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方法文章

利用细胞周期同步性丧失特征模型对同步化时间序列数据进行对齐以实现跨实验比较

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DOI：

10.3791/65466

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2023年6月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

本文内容

摘要

分析同步时间序列实验的一个挑战在于，不同实验在同步恢复时长和细胞周期周期上往往存在差异。因此，来自不同实验的测量数据无法进行整体分析或直接比较。本文中，我们描述了一种用于对齐实验的方法，以实现特定相位的比较。

摘要

研究细胞周期通常依赖于将细胞群体同步化，以便在细胞经历细胞周期的过程中，对一系列时间点上的各种参数进行测量。然而，即使在相似的条件下，重复实验在恢复同步所需的时间以及完成细胞周期所需的时间上仍存在差异，从而导致无法在每个时间点进行直接比较。当涉及影响同步恢复时间或/和细胞周期时长的突变细胞群体或不同培养条件时，跨实验比较动态测量结果的问题会进一步加剧。

我们此前发表了一种名为“细胞周期同步性丢失表征”（Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony, CLOCCS）的参数化数学模型，该模型用于监测同步化的细胞群体如何从同步状态释放并逐步推进通过细胞周期。通过该模型获得的拟合参数，可将同步时间序列实验中的实验时间点转换为标准化的时间尺度（即生命线时间点，lifeline points）。该生命线尺度并不表示自实验开始以来经过的分钟数，而是反映细胞从同步状态进入细胞周期，并依次经历各细胞周期时相的进程。由于生命线时间点对应于同步化群体中平均细胞所处的时相，这一标准化时间尺度使得不同实验之间可进行直接比较，包括那些具有不同周期长度和恢复时间的实验。此外，该模型已被用于整合不同物种间的细胞周期实验（例如 Saccharomyces cerevisiae 与 Schizosaccharomyces pombe），从而实现细胞周期测量结果的直接比对，有助于揭示细胞周期在进化上的相似性与差异性。

引言

对同步化细胞群体在细胞周期进程中进行的时间序列测量，是研究控制细胞周期进程机制的标准方法1,2,3,4,5,6,7,8在不同时期同步/释放的时间序列实验之间进行比较的能力，对于我们理解这些动态过程至关重要。通过重复实验来验证研究结果，可以提高结论可重复性的可信度。此外，不同环境条件之间、不同突变体之间，甚至不同物种之间的比较，能够揭示细胞周期调控的诸多新见解。然而，实验间在同步恢复过程及细胞周期进程速度上的差异，会削弱在重复实验之间或细胞周期时间发生改变的不同实验之间进行时间点对时间点比较的能力。由于这些挑战，完整的重复实验往往未被纳入整个时间序列分析（例如 Spellman 等人）。4）。当收集完整个时间序列的重复实验数据后，这些数据无法进行汇总分析，而通常仅使用其中一个重复进行分析，其余重复则常被归入补充图中（例如，Orlando 等人）。8）。此外，对于具有不同恢复特性或细胞周期进程特性的实验，进行比较十分困难。如果能够追踪这些标志性事件，测量感兴趣事件与细胞周期标志点（例如芽体出现、S期进入或后期起始）之间较短的时间间隔，则有助于减少误差1,2,3,9,10,11,12然而，使用这些方法时，一些细微但重要的差异可能仍未被发现或被掩盖 临时的 方法。最后，单细胞分析能够用于研究细胞周期进程，而无需依赖同步化或比对方法13尽管在单细胞研究中进行大规模测量可能具有挑战性且成本较高。

为克服这些困难，我们开发了细胞周期同步性丢失表征（Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony, CLOCCS）模型，以辅助分析对同步化细胞群体进行的时间序列测量数据14,15。CLOCCS 是一种灵活的数学模型，用于描述同步化细胞在解除同步后，其在细胞周期各时相中的分布情况。该模型采用分支过程框架，能够描述细胞分裂后母细胞与子细胞之间的不对称特性，如在 S. cerevisiae 中所观察到的现象，同时也适用于通过裂殖方式分裂的生物体，例如 S. pombe。该模型可接受多种类型的测量数据作为输入，以确定细胞所处的细胞周期时相。模型可纳入芽殖细胞周期时相数据，包括随时间变化的出芽细胞百分比测量值，从而估算处于非未出芽G1期以外的细胞数量14,15。模型还可纳入流式细胞术测得的DNA含量数据，从而评估从G1期到S期、S期到G2期以及M期到G1期等关键阶段的转变15。荧光形态标记也可用于识别细胞周期时相。通过荧光标记肌球蛋白环、细胞核以及纺锤极体（SPBs），可确定细胞所处的细胞周期时相，这些参数已被整合至CLOCCS模型中11；然而，本实验方案中将不描述此类测量方法。此外，隔膜形成指数（septation index）也被用作建模 S. pombe 数据的输入参数14。因此，该模型可用于多种生物体的细胞周期分析，并具备进一步扩展的潜力。

CLOCCS 是一种参数化模型，可基于输入数据（例如出芽百分比、DNA 含量）对多个参数进行完整的贝叶斯推断。这些参数包括细胞同步后的恢复时间、细胞周期长度（分别对母细胞和子细胞独立估计），以及每个时间点细胞的平均细胞周期位置。这些参数代表了群体中平均细胞的行为，使研究人员能够将每个时间点映射到以生命线点（lifeline point）表示的细胞周期位置。转换为生命线点依赖于 CLOCCS 参数 lambda（λ）和 mu0（µ0）14,15。参数 λ 对应母细胞的平均细胞周期长度。然而，由于母细胞与子细胞之间存在时间延迟14,15，该值并不等于包含母细胞和子细胞的整体群体的平均细胞周期长度。CLOCCS 还推断参数 delta（δ），该参数对应母-子细胞延迟，从而可用于计算整个群体的平均细胞周期长度。最后，由于每个实验均在细胞周期同步释放后开始，因此同步方法所需的恢复时间由 CLOCCS 参数 µ0 表示。CLOCCS 将模型拟合至输入的细胞周期时相数据，并利用随机游走马尔可夫链蒙特卡洛算法推断这些参数14,15。通过将多个实验映射到统一的细胞周期生命线时间尺度上，可在重复实验或恢复时间、细胞周期长度不完全相同的不同实验之间进行直接的时相特异性比较8,14,15。

在时间序列过程中，同步化的群体以一定速率失去同步性14,15,16,17，而同步性丧失速率的变异性也可能阻碍不同实验之间的定量比较。通过识别群体的位置及其分布的方差，CLOCCS 能够校正同步性丧失速率的差异。这一强大工具支持在不同实验间进行特异且详细的比较，从而不仅能够在重复实验之间，还能在不同环境条件、突变体乃至细胞周期时序差异显著的物种之间直接开展相关比较14,15。

本文介绍了一种利用CLOCCS的方法，通过拟合同步化/释放时间序列实验的数据来估计参数，将数据映射到一个共同的生命线尺度，并在重复实验或不同实验之间进行相关比较。生命线对齐使得在这些实验之间能够进行直接的、特定阶段的比较，从而实现重复实验数据的整合与比较，并能够在具有不同恢复时间和细胞周期长度的实验之间进行更有意义的比较。

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方案

1. 收集细胞周期时相和实验数据

  1. 使用所需的同步化方法对细胞进行细胞周期同步（例如，如 Leman 等人18所述的离心淘析法，或如 Rosebrock19所述的交配信息素阻滞法；Leman 等人18和 Rosebrock19均提供了从同步状态释放的方法）。开始在整个时间序列中取样，确保时间序列至少包含两个完整的细胞周期，理想情况下每个细胞周期采集至少10个样本。在每个时间点，分别采集用于细胞周期时相数据（出芽或流式细胞术）和实验数据的样本，具体如下所述。
  2. 若使用出芽数据作为细胞周期时相数据，则采集用于 CLOCCS 对齐的出芽数据。
    1. 在整个时间序列中进行取样。在每个时间点收集细胞，并按照 Leman 等人18所述方法，将200 µL超声处理后的细胞培养物与200 µL固定液混合，以固定细胞。
    2. 对于标准出芽分析，使用40倍物镜的透射光显微镜和血细胞计数板，对每个时间点至少计数200个细胞。将步骤1.2.1中的细胞样品加入血细胞计数板，若密度过高影响计数，则进行稀释。记录每个时间点的出芽细胞和未出芽细胞数量。计算出芽细胞百分比，并绘制出芽曲线图。
      注：其他指定细胞周期时相信息的方法也可使用，但本方案未予描述。其他方法详见 CLOCCS 使用说明文件及先前研究11。
  3. 若使用流式细胞术DNA含量数据作为细胞周期时相数据，则采集用于流式细胞术CLOCCS对齐的DNA染色数据。
    1. 在整个时间序列中进行取样。在每个时间点收集细胞，并按照 Haase 和 Reed20所述方法进行固定。
    2. 对DNA进行染色，并使用标准流式细胞术分析方法进行分析。针对S. cerevisiae的推荐染色方案见 Haase 和 Reed20。
  4. 采集相关的组学或其它实验数据。对于标准转录组数据，采集方法参见 Leman 等人18以及 Kelliher 等人21,22。确保实验数据与包含细胞周期时相数据的时间点相对应，以便进行后续对齐。为实现最佳对齐效果，应确保每个包含实验数据的时间点均配有相应的时相数据。
    ​注：实验数据可呈现多种形式。传统上，我们使用本方案所述方法对时间序列转录组实验进行对齐。然而，任何与时间点相关联的数据类型均可进行对齐（例如蛋白质组学22）。

2. 安装所需软件

注意：本节假设已安装 Conda、Java 19 和 Git（材料表）。

  1. 在终端中输入以下命令，下载 CLOCCS_alignment 代码库：
    git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. 在克隆 CLOCCS_alignment 代码库的文件夹中，通过在终端输入以下命令，使用 conda_req.yml 文件创建 Conda 环境：
    conda env create -f conda_req.yml

3. 使用 CLOCCS 对实验进行参数化

  1. 双击 CLOCCS_alignment 仓库中 CLOCCS 文件夹内的 cloccs_v2023.jar 文件，等待图形用户界面打开。该界面用于输入 CLOCCS 运行的选项，并在运行后显示结果。
  2. 输入常规设置。
    1. 设置 模拟退火，烧入，以及 迭代 通过在相应的文本输入框中键入内容。 模拟退火 （模拟退火）可确定良好的初始参数值， 烧伤 搜索后验分布的众数，并且 最终阶段 可支持所有后验推断的得出。较高的取值会增加运行时间，但也会提高准确性。
    2. 通过指定实验条件输入实验参数 温度 在 摄氏度 以及 同步方法 使用标记为的文本框 温度 以及下拉菜单 同步器. 方法分别。
    3. 可选地 配置高级设置 高级设置菜单高级设置允许为每个参数设置先验值（"mu0", "sigma0", "sigmav", "λ", "芽开始", "芽尖").
      注意：有关高级设置的更多信息，请参见 CLOCCS_alignment 仓库中 CLOCCS 文件夹内的 readme.txt 文件。
  3. 输入用于芽殖数据的设置。
    1. 选择适当的选项 模型类型 下拉菜单。默认选项 芽 用于芽殖酵母出芽的标准信息。
      注意：下拉菜单中还提供其他更高级的选项： 突变体 对于经历多次出芽周期而不分裂的突变体，获取其出芽相关信息， BudSSLSMR 获取芽殖相关信息，以及额外的纺锤极体和肌球蛋白环信息，并 BudNucDivNeck 用于获取出芽信息以及额外的分裂和芽颈核信息。这些高级选项在 CLOCCS 自述文件和先前的研究中有详细描述。11,14,15.
    2. 使用以下方法导入数据 数据导入面板 通过在文本输入框中键入内容，或通过点击按钮上传文件 选择文件 按钮。第一列指定时间点。其余两列指定出芽数据，可采用以下任一选项：未出芽细胞的数量（无芽体），出芽细胞的数量（芽），或细胞总数（总计).
  4. 输入用于流式细胞术数据分析的设置。每个实验均需运行 或者 步骤 3.3 或步骤 3.4
    注意：流式细胞术数据和出芽数据可结合使用。尽管此前我们描述过将二者同时进行15对于此工具，必须分别运行，然后进行比较。
    1. 按照说明将 .fcs 文件转换为适用于流式细胞术的正确 CLOCCS 输入格式 补充文件 1 （也可在 CLOCCS_alignment 仓库中的 CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt 处找到）。
    2. 选择 流 选择自 模型类型 下拉菜单
    3. 使用以下方法导入数据 数据导入面板. 点击 选择文件，选择在步骤 3.4.1 中生成的文件。
    4. 选择需要绘制流式细胞术CLOCCS拟合图的时间点，通过在 拟合时间 盒子
  5. 在为芽殖或流式细胞术选择完所有输入参数后，单击 应用 按钮，然后单击 样本 屏幕顶部的按钮。
  6. 选择查看预测拟合结果的出芽曲线或流式细胞术图谱 预测拟合 标签。此标签在上一步完成后将默认立即打开。
  7. 通过选择查看每个参数的参数直方图 参数直方图 选项卡，然后从以下选项中选择与目标参数对应的子选项卡： mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, 芽起始, 芽结束等。
  8. 通过选择查看后验得分图 后侧评分 表。
  9. 查看设置，并通过选择进一步修改它们 设置 标签；通过选择查看之前运行的日志 日志 表。
  10. 从拟合结果中选择以获取 CLOCCS 参数 后部参数 表格的最终形式如下：每一行对应一个参数，最后一行为后验结果。各列分别表示参数的均值预测值、2.5% 下限置信区间、97.5% 上限置信区间以及接受率。
    1. 记录每次实验比对所用的参数： 同步恢复时间（µ0) 以及 母细胞的平均细胞周期时长（λ）.
    2. 计算 细胞周期时长 通过计算 平均值 的 母细胞期 (λ）和 子细胞周期（λ + δ），其中 δ 是 子代特异性延迟.
      ​注意：将第3节步骤重复用于所有需纳入比较的实验。

4. 使用 Python 转换函数和 CLOCCS 参数将时间点转换为生命线点

注意：时间点与生命线点之间的转换需要两个转换公式21。转换及数据可视化的 Python 实现可在 CLOCCS_alignment 仓库中获取，具体描述如下。

  1. 在终端中输入以下命令以激活 Conda 环境：conda activate CLOCCS_alignment
  2. 在终端中输入以下命令以打开交互式 Python 笔记本：jupyter notebook
  3. 在目标文件夹中创建一个新的 Python 笔记本。
    注意：示例笔记本已提供，用于演示标准用法，可在 CLOCCS_alignment 代码仓库的 Alignment/JOVE_example.ipynb 中找到。
  4. 在第一个代码单元格中运行以下命令，导入包含比对函数的 Python 文件：
    ​%run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
    1. 将 path_to_repo 替换为 CLOCCS_alignment 代码仓库的实际路径。
  5. 若使用出芽数据作为细胞周期时相数据，请在新单元格中运行以下命令，导入包含各时间点出芽百分比的数据框：
    ​budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. 替换为正确的文件路径和文件名。如果文件为 .csv 格式，请移除 sep ="\t"。
  6. 若使用出芽数据作为细胞周期时相数据，请在新单元格中输入以下函数，将出芽数据对齐到生命线点时间尺度：
    ​aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, timepoints, param_mu0, param_lambda)
    1. 对于 timepoints，请替换为将成为 budding_df 数据框索引的时间点列表。
    2. 对于 param_mu0 和 param_lambda，请替换为第 3 节中针对该实验的出芽数据 CLOCCS 运行所学习得到的参数。
  7. 若使用流式细胞术数据，请在新单元格中运行以下命令导入流式细胞术数据：
    ​flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. 对于 flow_input_folder，请替换为包含流式细胞术 .fcs 文件的文件夹的正确路径。
  8. 若使用流式细胞术数据，请在新单元格中输入以下命令，为每个实验生成时间点与生命线点之间的转换表：
    ​flow_converter = convert_tp_to_ll(timepoints, param_mu0, param_lambda)
    1. 对于 timepoints，请替换为流式细胞术数据中的时间点列表。
    2. 对于 param_mu0 和 param_lambda，请替换为第 3 节中针对该实验的流式细胞术 CLOCCS 运行所学习得到的参数。
  9. 在新单元格中运行以下命令，将包含实验数据的数据框导入笔记本：
    ​data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. 替换为正确的文件路径和文件名。如果文件为 .csv 格式，请移除 sep ="\t"。
      注意：此操作适用于任何表格数据。实验数据只需将时间点作为数据框的列或索引即可。示例数据可在 CLOCCS_alignment 代码仓库中找到。
  10. 在新单元格中输入以下函数，将实验数据对齐到生命线点时间尺度：
    ​lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. 对于 timepoints，请替换为上一步中实验数据 data_df 的索引或列所对应的时间点列表。
    2. 对于 param_mu0 和 param_lambda，请替换为第 3 节中通过 CLOCCS 获得的参数值。
      注意：这些参数可来自针对任何被接受的细胞周期时相数据类型所执行的任意 CLOCCS 运行。
    3. 可选地，将 interpolate 替换为 True 或 False，或留空（默认为 False）。
      注意：当设置为 False 时，数据不会进行插值。当设置为 True 时，生命线点将被四舍五入并进行插值，以填充生命线点之间的数值，使得在生命线点范围内每个整数均有一个数据点。这有助于不同数据集之间的比较。
    4. 可选地，将 lowerll 和 upperll 替换为 None 或 整数值。
      ​注意：当设置为 None 时，插值后的所有生命线点均被保留。当提供 整数 时，数据将被截断，使得生命线点范围从 lowerll 到 upperll。这允许对具有不同 lowerll 或 upperll 的数据集进行比较。
  11. 在新单元格中输入以下命令，下载对齐至生命线点的数据集：lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. 对所有需参与比较的实验重复执行步骤 4.5 至 4.11。

5. 比较出芽曲线与流式细胞术数据

  1. 使用 Python 工具函数在对齐前绘制出芽曲线，方法是在新单元格中输入以下命令：
    ​plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
    1. 将 list_of_budding_curves 替换为包含所有待绘制出芽曲线数据框的列表，例如 [bud_df1, bud_df2, bud_df3]。
    2. 如需，将 leg_list 替换为图例标签列表，例如 [实验 1, 实验 2, 突变体]；若不需要，则省略或替换为None。
    3. 将 str_type 替换为time。
    4. 如需，将 str_title 替换为字符串标题比较出芽曲线；若不需要，则替换为None或省略。
  2. 使用 Python 工具函数在对齐后绘制出芽曲线，操作方法同步骤 5.1，但将 list_of_budding_curves 替换为一组aligned出芽曲线，并将 point_type 设置为lifeline而非time。
  3. 为绘制流式细胞术数据，请使用步骤 4.8 中生成的转换器，绘制 .fcs 文件中对应于 lifeline 时间点的相关数据。
  4. 利用转换表（表 1）将 lifeline 时间点转换为细胞周期阶段。
    ​注意：也可按照步骤 5.1 的说明进行绘图，但将 point_type 设置为phase而非time。

6. 比较实验数据

  1. 根据文献信息或研究关注的基因，确定用于绘制折线图的基因列表。
  2. 在 Python 工具文件中使用提供的 plot_linegraph_comparison 函数，通过在新单元格中输入以下命令，对原始数据、对齐后的数据或对齐并插值后的数据框进行折线图比较：
    ​plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
    1. 将待比较实验的数据框列表代入 list_of_dfs。
      注意：数据框可以未对齐或已对齐；但相应的 point_type 必须在步骤 6.2.4 中正确输入。
    2. 将每个数据框对应的标题列表按与数据框列表相同的顺序代入 list_for_legend。
    3. 将待绘制的基因名称列表（这些基因名称必须包含在数据框的索引中）代入 genelist。
    4. 为 str_type 指定点类型。对于步骤 6.2.1 中的对齐数据框，使用 lifeline（默认为 lifeline 点刻度）或 phase（细胞周期相位 lifeline 刻度）；对于步骤 6.2.1 中的未对齐数据框，使用 time。
    5. 可选地为 str_title 指定一个字符串标题。
  3. 利用文献或算法确定最显著的周期性基因，以决定热图中包含的基因列表。
    注意：为实现有效的热图比较，数据应在步骤 6.2 中完成对齐、插值和时间尺度调整；每个实验的数据应具有相同的起始和终止 lifeline 值。
    1. 运行周期性算法以识别最显著的周期性基因23,24，或使用其他期望的方法（例如基于文献结果）确定基因列表。
    2. 在新单元格中使用以下命令将 .csv 或 .tsv 基因列表文件导入笔记本：
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. 替换为适当的文件路径和文件名。如果文件为 .csv 格式，请移除 sep="\t"。
  4. 在 Python 工具文件中使用提供的函数 plot_heatmap_comparison，通过在新单元格中输入以下命令，对已对齐、插值并完成相位对齐的数据框进行热图比较：
    ​plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
    1. 将待比较实验的已对齐数据框列表代入 list_of_dfs。
    2. 将每个数据框对应的标题列表按与数据框列表相同的顺序代入 list_for_legend。
    3. 将待绘制的基因名称列表（这些基因名称必须包含在数据框的索引中）代入 genelist。
    4. 可选地为 str_title 指定一个字符串标题。
      注意：列表中的第一个数据框将用于确定热图中基因的排序顺序。基因将根据该数据框中第一个周期内的最大值进行排序，并且后续数据框将沿用相同的排序。

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结果

上述方案及图1工作流程中所述步骤应用于五个细胞周期同步的时间序列实验，以展示两种具有代表性的比较：不同同步方法（交配信息素与离心淘析18）和测序平台（RNA测序 [RNA-seq] 与微阵列）之间的重复样本比较，以及不同实验条件间的比较。多个实验均使用S. cerevisiae进行， 并为每个实验收集了细胞周期时相和实验数据。该工作流程包括利用CLOCCS对各种同步/释放时间序列实验进行参数化，使用这些参数将实验对齐到一个共同的可比生命线尺度，并基于这些对齐后的实验进行两种代表性比较。

为展示重复实验间的代表性比较，我们选取了在相同菌株和相同实验条件下进行的三个实验，称为条件1。其中两个实验互为直接重复，并均已被分析 通过 微阵列分析与同步化 通过 离心淘析。第三个实验采用RNA-seq分析并进行同步化处理 通过 α因子交配信息素阻滞。为展示跨实验的第二种比较，即细胞周期时长不同的情况，将上述条...

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讨论

本文介绍了一种更准确、更定量地评估细胞同步群体时间序列实验数据的方法。该方法利用了CLOCCS（一种贝叶斯推断模型）中学习得到的参数，该模型输入细胞周期时相数据（如出芽数据和流式细胞术DNA含量数据），用于对每个实验进行参数化14,15。CLOCCS利用输入的细胞周期时相数据推断每个实验的参数，然后将这些参数用于对齐到一个共同的生命线尺度。将多个同步/释放时间序列实验转换为统一的生命线对齐时间尺度，使得实验之间能够进行特定时相且有意义的比较，并实现多个重复实验的数据整合，而这些在以往难以甚至无法完成。

本方案的关键步骤包括收集数据、运行CLOCCS、对齐数据集以及在不同数据集之间进行比较。首先，必须收集适用于本方案的数据。这些数据必须同时包含实验数据（即与研究问题相关的信息，如转录组数据、基因表达数据、蛋白质组数据）和细胞周期时相数据（即关于细胞周期所处阶段的信息，如出芽数据、流式细胞术测定的DNA含量数据）。随后，可将细胞周期时相数据用于CLOCCS中，以获取每个...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

S. Campione 和 S. Haase 获得了美国国家科学基金会（DMS-1839288）和美国国立卫生研究院（5R01GM126555）的资助。此外，作者感谢周华瑞（杜克大学）对稿件提出的修改意见以及对本实验方案的测试。我们还感谢 Francis Motta（佛罗里达大西洋大学）和 Joshua Robinson 在 Java 代码方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2x PBS用于固定液。参见 Leman 2014。
4% 甲醛用于固定液。
100% 乙醇用于流式细胞术固定。参见 Haase 2002。
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
流式细胞仪用于流式细胞术实验方案。
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
显微镜用于细胞和芽体计数。
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
蛋白酶溶液用于流式细胞术实验方案。参见 Haase 2002。
RNase A 溶液用于流式细胞术实验方案。参见 Haase 2002。
SYTOX Green 核酸染料InvitrogenS7020用于流式细胞术染色。参见 Haase 2002。
TrispH 7.5

参考文献

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

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