使用表征细胞周期同步损失模型进行跨实验比较的同步时间序列数据比对

Summary

分析同步时间序列实验的一个挑战是，实验在同步恢复时间和细胞周期周期方面通常不同。因此，来自不同实验的测量结果无法汇总分析或轻松比较。在这里，我们描述了一种对齐实验的方法，以便进行特定于阶段的比较。

Abstract

研究细胞周期通常取决于同步细胞群，以测量细胞遍历细胞周期时时间序列中的各种参数。然而，即使在类似的条件下，重复实验也显示出从同步恢复和穿越细胞周期所需的时间差异，从而阻止了每个时间点的直接比较。在突变群体或影响同步恢复时间和/或细胞周期的替代生长条件下，比较实验动态测量的问题会加剧。

我们之前发表了一个名为表征细胞周期同步损失（CLOCCS）的参数数学模型，该模型监测同步细胞群如何从同步释放并通过细胞周期进行。然后，可以使用从模型中学习到的参数将同步时间序列实验中的实验时间点转换为归一化的时间尺度（生命线点）。生命线量表不是代表从实验开始到几分钟经过的时间，而是代表从同步到细胞周期进入，然后通过细胞周期的各个阶段的进展。由于生命线点对应于同步群体中平均细胞的阶段，因此这种归一化的时间尺度允许在实验之间进行直接比较，包括具有不同周期和恢复时间的实验。此外，该模型已被用于对齐不同物种（例如， 酿酒 酵母和 庞贝裂殖酵母）之间的细胞周期实验，从而能够直接比较细胞周期测量，这可能会揭示进化的相似性和差异性。

Introduction

在细胞周期中同步进行的时间序列测量是研究控制细胞周期进程机制的标准方法¹，²，³，⁴，⁵，⁶，^7，8.跨同步/发布时间序列实验进行比较的能力对于我们理解这些动态过程至关重要。使用重复实验来证实研究结果可以增加结论可重复性的信心。此外，环境条件之间、突变体之间甚至物种之间的比较可以揭示许多关于细胞周期调控的新见解。然而，从同步恢复和细胞周期进展速度的实验间变异性损害了在重复之间或在改变细胞周期时间的实验之间进行时间点到时间点比较的能力。由于这些挑战，重复通常不包括在完整的时间序列中（例如，Spellman等^人4）。当收集整个时间序列的重复时，无法汇总分析数据，而是使用单个重复进行分析，而其他重复通常降级为补充数字（例如，Orlando et ^al.8）。此外，具有不同回收率或细胞周期进展特征的实验之间的比较是困....

Protocol

1. 收集细胞周期阶段和实验数据

1. 使用所需的同步方法（例如，Leman等人¹⁸中描述的离心淘析或Rosebrock 19中描述的交配信息素停滞;Leman等人¹⁸和Rosebrock¹⁹也包括从同步释放的方法）使细胞相对于细胞周期同步同步）。在整个时间序列中开始采样，确保时间序列的长度至少为两个完整的细胞周期，并且最好在每个细胞周期中收集至少 10 个样本。在每个时间点，收集细胞周期期数据（出芽或流式细胞术）的样品和实验数据的样品，如下所述。
2. 如果使用出芽数据作为细胞周期阶段数据，请收集有关出芽的数据以进行 CLOCCS 比对。
   1. 在整个时间序列中采样。对于每个时间点，收集细胞，并通过将 200 μL 超声细胞培养物与 200 μL 固定剂溶液混合来固定它们，如 Leman 等人 ¹⁸ 中所述。
   2. 对于标准出芽，使用具有40倍物镜和血细胞计数器的透射光学显微镜在每个时间点至少计数200个细胞。将步骤1.2.1中的细胞样品加入血细胞计数器中，如果密度阻止计数，则稀释。记录每个时间点的出芽和未出芽细胞的数量。计算出芽细胞的百分比，并绘制出芽曲线中每个时间点的图。
      注意:指定细胞周期阶段信息....

Results

上述协议和 图1 中工作流程中描述的步骤应用于五个细胞周期同步时间序列实验，以证明两种代表性的比较:具有不同同步方法（交配信息素和离心淘析¹⁸）和测序平台（RNA测序[RNA-seq]和微阵列）的重复之间，以及跨实验条件。用 酿酒酵母进行多次实验，收集每个实验的细胞周期期和实验数据。工作流程包括使用 CLOCCS 对各种同步/发布时间序列实验进行参数化，使用这些参数将实验与常见的可比较生命线规模对齐，然后使用这些对齐的实验进行两个代表性比较。

为了证明跨重复的代表性比较，我们选择了在相同菌株和相同实验条件下进行的三个实验，称为条件1。其中两个实验是彼此的直接重复，并且都 通过 微阵列分析进行分析，并通过离心淘析 同步 。第三个实验使用RNA-seq分析进行分析，并通过α因子交配信息素阻滞 同步 。为了证明具有不同细胞周期的实验的第二次比较，将上述条件1 RNA-seq实验（细胞周期:71分钟）与条件2（细.......

Discussion

本文提出了一种更准确和定量地评估同步细胞群时间序列实验数据的方法。该方法利用从CLOCCS中学习的参数，CLOCCS是一种贝叶斯推理模型，它使用输入的细胞周期阶段数据（例如出芽数据和流式细胞术DNA含量数据）来参数化每个实验^14，15。CLOCCS使用输入的细胞周期阶段数据来推断每个实验的参数，然后将其用于与通用生命线尺度对齐。将多个同步/发布时间序列实验转换为单个生命线对齐的时间尺度，可以在实验之间进行特定于阶段的相关比较，并聚合多个重复实验，这在以前是困难或不可能的。

该协议的关键步骤包括收集数据、运行 CLOCCS、对齐数据集以及跨数据集进行比较。首先，必须收集数据以用于此协议。数据必须包括包含有关感兴趣问题的实验数据（即转录组学数据、基因表达数据、蛋白质组学数据）和包含细胞周期阶段信息的细胞周期阶段数据（即出芽数据、流式细胞术 DNA 含量数据）。然后，可以在CLOCCS中使用细胞周期阶段数据来收集每个实验的参数信息。 参数μ

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			用于固定液。在 Leman 2014 中描述。
4% 甲醛			用于固定液。
100% 乙醇			用于流式细胞术固定。在 Haase 2002 中描述。
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
流式细胞仪			用于流式细胞术实验方案。
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
显微镜			用于计数细胞和芽。
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
蛋白酶溶液			用于流式细胞术实验方案。在 Haase 2002 中描述。
RNAse A 溶液			用于流式细胞术实验方案。在 Haase 2002 中描述。
SYTOX Green 核酸染色剂	Invitrogen	S7020	用于流式细胞术染色。在 Haase 2002 中描述。
Tris			pH 值 7.5