使用表征细胞周期同步损失模型进行跨实验比较的同步时间序列数据比对

Summary

分析同步时间序列实验的一个挑战是，实验在同步恢复时间和细胞周期周期方面通常不同。因此，来自不同实验的测量结果无法汇总分析或轻松比较。在这里，我们描述了一种对齐实验的方法，以便进行特定于阶段的比较。

Abstract

研究细胞周期通常取决于同步细胞群，以测量细胞遍历细胞周期时时间序列中的各种参数。然而，即使在类似的条件下，重复实验也显示出从同步恢复和穿越细胞周期所需的时间差异，从而阻止了每个时间点的直接比较。在突变群体或影响同步恢复时间和/或细胞周期的替代生长条件下，比较实验动态测量的问题会加剧。

我们之前发表了一个名为表征细胞周期同步损失（CLOCCS）的参数数学模型，该模型监测同步细胞群如何从同步释放并通过细胞周期进行。然后，可以使用从模型中学习到的参数将同步时间序列实验中的实验时间点转换为归一化的时间尺度（生命线点）。生命线量表不是代表从实验开始到几分钟经过的时间，而是代表从同步到细胞周期进入，然后通过细胞周期的各个阶段的进展。由于生命线点对应于同步群体中平均细胞的阶段，因此这种归一化的时间尺度允许在实验之间进行直接比较，包括具有不同周期和恢复时间的实验。此外，该模型已被用于对齐不同物种（例如， 酿酒 酵母和 庞贝裂殖酵母）之间的细胞周期实验，从而能够直接比较细胞周期测量，这可能会揭示进化的相似性和差异性。

Introduction

在细胞周期中同步进行的时间序列测量是研究控制细胞周期进程机制的标准方法¹，²，³，⁴，⁵，⁶，^7，8.跨同步/发布时间序列实验进行比较的能力对于我们理解这些动态过程至关重要。使用重复实验来证实研究结果可以增加结论可重复性的信心。此外，环境条件之间、突变体之间甚至物种之间的比较可以揭示许多关于细胞周期调控的新见解。然而，从同步恢复和细胞周期进展速度的实验间变异性损害了在重复之间或在改变细胞周期时间的实验之间进行时间点到时间点比较的能力。由于这些挑战，重复通常不包括在完整的时间序列中（例如，Spellman等^人4）。当收集整个时间序列的重复时，无法汇总分析数据，而是使用单个重复进行分析，而其他重复通常降级为补充数字（例如，Orlando et ^al.8）。此外，具有不同回收率或细胞周期进展特征的实验之间的比较是困难的。如果^跟踪这些标志物事件，则测量感兴趣的事件和细胞周期标志物之间的较小间隔（例如，芽出现，S期进入或后期发作）可以帮助减少误差1，²，³，⁹，^10，11，12。但是，使用这些临时方法，细微但重要的差异可能仍未被发现或模糊。最后，单细胞分析允许在不依赖同步或比对的情况下分析细胞周期进程¹³，尽管单细胞研究中的大规模测量可能具有挑战性且成本高昂。

为了克服这些困难，我们开发了表征细胞周期同步损失（CLOCCS）模型，以帮助分析对同步群体进行的时间序列测量^14，15。CLOCCS是一种灵活的数学模型，它描述了同步细胞在细胞周期阶段中的分布，因为它们在细胞周期中从同步中释放并取得进展。分支过程框架使该模型能够解释母细胞和子细胞分裂后的不对称质量 ，如酿酒酵母 所观察到的，同时仍然适用于通过裂变分裂的生物，如 S. pombe。该模型可以从一组不同的测量类型中获取输入，以指定细胞周期阶段。它可以摄取出芽细胞周期阶段数据，其中包括随时间推移的芽细胞百分比的测量，从而可以估计未出芽G1阶段^14，15之外的细胞数量。该模型还可以摄取测量DNA含量的流式细胞术数据，从而能够评估从G1到S，S到G2以及M到G1¹⁵的里程碑式转变。荧光形态标志物也可用于识别细胞周期阶段。肌球蛋白环、细胞核和纺锤体极体（SPB）的荧光标记可用于确定细胞周期阶段，这些被纳入CLOCCS模型¹¹;但是，这些测量将不在本协议中描述。此外，分离指数被用作S . pombe¹⁴建模数据的输入。因此，该模型可用于各种生物体的细胞周期分析，并且可以进一步扩展。

CLOCCS是一个参数模型，允许从输入数据（例如，出芽百分比，DNA含量）对多个参数进行完整的贝叶斯推断。这些参数包括同步恢复时间，细胞周期的长度（母细胞和子细胞分别估计）以及细胞在每个时间点的平均细胞周期位置。这些参数代表了群体中平均细胞的行为，使研究人员能够将每个时间点映射到表示为生命线点的细胞周期位置。到生命线点的转换取决于 CLOCCS 参数 lambda （λ） 和 mu0 （μ₀）^14，15。参数λ对应于母细胞的平均细胞周期。然而，由于母女延迟¹⁴，^15，这不是包括母细胞和子细胞的完整群体的平均细胞周期。CLOCCS还推断参数delta（δ），该参数对应于母子延迟，因此可以计算整个群体的平均细胞周期。最后，由于每个实验在从细胞周期同步释放后开始，因此从同步方法恢复所需的时间由 CLOCCS 参数_{μ 0} 表示。CLOCCS 将模型拟合到输入细胞周期阶段数据，然后使用随机游走马尔可夫链蒙特卡罗算法^14，15 推断这些参数。通过将多个实验映射到共同的细胞周期生命线时间尺度，可以在重复或恢复时间或细胞周期周期^{不相同的实验}之间进行直接的阶段特异性比较8，^14，15。

由于同步群体在时间序列^14，15，16，¹⁷的过程中以某种速率失去同步^，同步丢失率的可变性也会阻碍实验之间的定量比较。通过确定种群的位置及其分布的方差，CLOCCS解释了同步损失率的差异。这个强大的工具允许跨实验进行具体和详细的比较，从而不仅能够在重复之间，而且能够在环境条件、突变体甚至具有显着不同细胞周期计时^14，15 的物种之间进行直接相关比较。

本文描述了一种使用CLOCCS的方法，通过拟合同步/发布时间序列实验的数据来估计参数，将数据映射到共同的生命线尺度，然后在重复或实验之间进行相关比较。生命线比对允许在这些实验中进行直接的阶段特异性比较，从而可以聚合和比较重复，并在具有不同恢复时间和细胞周期的实验中进行更相关的比较。

Protocol

1. 收集细胞周期阶段和实验数据

1. 使用所需的同步方法（例如，Leman等人¹⁸中描述的离心淘析或Rosebrock 19中描述的交配信息素停滞;Leman等人¹⁸和Rosebrock¹⁹也包括从同步释放的方法）使细胞相对于细胞周期同步同步）。在整个时间序列中开始采样，确保时间序列的长度至少为两个完整的细胞周期，并且最好在每个细胞周期中收集至少 10 个样本。在每个时间点，收集细胞周期期数据（出芽或流式细胞术）的样品和实验数据的样品，如下所述。
2. 如果使用出芽数据作为细胞周期阶段数据，请收集有关出芽的数据以进行 CLOCCS 比对。
   1. 在整个时间序列中采样。对于每个时间点，收集细胞，并通过将 200 μL 超声细胞培养物与 200 μL 固定剂溶液混合来固定它们，如 Leman 等人 ¹⁸ 中所述。
   2. 对于标准出芽，使用具有40倍物镜和血细胞计数器的透射光学显微镜在每个时间点至少计数200个细胞。将步骤1.2.1中的细胞样品加入血细胞计数器中，如果密度阻止计数，则稀释。记录每个时间点的出芽和未出芽细胞的数量。计算出芽细胞的百分比，并绘制出芽曲线中每个时间点的图。
      注意:指定细胞周期阶段信息的其他方法可用，但本协议中未描述这些方法。其他方法在 CLOCCS 自述文件和以前的工作¹¹ 中进行了描述。
3. 如果使用流式细胞术 DNA 含量数据作为细胞周期阶段数据，请收集流式细胞术 DNA 染色数据以进行流式细胞术 CLOCCS 比对。
   1. 在整个时间序列中采样。对于每个时间点，收集细胞，并按照Haase和Reed²⁰中的描述修复它们。
   2. 对DNA进行染色，并使用标准流式细胞术分析进行分析。Haase和Reed²⁰中描述了酿酒酵母的推荐染色方案。
4. 收集相关的组学或相关的实验数据。对于标准转录组学数据，如Leman等人¹⁸ 和Kelliher等人^21，22中所述进行收集。确保数据与包含细胞周期阶段数据的时间点相关联，以便进行下游对齐。为了获得最佳对齐效果，请确保包含实验数据的每个时间点也具有与之关联的相位数据。
   注意:实验数据可以采取多种形式。传统上，我们使用描述的比对方法来比对时间序列转录组学实验。然而，与时间点相关的任何类型的数据都可以对齐（即蛋白质组学²²）。

2. 安装所需软件

注意:本节假定已安装 Conda、Java 19 和 Git（材料表）。

1. 通过在终端中输入以下命令来下载CLOCCS_alignment存储库:
   git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. 使用 conda_req.yml 文件创建 Conda 环境，方法是在克隆CLOCCS_alignment存储库的文件夹中的终端中输入以下命令:
   Conda env create -f conda_req.yml

3. 使用CLOCCS对实验进行参数化

1. 双击CLOCCS_alignment存储库中 CLOCCS 文件夹中的cloccs_v2023.jar文件，然后等待图形用户界面打开。此屏幕允许输入 CLOCCS 运行的选项，并在运行后显示结果。
2. 输入常规设置。
   1. 通过在关联的文本输入框中键入来设置 Sim 退火、烧入和 迭代 。模拟退 火（模拟退 火）识别良好的起始参数值，" 燃烧" 搜索后验模式， 最后阶段 允许得出所有后验推断。较高的值会增加运行时间，但也会增加准确性。
   2. 通过使用标记为温度的文本框和下拉菜单 Synchro 指定以摄氏度为单位的温度和同步方法来输入实验条件。方法，分别。
   3. （可选）在"高级设置"菜单中配置高级设置。高级设置允许为每个参数设置先验（"mu0"、"sigma0"、"sigmav"、"lambda"、"bud.start"、"bud.end"）。
      注意:有关高级设置的详细信息，请参阅自述文件.txt CLOCCS_alignment存储库的 CLOCCS 文件夹中。
3. 输入用于出芽数据的设置。
   1. 从 模型类型 下拉菜单中选择适当的选项。默认选项 芽 用于出芽酵母的标准出 芽 信息。
      注意:下拉菜单中还存在其他更高级的选项:突变体用于经历多个出芽周期而没有分裂的突变体的出芽信息，BudSSLSMR 用于出芽信息和额外的纺锤体极体和肌球蛋白环信息，BudNucDivNeck用于出芽信息以及额外的分裂和芽颈细胞核信息。这些高级选项在 CLOCCS 自述文件和以前的工作¹¹、^14、15 中进行了描述。
   2. 使用"数据导入 "面板导入数据 ，方法是在文本输入框中键入内容，或通过单击 "选择文件" 按钮上传文件。第一列指定时间点。其余两列指定出芽数据，并且可以采用以下任一选项:未出芽细胞数（无芽）、芽细胞数（芽）或细胞总数（总计）。
4. 输入用于流式细胞术数据的设置。对于每个实验 ，请运行 步骤 3.3 或步骤 3.4。
   注意:流式细胞术数据和出芽数据可以一起使用。虽然之前我们描述了将它们一起运行¹⁵，但对于此工具，它们必须独立运行，然后进行比较。
   1. 按照 补充文件 1 （在CLOCCS_alignment存储库中也称为 CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt）中的说明，将 .fcs 文件转换为正确的流式细胞术 CLOCCS 输入格式。
   2. 从模型类型下拉菜单中选择流选项。
   3. 使用 "数据导入"面板导入数据。单击 "选择文件"，然后选择在步骤 3.4.1 中生成的文件。
   4. 通过在 拟合 时间框中选择时间点，选择应绘制流式细胞仪 CLOCCS 拟合的时间点。
5. 为出芽或流式细胞术选择所有输入后，单击" 应用 "按钮，然后单击屏幕顶部的 "样品 "按钮。
6. 通过选择预测拟合选项卡，查看具有 预测拟 合的出芽曲线或流式细胞术图。默认情况下，此选项卡在上一步之后立即打开。
7. 查看每个参数的参数直方图，方法是选择 "参数直方图 "选项卡，然后从以下选项中选择与感兴趣参数对应的子选项卡: mu0、delta、sigma0、sigmav、lambda、bud.start、bud.end 等。
8. 通过选择后验分数选项卡查看后验 分数 图。
9. 查看设置，并通过选择" 设置 "选项卡进一步更改它们;通过选择"日志"选项卡查看以前运行的 日志 。
10. 通过选择后 验参数 选项卡从拟合中获取 CLOCCS 参数。生成的表将具有以下形式:每行由一个参数组成，最后一行是后排。这些列由均值的预测参数、2.5% 的置信区间下限、97.5% 的置信区间上限和接受率组成。
    1. 记录用于每个实验的比对参数:同步恢复时间（μ₀）和母细胞的平均细胞周期（λ）。
    2. 通过计算母细胞周期（λ）和子细胞周期（λ + δ）的平均值来计算细胞周期，其中δ是子细胞特异性延迟。
       注意:重复第3节，将所有实验包括在比较中。

4. 使用 Python 转换函数和 CLOCCS 参数将时间点转换为生命线点

注:时间点和生命线点之间的转换需要两个转换公式²¹.CLOCCS_alignment存储库中提供了用于转换和数据可视化的 Python 实现，如下所述。

1. 通过在终端中输入以下命令来激活 Conda 环境:conda 激活CLOCCS_alignment
2. 通过在终端中键入以下命令打开交互式 Python 笔记本:Jupyter 笔记本
3. 在所需文件夹中创建新的 Python 笔记本。
   注意:已包含一个示例笔记本来演示标准用法，可以在CLOCCS_对齐存储库的 Alignment/JOVE_example.ipynb 中找到。
4. 通过在第一个单元格中运行以下命令来导入包含对齐函数的 Python 文件:
   %运行path_to_repo/cloccs_alignment/对齐/实用程序.py
   1. 将CLOCCS_alignment存储库的路径替换为path_to_repo。
5. 如果使用出芽数据作为单元周期阶段数据，则通过在新单元中运行以下命令来导入包含每个时间点出芽百分比的数据框:
   budding_df = pd.read_csv（"path_to_folder/budding_filename.tsv"， sep ="\t"， index_col=0）
   1. 替换相应的文件路径和文件名。如果该文件是.csv文件，请删除 sep ="\t"
6. 如果使用出芽数据作为细胞周期阶段数据，则通过在新像元中输入以下函数，将出芽数据与生命线点时间刻度对齐:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters（budding_df、时间点、param_mu0、param_lambda）
   1. 对于时间点，将时间点列表替换为budding_df数据框的索引。
   2. 对于param_mu0和param_lambda，请将第 3 节中萌芽的 CLOCCS 运行中学到的参数替换为实验。
7. 如果使用流式细胞术数据，请在新单元格中运行以下命令来导入流式细胞术数据:
   flow_samples = flow_cytometry_import（flow_input_folder）
   1. 对于flow_input_folder，请替换包含流式细胞术 .fcs 文件的文件夹的相应路径。
8. 如果使用流式细胞术数据，请在新单元格中键入以下命令，为每个实验的时间点和生命线点生成转换表:
   flow_converter = convert_tp_to_ll（时间点、param_mu0、param_lambda）
   1. 对于时间点，请替换流式细胞术数据中的时间点列表。
   2. 对于param_mu0和param_lambda，请替换从第3节中运行的流式细胞术CLOCCS中学到的参数进行实验。
9. 通过在新单元格中运行以下命令，将包含实验数据的数据框导入笔记本:
   data_df = pd.read_csv（"path_to_folder/exp_data_filename.tsv"， sep ="\t"， index_col=0）
   1. 替换相应的文件路径和文件名。如果该文件是.csv文件，请删除 sep ="\t"。
      注意:可以对任何表格数据执行此操作。实验数据必须仅将时间点作为数据框的列或索引。可以在CLOCCS_alignment存储库中找到示例数据。
10. 通过在新单元格中输入以下函数，将实验数据与生命线点时间刻度对齐:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters（data_df、时间点、param_mu0、param_lambda、插值、下部、上部）
    1. 对于时间点，请将时间点列表替换为上一步中实验data_df的索引或列。
    2. 对于param_mu0和param_lambda，请替换第 3 节中从 CLOCCS 获得的值。
       注意:参数可以来自在任何接受的细胞周期相数据类型上执行的任何CLOCCS运行。
    3. （可选）将插值替换为 True 或 False，或留空（默认值为 False）。
       注意:设置为 False 时，不会插值数据。设置为 True 时，将对生命线点进行舍入和插值，以填充生命线点之间的值，以便在生命线点的范围内每个整数都有一个点。这样可以更好地跨数据集进行比较。
    4. （可选）将 下 层和 上层 替换为 无 或 整数值。
       注意:如果设置为 "无"，则保留插值后的所有生命线点。提供 整数 时，这将截断数据，以便生命线点的范围从 较低 到 较高。这允许跨具有不同下层或上层的数据集进行比较。
11. 通过在新单元格中输入以下命令来下载与生命线对齐的数据集:lifeline_aligned_df.to_csv（"path_to_desired_location/name_of_file.tsv"， sep = "\t"）
12. 重复步骤4.5-4.11，将所有实验包含在比较中。

5. 比较出芽曲线和流式细胞术数据

1. 通过使用 Python 实用程序功能在新单元格中输入以下命令，在对齐之前绘制出芽曲线:
   plot_budding_curves（list_of_budding_curves， list_for_legend = leg_list， point_type = str_type， 标题 = str_title）
   1. 替换包含所有所需出芽曲线的数据框的列表，以绘制 list_of_budding_curves-[bud_df1、bud_df2、bud_df3]。
   2. 如果需要，将图例的标签列表 - [实验 1，实验 2，突变体] 替换为leg_list。如果不是，请 排除 或替换" 无"。
   3. 用 时间 代替str_type。
   4. 如果需要，将字符串标题 "比较萌芽曲线" 替换为str_title。如果不是，请替换" 无"或 排除。
2. 按照步骤 5.1 中的说明，使用 Python 实用程序功能绘制对齐后的萌芽曲线，但用 对齐 的萌芽曲线列表代替list_of_budding_curves，用 生命线 代替 point_type而不是时间。
3. 要绘制流式细胞术数据，请使用步骤4.8中生成的转换器在相应的生命线点绘制.fcs文件中的相关数据。
4. 使用转换器表将生命线点转换为细胞周期阶段（表1）。
   注意:也可以按照步骤5.1中的说明绘制此图， 但相位表示 point_type而不是 时间。

6. 比较实验数据

1. 根据文献信息或研究感兴趣的基因确定要在折线图中绘制的基因列表。
2. 使用 Python 实用程序文件中提供的plot_linegraph_comparison，通过在新单元格中键入以下命令，对原始、对齐或对齐和插值的数据框执行折线图比较:
   plot_linegraph_comparison（list_of_dfs， list_for_legend， 基因列表， point_type = str_type， 标题 = str_title）
   1. 将要比较的实验的数据框列表替换为list_of_dfs。
      注: 数据框可以未对齐或对齐;但是，必须在步骤 6.2.4 中输入相应的point_type。
   2. 按照与list_for_legend数据框列表相同的顺序替换每个数据框的标题列表。
   3. 替换要为基因列表绘制的基因名称列表（必须包含在数据框的索引中）。
   4. 将点类型替换为str_type。对步骤 6.2.1 中的对齐数据框使用生命线（默认值为生命线点刻度）或相位（细胞周期阶段生命线刻度），或在步骤 6.2.1 中对未对齐的数据帧使用时间。
   5. 将可选的字符串标题替换为str_title。
3. 使用文献或算法确定要包含在热图中的基因列表，以确定顶级周期基因。
   注意:为了进行正确的热图比较，应在步骤 6.2 中对齐、插值和时间刻度调整数据;对于每个实验，它应具有相同的开始和结束生命线值。
   1. 运行周期性算法以确定顶部周期基因²³，^24，或使用所需的替代方法来确定基因列表（即文献结果）。
   2. 在新单元格中使用以下命令将 .csv 或 .tsv 基因列表文件导入笔记本:
      sort_df = pd.read_csv（"path_to_folder/sorting_filename.tsv"， sep="\t"， index_col=0）
   3. 替换相应的文件路径和文件名。如果该文件是.csv文件，请删除 sep="\t"。
4. 使用 Python 实用程序文件中提供的函数plot_heatmap_comparison，通过在新单元格中键入以下命令，对对齐、插值和相位对齐的数据框执行热图比较:
   plot_heatmap_comparison（list_of_dfs、list_for_legend、基因列表、标题 = str_title）
   1. 替换要比较的实验的 对齐 数据框列表，以list_of_dfs。
   2. 按照与list_for_legend数据框列表相同的顺序替换每个数据框的标题列表。
   3. 替换要为基因列表绘制的基因名称列表（必须包含在数据框的索引中）。
   4. 将可选的字符串标题替换为str_title。
      注意:列表中的第一个数据帧是将用于对热图中的基因进行排序的数据框。基因将按该数据框的第一个周期中的最大值排序，并且列表中的后续数据框将使用相同的顺序。

Results

上述协议和 图1 中工作流程中描述的步骤应用于五个细胞周期同步时间序列实验，以证明两种代表性的比较:具有不同同步方法（交配信息素和离心淘析¹⁸）和测序平台（RNA测序[RNA-seq]和微阵列）的重复之间，以及跨实验条件。用 酿酒酵母进行多次实验，收集每个实验的细胞周期期和实验数据。工作流程包括使用 CLOCCS 对各种同步/发布时间序列实验进行参数化，使用这些参数将实验与常见的可比较生命线规模对齐，然后使用这些对齐的实验进行两个代表性比较。

为了证明跨重复的代表性比较，我们选择了在相同菌株和相同实验条件下进行的三个实验，称为条件1。其中两个实验是彼此的直接重复，并且都 通过 微阵列分析进行分析，并通过离心淘析 同步 。第三个实验使用RNA-seq分析进行分析，并通过α因子交配信息素阻滞 同步 。为了证明具有不同细胞周期的实验的第二次比较，将上述条件1 RNA-seq实验（细胞周期:71分钟）与条件2（细...

Discussion

本文提出了一种更准确和定量地评估同步细胞群时间序列实验数据的方法。该方法利用从CLOCCS中学习的参数，CLOCCS是一种贝叶斯推理模型，它使用输入的细胞周期阶段数据（例如出芽数据和流式细胞术DNA含量数据）来参数化每个实验^14，15。CLOCCS使用输入的细胞周期阶段数据来推断每个实验的参数，然后将其用于与通用生命线尺度对齐。将多个同步/发布时间序列实验转换为单个生命线对齐的时间尺度，可以在实验之间进行特定于阶段的相关比较，并聚合多个重复实验，这在以前是困难或不可能的。

该协议的关键步骤包括收集数据、运行 CLOCCS、对齐数据集以及跨数据集进行比较。首先，必须收集数据以用于此协议。数据必须包括包含有关感兴趣问题的实验数据（即转录组学数据、基因表达数据、蛋白质组学数据）和包含细胞周期阶段信息的细胞周期阶段数据（即出芽数据、流式细胞术 DNA 含量数据）。然后，可以在CLOCCS中使用细胞周期阶段数据来收集每个实验的参数信息。 参数μ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			用于固定液。在 Leman 2014 中描述。
4% 甲醛			用于固定液。
100% 乙醇			用于流式细胞术固定。在 Haase 2002 中描述。
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
流式细胞仪			用于流式细胞术实验方案。
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
显微镜			用于计数细胞和芽。
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
蛋白酶溶液			用于流式细胞术实验方案。在 Haase 2002 中描述。
RNAse A 溶液			用于流式细胞术实验方案。在 Haase 2002 中描述。
SYTOX Green 核酸染色剂	Invitrogen	S7020	用于流式细胞术染色。在 Haase 2002 中描述。
Tris			pH 值 7.5