中。请点击此处查看此图的大图。

补充图1:罗伊氏乳杆菌DSM20016与pNZ123质粒的转化效率。 用pNZ123（pSH71滚动圆起源）进行的转化，不携带外源性组成报告蛋白。 请点击此处下载此文件。

补充文件1:厌氧室的CAD文件。 表 1:基础图;表2:长壁画;第3页:小壁画;表4:顶部图纸;表5:盖子图;第6页:锁唇画;表7:夹杆图;第8页:夹板图;表9:装配概述;表 10:带有编号部件的概述。 请点击此处下载此文件。

不存在利益冲突。