罗伊氏乳酸杆菌电穿孔和转化确认的方法DSM20016

Summary

在这里，我们提出了使用 罗伊氏利莫西乳杆菌 DSM20016的方案，详细介绍了生长、质粒转化、集落PCR、荧光报告蛋白测量和有限的质粒迷你制备，以及常见问题和故障排除。这些方案允许测量DSM20016中的报告蛋白，或者在没有报告基因的情况下 通过 集落PCR进行确认。

Abstract

乳酸杆菌 是一个令人难以置信的大，多样化的细菌属，包括261种，其中几种是共生菌株，有可能用作胃肠道内合成生物学努力的底盘。在该属内观察到的广泛表型和基因型变异导致最近的重新分类和23个新属的引入。

由于旧属内变异的广度，在一个成员中展示的协议可能无法像其他成员所宣传的那样有效。缺乏关于如何精确操纵特定菌株的集中信息导致了一系列 临时 方法，通常改编自其他细菌家族。对于从该领域开始的研究人员来说，这可能会使事情复杂化，他们可能不知道哪些信息适用于或不适用于他们选择的菌株。

在本文中，我们的目标是集中一组已证明成功的协议，特别是在 罗伊氏利莫西乳杆菌 菌株名称F275（其他收集编号:DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中，以及故障排除建议和可能遇到的常见问题。这些方案应使几乎没有罗 伊氏乳杆菌 DSM20016经验的研究人员能够通过报告蛋白 转化 质粒，确认转化并测量酶标仪中的系统反馈。

Introduction

乳酸杆菌属在历史上被归类为革兰氏阳性、杆状、非孢子形成、兼性厌氧菌或微需氧菌，其分解糖主要产生乳酸¹。这些松散的标准导致乳酸杆菌在表型和基因型上是一个极其多样化的属。这种广泛的分类导致该属被重新分类，在 2020 年引入了 23 个新属².

较老的、更广泛的属包括通常被认为可以安全食用的主要共生菌和益生菌物种 （GRAS）³。乳酸杆菌科保持着公众对"好细菌"的看法，因为许多报道通过食用^各种菌株4,5,6,7赋予健康益处。它们在胃肠道中导航的便利性⁸ 和公众的接受度相结合，使乳酸杆菌科菌株成为可摄入药用、治疗或诊断应用的底盘生物的有力候选者。

乳酸杆菌科内存在广泛的特征，导致没有事实上的模式生物菌株的情况;研究小组倾向于选择与其特定目标最相关的物种。（例如，乳品发酵实验室可以选择乳乳杆菌;蔬菜发酵研究可能会选择植物乳杆菌;益生菌研究可能集中在嗜酸乳杆菌上;等等。

跨物种的这种广泛特征导致了协议和程序的积累，这些协议和程序可能对 乳酸杆菌科 的一个子集有效，但需要优化才能在其他亚群中有效工作（或者可能根本起作用）⁹。这种在家族成员之间甚至同一物种的成员内部进行优化的需求可能会挫败不熟悉的研究人员的努力。发表在论文方法部分的协议也可以包括自己的修改¹⁰，导致碎片化，分散的协议集合。

罗伊氏乳杆菌被认为是一种广泛的脊椎动物共生动物，在哺乳动物、鸟类¹¹ 和鱼类¹² 胃肠道 （GI） 中始终存在。罗伊氏乳杆菌亚菌株通常在遗传上特化，通过粘液粘附蛋白适应，更永久地定植特定的天然宿主8,11,13。胃肠道 Limosilactobacillus属可以在其原生宿主以外的宿主中分离出来，但更倾向于短暂性⁸。

由于人类宿主的专业化， 罗伊氏乳杆菌 DSM20016很好地定位为人类胃肠道任何点的诊断或治疗应用的底盘，与更短暂的菌株相比，菌株DSM20016可以为干预提供更持久的效果窗口。

在本文中，我们概述了一系列在 罗伊氏利莫西乳杆菌 （菌株名称:F275;其他收集编号:DSM20016，ATCC23272，CIP109823）中证明有效的协议，以及来自其他来源的菌株的集中信息，以帮助分子和系统生物学应用。本文列出的程序应使没有先前经验的研究人员能够培养 罗伊氏乳杆菌，创建电感受态储液，选择转化的菌落，通过菌落聚合酶链反应（PCR） 确认 转化，并通过荧光报告蛋白 测量 设计的系统反应。

我们注意到相关协议已经涵盖了罗伊氏乳杆菌（菌株:ATCC-PTA-6475）¹⁴中的CRISPR-Cas9辅助ssDNA基因组重组，以及多个非罗伊氏乳杆菌，乳杆菌科染色剂^15,16的CRSIPR-Cas9切口酶辅助基因组编辑;然而，这些并没有解决罗伊氏乳杆菌DSM20016菌株，这是我们在这里的重点。

Protocol

1. 制备 罗伊氏乳杆菌 DSM20016电感受态细胞

注意:这是基于Berthier等人¹⁷的协议，离心速度由Rattanachaikunsopon等人告知。¹⁸.

1. 在 50 mL 离心管中，将来自甘油原液的 罗伊氏乳杆菌 接种到 6 mL 的 deMan Rogosa Sharpe （MRS） 肉汤中。在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 第二天早上，将 4 mL 过夜培养物接种到 200 mL MRS 肉汤中（1:50 稀释）。
3. 允许在静态37°C培养箱中有氧生长，直到600nm光密度值（OD 600）达到0.5-0.85;这大约需要2-3小时。
4. 一旦达到足够的OD 600值，将培养基倒入50 mL离心管中，并放在冰上，同时平衡管。
5. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心5分钟。
6. 弃去上清液，将每个沉淀重悬于50mL预冷（0°C至4°C）ddH₂O中，并以与上一步相同的设置再次离心。尽可能将细胞保持在冰上。
7. 重复步骤 1.6。
8. 将每个沉淀重悬于25mL ddH₂O:0.5 M蔗糖，10%甘油中。在4°C下以5,000× g 离心10分钟。弃去上清液并将细胞放回冰上。
9. 将所有沉淀重悬于相同的 2 mL ddH₂O 中:0.5 M 蔗糖，10% 甘油。
10. 在预冷的微量离心管中等分到 50 μL 至 100 μL 份中;储存在-80°C以备后用。

2. 罗伊氏乳杆菌的电穿孔

注意:在以下步骤中尽可能避免移液。建议加入不添加质粒的对照电穿孔，以确保抗生素选择充分。

1. 取整个电能力 罗伊氏乳杆菌 等分试样，在冰上解冻。
2. 将 5 μL 至 10 μL 质粒（最终质粒浓度 >6 nM）轻轻混合到解冻的等分试样中，尽可能避免移液。
3. 转移到冰冷的1毫米间隙电穿孔比色皿中。
4. 在 1.25 kV、400 Ω 和 25 μF 下电穿孔。
5. 加入 1 mL 室温 （RT） MRS 肉汤，将比色皿倒置一次或两次混合。
6. 将比色皿放入37°C的静态培养箱中2.5-3小时以允许恢复。
7. 将全部量接种到多个MRS琼脂平板上，并进行适当的选择。
8. 将盘子放在一个完全密封的容器中，用一根点燃的小蜡烛（"茶灯"）和一个产生厌氧气氛的小袋。
9. 在37°C下生长2-3天或直到存在可见菌落。

3. 耐酸荧光报告蛋白mCherry2的测量

1. 选择测量所需的任何菌落，并接种到96孔储存微孔板中，每孔含有1.5 mL过滤灭菌（非高压灭菌）MRS肉汤和适当选择的抗生素。
2. 在37°C下有氧孵育24小时过夜，不摇动。
   注意:该储存微孔板应保留用于第4节（菌落PCR）。
3. 罗伊氏乳杆菌 在固定相时会从培养基中沉淀出来;通过移液 重 悬过夜培养物。
4. 将 200 μL 转移到平坦、透明底部的 96 孔板中，将板转移到读板器中，并测量 mCherry2（激发 [Ex]:589 nm;发射 [Em]:610 nm）或其他相关报告基因的 OD 和荧光。

4. 通过菌落PCR 确认 质粒摄取

1. 从第 3 节的 96 孔储存微孔板中，将 5 μL 转移到 PCR 管中。
   注意:如果经过>5分钟，可能需要再次重悬罗 伊氏乳杆菌 。
2. 在便携式台式微量离心机中，向下旋转直至可以看到沉淀（在2,000 x g 下约2分钟），弃去上清液，并将沉淀重悬于20μL 20mM NaOH中。
3. 在95°C下煮沸5分钟，涡旋，然后再次重复煮沸。
4. 立即冷却样品;在以下步骤中，尽量将样品保持在冰上，以降低模板降解和PCR抑制的可能性。
5. 在便携式台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 2 分钟，直到细胞碎片沉淀，然后取 1 μL 上清液并稀释到 99 μL 冰冷的 DNase 和 RNase 不含 ddH₂O （100 倍稀释）。
6. 使用质粒特异性引物在标准PCR反应中使用100倍稀释液作为模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
7. 将样品放在冰上，并以1x浓度添加适当的上样染料。
8. 在TAE缓冲液（三乙酸酯-乙二胺四乙酸[EDTA]）中的1%琼脂糖凝胶中以110V运行30分钟。如有必要，图像。

5. 罗伊氏乳杆菌 的小型制备方案，然后进行PCR以确认质粒的存在

注意:用于 材料表中列出的小型制备试剂盒的协议。

1. 将 罗伊氏乳杆菌 接种到含有适当抗生素的10mLMRS肉汤中，并在静态培养箱中于37°C有氧孵育过夜。
2. 在预冷的4°C离心机中以5,000× g 离心10分钟。
3. 在 2 mL 标准 P1 缓冲液（包含在试剂盒中）中洗涤沉淀以消除可能干扰后续步骤的酸度，以与前面描述的相同设置离心，并弃去上清液。
4. 将沉淀重悬于含有 10 mg/mL 溶菌酶和 100 U/mL 变溶素的 250 μL 改良 P1 缓冲液中，以裂解细菌细胞。在37°C孵育1-2小时。
5. 加入 250 μL 缓冲液 P2，倒置混合 4-6 次，并在室温下孵育不超过 5 分钟。
6. 加入 350 μL 缓冲液 N3（包含在试剂盒中），并立即轻轻倒置 4 至 6 次以混合。
7. 以10,000 x g 离心10分钟。
8. 将尽可能多的上清液转移到离心柱中，并以10,000 x g 离心60秒。丢弃流过。
9. 用 500 μL 缓冲液 PB（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过。
10. 用 750 μL 缓冲液 PE（包含在试剂盒中）洗涤离心柱，并以 10,000 x g 离心 60 秒。丢弃流过并离心60秒以除去任何残留的缓冲液。
11. 将离心柱放入 1.5 mL 微量离心管中。将 20-30 μL 不含 DNA 酶和 RNA 酶的 ddH 2 O 施加到离心柱的过滤器中并放置_1-2分钟，然后以 10,000 x g 离心 60 秒。
12. 使用质粒特异性引物（pTRKH3_pTUSeq_F:CACCCGTTCGGAGCA，pTRKH3_pTUSeq_R:CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA）进行标准PCR反应，洗脱液提供模板DNA。包括一个阳性对照，其中包含源自 大肠杆菌 迷你制备的质粒。
    注意:本研究中使用的PCR设置为:98°C5分钟，（98°C30秒，55°C30秒，72°C45秒）30个循环，72°C2分钟，4°C保持。参数高度依赖于所使用的聚合酶、片段长度以及使用该协议的任何人使用的确切引物。

Results

转型效率
罗伊氏乳杆菌不需要dcm^-/dam^-非甲基化质粒，如其他乳酸杆菌科^19,20所观察到的那样（见图1）。无论质粒甲基化条件如何，用 10 μL 8.5 kb 质粒pTRKH3_mCherry2（pAMβ1 theta 复制起源）电穿罗伊氏乳杆菌DSM20016应具有大约 80 个菌落形成单位 （CFU）/μg（每 200 μL 镀板 5 至 8 个菌落）的转化效率。通过选择性固化和再转化，可以获得具有更高转化效率的突变罗伊氏乳杆菌菌株²¹，观察到pTRKH3_mCherry2约为4 x 10³ CFU/μg（每200μL镀200-250个菌落），允许更高通量的应用。报告基因mTFP1也观察到了类似的结果。还用pNZ123（pSH71...

Discussion

罗伊氏乳杆菌DSM20016转化的最关键步骤是转化后产生厌氧生长条件;在有氧条件下获得的菌落只是非常偶然的，并且在接种MRS肉汤中时通常无法生长。还应练习对整个回收体积进行铺板，以最大限度地提高菌落生长的可能性。即使有这两个关键步骤，转化效率仍然是实验的限制，因为在转化过程中，预期的菌落数量可能低至每个板一个或两个（见图1）。

最初使用商业食品容器，发现不足以一致地排除O₂。由大学机械车间设计的厌氧室的CAD文件可以在补充文件1中找到。由于这些盒子偶尔会通过细木工的小缝隙渗入空气，因此建议在首次使用前用水（未密封）填充它们以检查是否有任何泄漏;通常不需要后续检查。这些箱子应该有O 2替换系统，而不是O₂隔离系统，因为它们没有经过加压测试。

可能会出现媒体问题;高压灭菌的MRS肉汤具有选择性，但具有高度的自发荧光特性，阻碍了低荧光读数的测量。修改使用过滤...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA 分子量标准	NEB	N3200L
1mL 分光光度计比色皿	Thomas Scientific	1145J12
琼脂糖	BioShop	AGR001
Allegra X-15R （冷冻离心机）	Beckman Allegra	N/A	已停产
AnaeroGen 2.5 L 小袋	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX、ECM 399 电穿孔系统	VWR	58017-984
离心管 （50 mL）	FroggaBio	TB50-500
DNA 凝胶 x6 上样染料	NEB	B7024S
电穿孔比色皿	Fisherbrand	FB101
红霉素	Millipore Sigma	E5389-5G
凝胶电穿孔浴/码头	VWR	76314-748
甘油	BioShop	GLY001
罗伊氏利莫乳杆菌	布尼茨研究所 DSMZ	DSM20016	名称 F275
溶菌酶	BioShop	LYS702.5
微量离心管 （1.7 mL）	FroggaBio	LMCT1.7B
小量制备试剂盒 （Qiagen）	Qiagen	27106	slpGFP 替换为组成型、密码子优化的 mCherry2 报告基因蛋白质
MRS 肉汤（干粉）	Thermo Scientific	CM0359B
变溶菌素	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma 1064691000
P100移液器	Eppendorf	3123000047
P1000移液器	Eppendorf	3123000063
P2.5	Eppendorf	3123000012
P20	Eppendorf	3123000039
P200	Eppendorf	3123000055
PCR管	FroggaBio	STF-A120S
个人台式微量离心机	Genlantis	E200100
培养皿	VWR	25384-088
PTC-150 热循环仪	MJ Research	N/A	已停产
pTRKH3_slpGFP （修改）	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 分光光度计	ThermoScientific	840-281700
储存微孔板	Fisher Scientific	14-222-225
蔗糖	BioShop	SUC507
TAE 缓冲液 50x	Thermo Scientific	B49
涡旋	VWR	58816-121	已停产
VWR 1500E 培养箱 VWR N		/A	已停产