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基于磁性荧光微球的双报告系统流式分析PDL1-Vaxx多肽疫苗诱导的抗体对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效应

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DOI：

10.3791/65467

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2023年7月7日

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1Department of Obstetrics & Gynecology, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2The James Comprehensive Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

检查点抑制剂是开发抗癌疗法的重要靶点。本报告介绍了一种新型基于PDL1肽的癌症疫苗PDL1-Vaxx，该疫苗可诱导产生中和性多克隆抗体，阻断PD-1/PDL1复合物的形成。本研究还详细描述了用于分析该活性的荧光微球检测方法的开发与验证过程。

摘要

检查点受体（PD-1、PD-L1 和 CTLA-4）的单克隆抗体抑制在治疗癌症患者的临床试验中已显示出显著疗效，并已成为现代癌症免疫治疗的主要手段。然而，仅有一部分患者对检查点单克隆抗体免疫治疗产生应答。因此，迫切需要开发新的癌症治疗策略。一种新型B细胞肽表位PDL1（程序性死亡配体1）癌症疫苗已被研制出来，该疫苗将氨基酸130-147与MVF肽相连"非特异性的" T细胞麻疹病毒融合蛋白 通过 一种GPSL连接子。临床前测试表明，该PDL1疫苗（PDL1-Vaxx）可在动物体内有效激发高度免疫原性的抗体。接种PDL1-Vaxx的动物在多种动物癌症模型中表现出肿瘤负荷降低和生存期延长。作用机制研究表明，疫苗诱导的抗体可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，并阻断PD-1/PD-L1相互作用。本文介绍了一种基于磁珠的检测方法，该方法采用双报告系统流式分析技术，用于评估PD-1/PD-L1相互作用及其被针对PDL1-Vaxx产生的抗PDL1抗体所阻断的情况。

引言

在免疫系统的T细胞、B细胞及细胞内检查点中，信号通路调控着免疫活动。某些癌细胞通过激活检查点靶点来抑制免疫功能，从而保护自身免受免疫攻击，并促进肿瘤的存活与增殖。肿瘤免疫治疗中的检查点抑制疗法利用抗体靶向并阻断这些信号检查点，进而恢复免疫系统对肿瘤的抑制功能1,2,3。目前高效的抗癌治疗包括靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）的单克隆抗体纳武利尤单抗4，以及靶向程序性死亡配体1（PD-L1）的阿替利珠单抗5。该策略在癌症患者治疗中已显示出显著的临床疗效。然而，当前检查点抑制策略的临床应用受到不良反应和治疗耐药性的限制，尤其是在单药治疗中更为明显6。因此，亟需将免疫治疗与毒性更低且更有效的治疗策略联合应用于癌症治疗1,3,6。

在过去30年中，Kaumaya博士的实验室开发了多肽癌症疫苗及相关多肽模拟剂用于癌症治疗，其中部分疫苗已进入正在进行的临床试验1,2,7,8,9,10,11,12,13,14。例如，在临床试验中，联合HER-2免疫治疗的B-Vaxx在治疗转移性和/或复发性实体瘤患者方面显示出临床获益12。该实验室最新的癌症疫苗为PD1-Vaxx2,13和PDL1-Vaxx14，在临床前研究中表现出显著优势，尤其在联合治疗中效果突出。PD1-Vaxx已在美国和澳大利亚完成了剂量递增的临床试验。PD1-Vaxx将于2023年5月启动的1b期临床试验中与阿替利珠单抗（atezolizumab）联合使用。本报告重点评估PDL1-Vaxx诱导的抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。

PDL1-Vaxx 癌症疫苗是一种新型的 B 细胞肽表位疫苗，其中 PD-L1 的氨基酸 130-147 通过 GPSL 肽连接子与广谱 T 细胞麻疹病毒融合（MVF）肽相连。via。临床前研究表明，PDL1-Vaxx 在多种动物模型中具有高度免疫原性，可有效刺激抗肿瘤抗体的产生，延长生存期，并减轻肿瘤负荷14。针对 PD-L1 肽段产生的抗体能够成功阻断 PD1/PD-L1 相互作用，从而发挥抗肿瘤活性。本报告介绍了一种基于磁珠、采用双报告系统在流式细胞仪上检测 PDL1-Vaxx 诱导抗体对 PD1/PD-L1 复合物形成阻断作用的检测方法。

方案

1. 实验准备

注意：本步骤中提到的所有试剂/设备的详细信息均列在材料表中。

  1. 获取重组人源 PD-1（rhPD-1；带有多聚组氨酸标签）。使用前，用经无菌滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶解冻干的 rhPD-1。
  2. 获取生物素标记的重组人源 PD-L1（rhPD-L1）。使用前，用无菌去离子水溶解冻干的 rhPD-L1。
  3. 获取链霉亲和素偶联 R-藻红蛋白检测试剂（SAPE）。所有 SAPE 溶液均需避光保存于冰箱温度下（即 2–8 °C）。
  4. 获取荧光染色的磁性微球（直径 6.5 µm，含嵌入式磁铁矿的聚苯乙烯微球）及偶联试剂盒15（如使用，请参见材料表）。微球的共价偶联需使用 sulfo-NHS（磺基-N-羟基琥珀酰亚胺）和 EDC（N-[3-二甲氨基丙基]-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐）。
    注意：磁珠试剂盒可提供多达 500 种独特的荧光标签，可用于识别并区分不同的磁珠组合16。磁珠的储存浓度分别为 2.5 × 106 个磁珠/mL 和 12.5 × 106 个磁珠/mL。磁珠需避光保存于冰箱温度下（即 2–8 °C）。切勿冷冻磁珠悬液。
  5. 获取阳性和阴性对照抗体，以及 Brilliant Violet 421（BV421）标记的二抗检测抗体。所有荧光标记分子均需避光保存。
  6. 所有偶联反应均需在低蛋白结合力离心管中进行，所有检测反应均需在低蛋白结合力、圆底 96 孔微孔板中进行。在检测孵育步骤中，使用一次性压敏封板膜或塑料 96 孔微孔板盖密封微孔板。在检测洗涤步骤中，使用磁板分离器固定磁珠。
    ​注意：双报告系统流式分析仪配备三种激光器：（1）用于识别和定量磁珠特异性荧光信号（分类通道）；（2）用于检测和定量目标特异性藻红蛋白（PE）荧光信号（报告通道 1；532 nm 激发，“橙色” 565–585 nm 发射）；（3）用于检测和定量第二个目标分析物的目标特异性 BV421 荧光信号（报告通道 2；405 nm 激发，“蓝色” 421–441 nm 发射）。

2. 将rhPD-1与磁珠偶联

注意：待偶联的蛋白质必须不含牛血清白蛋白（BSA）、叠氮化钠、甘氨酸、甘油、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）或含胺类添加剂，并应悬浮于 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。市面上有商业化的偶联试剂盒，包含本实验所需的所有试剂和缓冲液（见材料表）。

  1. 从冰箱中取出所有偶联试剂，室温（RT，18–22 °C）平衡 20–30 分钟。
  2. 根据产品说明书，通过短暂涡旋、超声或旋转（15–30 rpm，15 分钟）重新悬浮储存用微球。
  3. 将 1 × 106 个磁珠转移至一个 1.5 mL 低蛋白结合微离心管中（参见材料表）。
  4. 用 100 µL 活化缓冲液15：0.1 M NaH2PO4（一元磷酸盐），pH 6.2，洗涤磁珠。
    注意：也可使用预配置的偶联试剂盒进行偶联，该试剂盒包含 0.1 M 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 6.0，作为替代的活化和偶联缓冲液（参见材料表）。
    1. 将含有磁珠的管子置于磁力架上 1–2 分钟。
      注意：也可通过在 ≥8,000 × g 条件下微量离心 1–2 分钟分离磁珠。
    2. 当管子仍置于磁力架中时，用移液器吸除被磁铁固定或沉淀的磁珠上方的上清液。
    3. 将微离心管从磁铁上取下，加入 80 µL 偶联缓冲液（参见材料表）。
    4. 轻轻涡旋反应管，并超声 20 秒以分散磁珠。
  5. 使用 sulfo-NHS 和 EDC 活化磁珠。
    注意：sulfo-NHS 储存液浓度为 50 mg/mL，溶于活化缓冲液中。EDC 储存液浓度也为 50 mg/mL，溶于活化缓冲液中。活化缓冲液和空气中的水分均会导致 EDC 降解。不建议使用储存的 EDC 溶液。应在操作前现配适量新鲜 EDC 溶液，并立即使用。多余的 EDC 溶液应丢弃。
    警告：EDC 会引起严重的眼部刺激，对呼吸道和皮肤具有刺激性。
    1. 向含有已洗涤并活化磁珠的微量离心管中加入 10 µL sulfo-NHS。
    2. 向含有磁珠和 sulfo-NHS 的微量离心管中加入 10 µL EDC 储存液。
    3. 避免光敏微球暴露于光线下，于室温（18–22 °C）在旋转仪上以 15–30 rpm 转动 20 分钟。或者，在活化步骤期间，若每隔 10 分钟轻轻涡旋以重新分散磁珠，也可让管子保持静止。
  6. 洗去磁珠上过量的偶联试剂。
    1. 将含有活化磁珠的管子置于磁力架上 1–2 分钟。
    2. 当管子仍置于磁力架中时，用移液器吸除被磁铁固定或沉淀的磁珠上方的上清液。
    3. 将微离心管从磁铁上取下，加入 100 µL 活化缓冲液。
    4. 轻轻涡旋反应管以分散磁珠。
    5. 重复步骤 2.6.1–2.6.4 两次，共完成三次洗涤。洗涤结束后，磁珠将悬浮于 100 µL 活化缓冲液中，浓度约为 10 × 106 个磁珠/mL。
  7. 将 rhPD-1 肽与活化磁珠偶联。
    1. 向含有活化磁珠的管中加入 390 µL 活化缓冲液，使总磁珠悬浮体积达到 490 µL。
    2. 通过向含有活化磁珠的管中加入 10 µL PD-1 肽溶液（1 mg/mL，溶于 PBS），向活化磁珠悬浮液中加入 1 µg PD-1 肽。
    3. 短暂涡旋微离心管，使 PD-1 和活化磁珠均匀分布。
    4. 在室温（18–22 °C）避光条件下，以 15–30 rpm 旋转孵育 2 小时，使磁珠与 PD-1 结合。
  8. 使用检测/洗涤缓冲液（PBS-TBN：1× PBS，pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05% Tween-20 + 0.05% NaN315）洗涤磁珠两次（2×）。
    1. 将含有活化磁珠的管子置于磁力架上 1–2 分钟。
    2. 当管子仍置于磁力架中时，用移液器吸除被磁铁固定或沉淀的磁珠上方的上清液。
    3. 将微离心管从磁铁上取下，加入 100 µL 活化缓冲液。
    4. 轻轻涡旋反应管以分散磁珠。
    5. 重复步骤 2.8.1–2.8.4 一次，共完成两次洗涤。洗涤结束后，磁珠将悬浮于 100 µL 活化缓冲液中，浓度为 10 × 106 个磁珠/mL。
      注意：如果检测/洗涤缓冲液不用于储存，则可不添加叠氮化钠（防腐剂）。
    6. 若未立即使用，将偶联了 rhPD-1 的磁珠避光保存于 2–8 °C 冰箱中。蛋白偶联磁珠在该条件下可稳定保存长达 18 个月。

3. 评估rhPD-1与磁珠偶联的成功情况

注意：将rhPD-1偶联的微球与生物素标记的rhPD-L1进行反应，随后通过SAPE孵育检测后者，并在流式细胞仪上进行分析。该步骤可验证rhPD-1成功偶联至磁珠，以及rhPD-1与rhPD-L1蛋白之间的功能相互作用。

  1. 在 PBS-TBN 中制备生物素化 rhPD-L1 的两倍系列稀释液（rhPD-L1 原液浓度为 1 mg/mL）。待检测的 rhPD-L1 最终浓度范围为从 8 µg/mL 溶液稀释至 313 pg/mL 溶液。每种 rhPD-L1 稀释液制备 150 µL 体积：每个反应使用 50 µL，每种条件设两个重复反应，并额外留出足够体积以补偿移液过程中的损耗。
    1. 将 rhPD-L1 稀释用的微量离心管标记为 8 µg/mL、4 µg/mL、2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL、0.25 µg/mL、0.125 µg/mL、0.063 µg/mL 和 0.031 µg/mL。另设一个 0 µg/mL 管（仅含 PBS-TBN）作为无 PD-L1 的对照。
    2. 向所有已标记的 rhPD-L1 稀释管中预先加入 150 µL PBS-TBN。
      注：待测 rhPD-L1 的最高终浓度为 8 µg/mL，rhPD-L1 加入反应体系后将被 1:1 稀释，因此标记为“8 µg/mL”的稀释管实际含有 16 µg/mL rhPD-L1。所有稀释管上的标签均表示加入反应体系后的最终 rhPD-L1 浓度。
    3. 制备最高浓度的 rhPD-L1 稀释液（实际浓度为 16 µg/mL）。该步骤为两步稀释，将 1 mg/mL 的 rhPD-L1 原液稀释 62.5 倍（1,000 µg/16 µg = 62.5）。
      1. 在微量离心管中加入 84 µL PBS-TBN 和 16 µL rhPD-L1 原液（1 mg/mL，即 1,000 µg/mL）。此为 6.25 倍稀释，所得浓度为 160 µg/mL rhPD-L1。
      2. 在标记为“8 µg/mL”的管中，加入 270 µL PBS-TBN 和 30 µL 上一步制备的 rhPD-L1 稀释液（160 µg/mL）。此为 10 倍稀释，所得实际浓度为 16 µg/mL。“8 µg/mL”管的标签表示其加入反应体系后的终浓度。
    4. 将步骤 3.1.3 中制备的 rhPD-L1 稀释液（“8 µg/mL”）取 150 µL 转移至“4 µg/mL”管中，盖紧微量离心管盖，短暂涡旋混匀。
    5. 依次重复步骤 3.1.4，直至完成整个 rhPD-L1 系列稀释。稀释完成后，“8 µg/mL”至“0.063 µg/mL”各管以及 0 µg/mL 对照管均应含有 150 µL 溶液，最后一管“0.031 µg/mL”应含有 300 µL 溶液。此体积可确保每种生物素化 rhPD-L1 稀释液取 50 µL 进行双重复反应检测，并留有足够余量以补偿移液损耗。
  2. 使用血细胞计数板对 rhPD-1 偶联微珠进行计数17。
  3. 将 rhPD-1 偶联微珠原液稀释至 5 × 104 个微珠/mL，体积需足够满足每反应 50 µL 中含 2,500 个微珠。
  4. 涡旋混匀 5 × 104 个微珠/mL 的 rhPD-1 偶联微珠悬液，用移液器将 50 µL 悬液加入 96 孔圆底微孔板中已标记或定位的各孔中，每种 rhPD-L1 稀释液均设双孔重复。
  5. 将步骤 3.1 中制备的每种生物素化 rhPD-L1 稀释液各取 50 µL，加入微孔板中对应的孔。
  6. 用一次性铝箔或塑料粘性封板膜覆盖微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下，于旋转摇床（600 rpm）上孵育 1 小时。
  7. 洗去微珠上未结合的生物素化 rhPD-L1。
    1. 将密封的微孔板从旋转摇床上转移至磁力架上，静置 2 分钟以固定微珠。
    2. 小心移除粘性封板膜，确认磁力架与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置，将上清液倒入水槽或生物危害液体废物容器中（根据实际情况选择）。将倒置的微孔板轻而迅速地在吸水纸垫上轻拍，以去除残留上清液。
    3. 将微孔板从磁力架上取下，向每孔加入 150 µL PBS-TBN。
    4. 将未密封的微孔板放回磁力架上，静置 2 分钟以固定微珠。
    5. 确认磁力架与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置，将上清液倒入水槽或生物危害液体废物容器中（根据实际情况选择）。将倒置的微孔板轻而迅速地在吸水纸垫上轻拍，以去除残留上清液。
  8. 重复步骤 3.7.3–3.7.5 的洗板操作两次，共进行三次洗涤，每次使用 150 µL PBS-TBN。确保最后一次洗涤后各孔中无残留上清液。操作应保持稳定，防止微孔底部固定的微珠干燥。
  9. 加入 SAPE 检测试剂。
    1. 用 PBS-TBN 将 SAPE 原液稀释至工作浓度 6 µg/mL。配制足够体积的 SAPE 工作液，确保所有反应孔每孔可加入 100 µL，并额外留出足够体积以补偿移液损耗。
    2. 将微孔板从磁力架上取下。
    3. 向每孔加入 100 µL SAPE 工作液，并通过移液操作重悬已洗涤的微珠。
    4. 用铝箔或塑料粘性封板膜密封 96 孔微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下，于旋转摇床（600 rpm）上孵育 1 小时。
    5. 从孵育器中取出微孔板，转移至磁力架上固定微珠，移除粘性封板膜，并按照步骤 3.7.3–3.7.5 的方法用 150 µL PBS-TBN 洗涤三次。
    6. 最后一次洗涤完成后，将微孔板从磁力架上取下，每孔用 100 µL PBS-TBN 重悬微珠。
  10. 分析结果。
    1. 使用流式分析仪器（见材料表）读取微孔板，测定各反应的中位荧光强度（MFI），仪器设置如下：吸样体积 = 50 µL；最低微珠计数 = 100 个微珠；超时设置 = 40 秒；设门范围 = 7,000–17,000；工作模式 = 单一报告模式。每种条件设双孔重复，每种条件的两个 MFI 输出值取平均值后，再进行后续数据计算和作图。
      ​注：各稀释度的 MFI 值应呈现浓度依赖性结合，表明 rhPD-1 与微珠的偶联效率良好，并证实重组 PD-1/PD-L1 蛋白之间具有良好的相互作用。

4. 基于PD-L1磁珠的PD-1/PD-L1阻断检测

注意：本实验用于评估可溶性介质（例如抗PDL1肽抗体）对重组PD1/PD-L1相互作用的阻断活性。简言之，将生物素标记的重组人PD-L1（rhPD-L1）与不同PDL1-Vaxx肽免疫后在兔体内产生的抗体进行预孵育。随后，使用偶联了重组人PD-1（rhPD-1）的磁珠捕获rhPD-L1与抗PDL1抗体的混合物，并通过加入链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-PE）来定量rhPD-L1与rhPD-1磁珠的结合量。PE荧光信号强度与待测抗PDL1抗体/抑制剂的阻断活性呈负相关。同时，通过加入BV421标记的抗兔二抗（用于检测抗PDL1肽抗体）或抗人二抗（用于对照抗体），并在仪器的第二通道检测BV421荧光信号，以平行评估抗PDL1肽抗体的结合情况。该实验步骤在图1中以图示形式详细展示。

  1. 制备测试抗体的两倍系列稀释液，包括PDL1-Vaxx诱导的多克隆抗体候选物、阴性对照抗体（曲妥珠单抗，Herceptin，人源化抗HER2单克隆抗体）和阳性对照抗体（阿特珠单抗；人源化抗PDL1 IgG1单克隆抗体）。每个反应将使用25 µL指定的抗体稀释液，因此所示体积足以在每种条件下进行双复孔反应（即每种条件50 µL），并留有额外体积以补偿移液过程中的损失。
    1. 对于每种疫苗诱导的抗PDL1肽抗体及对照抗体，确保最终测试的抗体浓度范围为1,000 µg/mL至8 µg/mL。将所有抗体的储备液配制成2,000 µg/mL。
    2. 为每种抗体标记稀释管，分别为1,000 µg/mL、500 µg/mL、250 µg/mL、125 µg/mL、63 µg/mL、31 µg/mL、16 µg/mL和8 µg/mL，并注明抗体名称。同时为每种抗体设置一个“0 µg/mL”管，作为仅含载体（PBS-TBN）的对照。
      注：加入反应体系后，抗体浓度将被1:1稀释。因此，抗体稀释管上标注的是加入反应体系后的最终抗体浓度，实际管中所含抗体浓度为标注浓度的两倍。
    3. 向所有标记为“500 µg/mL”及更低浓度的抗体稀释管（包括“0 µg/mL”仅含载体的对照管）中各加入75 µL PBS-TBN。
    4. 对于每种抗体，将150 µL浓度为2,000 µg/mL的储备液移入相应标记为“1,000 µg/mL”的管中。此溶液用于制备该抗体后续的所有稀释液。
    5. 对于每种抗体，通过移液将75 µL从“1,000 µg/mL”管转移至系列中下一个较低浓度的管（即“500 µg/mL”管），封闭新完成的稀释管，短暂涡旋混匀，然后继续将75 µL从“500 µg/mL”管转移至“250 µg/mL”管，依此类推，直至完成所有抗体的最后一个稀释浓度“8 µg/mL”。
      注：每种抗体完成的稀释系列中，除最低稀释浓度8 µg/mL管应含有150 µL体积外，其余各管体积均为75 µL。每个反应需使用25 µL抗体稀释液，因此上述体积足以满足每种条件下的双复孔反应（即每种条件50 µL），并留有额外体积以补偿移液损失。
  2. 将25 µL稀释后的抗体加入96孔微孔板的指定孔中。
  3. 将生物素标记的rhPD-L1用PBS-TBN稀释至工作浓度4 µg/mL，体积需足够为每种条件提供双复孔各25 µL（即每种条件50 µL），并留有额外体积以补偿移液损失。
    注：在本研究中，4 µg/mL的生物素标记rhPD-L1在前期偶联评估中产生的MFI信号约为最大值的50%，并用于PD-1/PD-L1阻断分析。
  4. 向每个反应孔中加入25 µL生物素标记的rhPD-L1（4 µg/mL），用铝箔或塑料粘性封板膜覆盖微孔板，并在室温（18–22 °C）下以600 rpm在轨道摇床上振荡孵育1小时。
  5. 将rhPD-1偶联磁珠稀释至50,000 个磁珠/mL，体积需足够每孔50 µL（即每孔2,500 个磁珠），并留有额外体积以补偿移液损失。
  6. 从摇床取下96孔微孔反应板，移除粘性封板膜。
  7. 向每孔中加入50 µL rhPD-1偶联磁珠混合液。
  8. 密封微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下以600 rpm在轨道摇床上孵育1小时。
  9. 将密封的微孔板转移至磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
  10. 小心移除粘性封板膜，确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除残留的上清液。
  11. 洗涤去除磁珠上多余的反应试剂。
    1. 将微孔板从磁力板分离器上取下，向每孔中加入150 µL PBS-TBN。
    2. 将微孔板置于磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
    3. 确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除残留的上清液。
  12. 重复步骤4.11.1–4.11.3两次，共进行三次PBS-TBN洗涤。在去除最后一次（第三次）洗涤液前，确保已准备好SAPE检测试剂（见下文）。
  13. 加入SAPE检测试剂。
    1. 将SAPE储备液用PBS-TBN稀释至6 µg/mL的工作浓度，配制体积需足够每孔100 µL，并留有额外体积以补偿移液损失。
    2. 向每个反应孔中加入100 µL SAPE工作液，并通过移液重悬磁珠。
    3. 密封微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下以600 rpm在轨道摇床上孵育1小时。
  14. 去除反应中多余的SAPE。
    1. 将密封的微孔板转移至磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
    2. 小心移除粘性封板膜，确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除含过量SAPE的上清液。
  15. 洗涤去除磁珠上多余的SAPE。
    1. 将微孔板从磁力板支架上取下。
    2. 向每孔中加入150 µL PBS-TBN以重悬磁珠。
    3. 将微孔板置于磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
    4. 确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除残留的上清液。
  16. 再进行两次PBS-TBN洗涤，共完成三次洗涤，重复步骤4.15.1–4.15.4。在去除最后一次（第三次）洗涤液前，确保已准备好BV421偶联的二抗检测试剂（见下一步）。
  17. 加入BV421偶联的二抗。
    1. 将BV421偶联的抗人IgG（用于检测人源化对照抗体）和BV421偶联的抗兔IgG（用于检测PDL1-Vaxx诱导的多克隆抗体）（参见材料表）用洗涤/检测缓冲液按1:400稀释，配制体积需足够每孔各加100 µL，并留有额外体积以补偿移液损失。
    2. 向相应孔中加入100 µL稀释后的BV421偶联抗人IgG或BV421偶联抗兔IgG。
    3. 密封微孔板，在室温（18–22 °C）避光条件下以600 rpm在轨道摇床上孵育1小时。
  18. 去除磁珠上多余的BV421偶联二抗。
    1. 将密封的微孔板转移至磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
    2. 小心移除粘性封板膜，确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除含过量BV421偶联二抗的上清液。
  19. 洗涤去除磁珠上多余的BV421偶联二抗。
    1. 向每孔中加入150 µL PBS-TBN以重悬磁珠。
    2. 将微孔板置于磁力板分离器上静置2分钟，使磁珠固定。
    3. 确认磁铁与微孔板紧密贴合后，将微孔板倒置并弃去上清液。将倒置的微孔板轻轻敲击在吸水纸垫上，以去除残留的上清液。
  20. 重复步骤4.19.1–4.19.3，再进行三次PBS-TBN洗涤，共完成四次洗涤。
  21. 去除最后一次（第四次）洗涤缓冲液后，将微孔板从磁力板分离器上取下，用移液器将磁珠重悬于每孔100 µL PBS-TBN中。
  22. 分析结果。
    1. 使用双报告系统读取微孔板，测定每个反应的MFI值，仪器设置如下：吸液体积 = 50 µL；最小磁珠计数 = 100个磁珠；超时设置 = 40秒；门控范围：7,000–17,000；操作模式 = 双报告模式。
    2. 使用双报告系统时，确保报告通道1检测橙色PE荧光（rhPD-1偶联磁珠上结合的rhPD-L1量），报告通道2检测蓝色BV421荧光（结合在rhPD-L1上的阻断抗体量）。
    3. 每种条件设置双复孔，进一步数据计算和作图前，取两个MFI输出值的平均值。
    4. 将每个样本的MFI值相对于阴性对照进行标准化，并计算每个样本的抑制百分比：
      抑制率% = (100 × [阴性对照MFI − 样本MFI]) / 阴性对照MFI
      注：阴性对照MFI值（无抑制）为最高值；结合的PD-L1信号MFI定义为100%，rhPD-L1与rhPD-1结合的抑制率定义为0%。

使用PD-1磁珠、SAPE和流式细胞术进行孵育步骤的抗体结合实验示意图。
图1：双报告系统PD-1/PD-L1阻断实验示意图。 将生物素标记的重组人PD-L1（rhPD-L1）先与选定的由PDL1-Vaxx诱导产生的抗PD-L1抗体共同孵育，然后加入与磁珠偶联的rhPD-1，以促进PD-1/PD-L1检查点复合物的形成。形成的rhPD-L1复合物通过添加链霉亲和素偶联藻红蛋白（SAPE，橙色荧光染料）进行检测和标记。针对PDL1-Vaxx表位的抗体可识别并结合已与预先偶联在磁珠上的rhPD-1形成复合物的rhPD-L1，并使用Brilliant Violet 421偶联的二抗（BV421，蓝色荧光染料）进行荧光标记。利用双报告流式细胞仪同时分析两个独立报告通道中的荧光信号，分别检测与PD-1结合的生物素化rhPD-L1（PE信号）以及识别并结合rhPD-L1的抗PD-L1抗体（BV421信号）。每个样本的输出值为每种荧光染料的中位荧光强度。通过将实验组信号与阴性对照单克隆抗体（不结合rhPD-L1，定义为0%抑制）产生的信号进行比较，推算不同PDL1-Vaxx诱导抗体对PD-1/PD-L1复合物形成的抑制程度。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

该检测能够精确定量四种针对rhPD-L1疫苗肽段产生的多克隆抗体对PD-1/PD-L1相互作用的抑制作用，这些抗体正在被探索作为潜在的癌症治疗药物。图1展示了本检测的示意图。使用链霉亲和素-PE检测试剂通过报告通道1测量了结合到rhPD-1偶联磁珠上的生物素化rhPD-L1的量，以及四种PLD1-Vaxx诱导的候选抗体对该结合的抑制作用，该试剂可直接结合rhPD-L1（图2）。

四种多克隆抗PDL1肽抗体均在不同程度上阻断了可溶性人PD-L1（rhPD-L1）与固定在微球上的PD-1之间的相互作用。在最高测试浓度1,000 µg/mL时，不同抗PDL1肽抗体的抑制率范围为48%至74%。阳性对照单克隆抗体atezolizumab在最高测试浓度14 4 µg/mL时对PD-1/PD-L1相互作用的阻断率达到92%（图2）。与阴性对照抗体trastuzumab（预期不与PD-1/PD-L1系统发生相互作用）相比，所有实验性PDL1-Vaxx抗体均表现出浓度依赖性的rhPD-L1与rhPD-1偶联微珠结合抑制作用。

PD-1/PD-L1 抑制曲线图，抗体浓度与抑制率的关系，抗体功效的数据分析。
图2：通过新型基于荧光微球的免疫分析法检测抗PDL1肽抗体对rhPD-L1与磁珠偶联的rhPD-1相互作用的阻断效果。 将重组人PD-1（rhPD-1）偶联至磁性微球，然后将微球与预先与不同抗PDL1肽抗体孵育的生物素标记的rhPD-L1进行孵育。使用链霉亲和素-藻红蛋白（streptavidin-phycoerythrin）检测试剂结合生物素，从而评估可与PD-1结合的rhPD-L1的相对量。检测了兔源性抗PDL1肽疫苗多克隆抗体（anti-PDL1[36]、anti-PDL1[50]、anti-PDL1[95]和anti-PDL1[130]）的抑制活性，在最高测试浓度下显示出48%–74%的重组PD-1/PD-L1相互作用阻断率。以阿替利珠单抗（atezolizumab，另一种抗PDL1单克隆抗体）作为阳性对照，无关的商用单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab，抗HER2）作为阴性对照。本图改编自Guo等人的研究14。请点击此处查看此图的放大版本。

抗PD-L1抗体结合率与浓度关系图，显示相对于对照组的MFI响应值。
图3：不同PDL1-Vaxx诱导抗体与rhPD1包被的磁珠结合的rhPD-L1复合物的结合能力比较。 使用Brilliant violet 421标记的二抗检测抗体，比较不同兔多克隆抗PDL1肽抗体与rhPD-L1的结合能力 通过 rhPD-1包被的微球。BV421蓝色荧光信号在双报告系统仪器的报告通道2中记录，该信号与实验性抗PDL1肽抗体的相对结合效率相关。曲妥珠单抗（抗HER2）是一种靶向不同于PD-1/PD-L1通路的检查点的单克隆抗体，用作阴性对照。MFI表示每种条件下在两个重复反应孔中测量的微球中位荧光强度的平均值。该图改编自Guo等人的研究。14. 请点击此处以查看此图的放大版本。

使用另一种检测系统（BV421标记的抗兔IgG）在仪器的第二个报告通道上评估了四种实验性PDL1-Vaxx诱导候选抗体与rhPD-L1结合能力的相对强弱。结果表明，这四种多克隆抗PDL1肽抗体均能以浓度依赖的方式结合rhPD-L114（图3）。其中，抗PDL1(130)抗体在四种PDL1-Vaxx诱导的抗体候选物中显示出最高的rhPD-L1结合信号。

讨论

检查点相关癌症免疫治疗的目的是破坏检查点蛋白与其在肿瘤存活和进展中起重要作用的配体之间的相互作用2。该研究团队正在积极开发新型PD-1和PD-L1疫苗，以诱导产生靶向并阻断PD-1/PD-L1检查点的抗体反应3,8,13,14。此前，研究人员采用两种不同形式的酶联免疫吸附试验（ELISA）来评估抗PDL1肽抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的抑制效果14。（1）在第一种方法中，将rhPD-L1包被于微孔板上，随后加入经抗PDL1疫苗候选物诱导产生的稀释抗体。通过添加生物素标记的rhPD-1，并利用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物及比色底物定量其与固定化rhPD-L1的结合情况，从而评估抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的抑制程度。我们将此定义为直接阻断试验。（2）在第二种方法中，将PD-1包被于微孔板上。将生物素标记的rhPD-L1分别与各抗PDL1候选疫苗诱导的多克隆抗体在独立的反应管中预先孵育。随后将rhPD-L1/抗PDL1混合物加入含有固定化rhPD-1的孔板中并使其发生反应。在可能存在阻断作用的PDL1-Vaxx诱导抗体存在下，任何与固定化rhPD-1发生反应的rhPD-L1均通过后续加入链霉亲和素-HRP及比色底物进行孵育后检测。我们将此定义为反向阻断试验。

抗PDL1肽抗体通过逆转阻断重组PD-1/PD-L1相互作用，显示出对抗信号（即PD-1/PD-L1阻断）的抑制作用，且该抑制呈抗体浓度依赖性14，而直接阻断方法未获得一致的结果（未显示）。为验证ELISA结果并研究在液相中PD-1/PD-L1相互作用的阻断情况，开发了基于微球的双报告基因阻断检测法，该方法避免了将重组蛋白固定于孔底可能带来的空间位阻或结合表位可及性问题。微球分析结果与采用逆转阻断法的ELISA阻断结果直接相关（图2）。此外，相较于比色法ELISA，基于荧光的免疫检测具有更高的检测灵敏度和更宽的动态范围18；并且，多重微球检测技术可在单个反应体系中同时进行两种独立的免疫检测。用于将微球与rhPD-1共价偶联的磺基-NHS和EDC可能造成了直接阻断与逆转阻断检测之间的性能差异，以及ELISA与Luminex微球法重组PD-1/PD-L1相互作用检测之间观察到的灵敏度差异。有必要进一步在化学和分子水平上深入研究导致这些差异的潜在机制。

ELISA14 和基于微球的检测均表明，PDL1-Vaxx 诱导产生的抗 PD-L1 抗体能够抑制 PD-1/PD-L1 检查点复合物的形成。基于多肽的 PDL1-Vaxx 可成功诱导产生能够阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的抗 PD-L1 抗体。该策略可能成为治疗癌症的一种新型治疗手段，这一观点已得到临床前动物研究的支持3,13,14。计划开展的临床试验将评估 PDL1-Vaxx 在癌症患者中用于检查点免疫治疗及疾病控制的有效性。

披露

Pravin T.P. Kaumaya 是 Imugene 公司的顾问。

致谢

作者感谢美国德克萨斯州奥斯汀市Luminex Corporation公司的Sherry Dunbar博士（PhD，MBA）提供的研究支持，以及美国佛罗里达州巴拿马城Biomedical Publishing Solutions公司的Matthew Silverman博士（mattsilver@yahoo.com）在科学内容和写作方面的协助。本研究获得了美国国立卫生研究院（R21 CA13508 和 R01 CA84356）以及澳大利亚悉尼Imugene有限公司（OSU 900600、GR110567 和 GR124326）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>缓冲液
激活缓冲液：0.1 M NaH2PO4，pH 6.2默克/西格玛S3139
检测/洗涤缓冲液：PBS-TBN（1× PBS，pH 7.4，含 0.1% BSA、0.05% (v/v) Tween-20 和 0.05% NaN₃）3)默克/西格玛P3563（PBS+Tween20）、A7888（牛血清白蛋白）、S8032（叠氮化钠）
偶联缓冲液：50 mM 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 5.0MilliporeSigma M2933
<强>偶联试剂
1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）77149
xMAP 抗体偶联试剂盒（如需要），包含：Luminex Corp.  （美国德克萨斯州奥斯汀）40-50016
EDC，10 mg 
sNHS 溶液，250 µL
活化/偶联缓冲液：0.1 M 2-吗啉乙磺酸（MES），pH 6.0
洗涤缓冲液：1x PBS，pH 7.4，含 0.1% BSA、0.05% (v/v) Tween-20 和 0.05% NaN3 (PBS-TBN)
磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）24510
<强>仪器设备与辅助实验耗材
xMAP INTELLIFLEX（双报告分子仪器）Luminex Corp.  （美国德克萨斯州奥斯汀）INTELLIFLEX-DRSE-RUO
低蛋白吸附圆底96孔板赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）07-200-761
Luminex 磁性板分离器（或同类产品） Luminex Corp.  （美国德克萨斯州奥斯汀）CN-0269-01
Luminex 磁力管分离器（或同类产品）Luminex Corp.  （美国德克萨斯州奥斯汀）CN-0288-01
MagPlex 微球（磁性、荧光、6.5-µ微米级直径珠粒Luminex Corp.  （美国德克萨斯州奥斯汀）MC-1****（根据微珠标签不同而变化）
蛋白质低吸附微量离心管赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）022431081
<强>多肽，抗体 &和检测试剂
阿特珠单抗（人源化抗PD-L1 IgG1单克隆抗体），阳性对照Genentech/Roche（美国加利福尼亚州旧金山）n/a（处方药）
生物素标记的重组人PDL1 Sino Biological（宾夕法尼亚州韦恩）10084-H49H-B
Brilliant Violet 421标记的驴抗人IgG杰克逊免疫研究实验室公司（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）709-675-149
Brilliant Violet 421 标记的驴抗兔 IgG杰克逊免疫研究实验室公司（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）711-675-152
重组人 PD-1（多聚组氨酸标签）Acro Biosystems（美国特拉华州纽瓦克）PD1-H5256 
链霉亲和素偶联R-藻红蛋白（SAPE）安捷伦（美国加利福尼亚州圣克拉拉）PJRS34-1
曲妥珠单抗（Herceptin，人源化抗HER2单克隆抗体），阴性对照Genentech/Roche（美国加利福尼亚州旧金山）n/a（处方药）

参考文献

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PDL1 Vaxx PD 1 PD L1
基于磁性荧光微球的双报告系统流式分析PDL1-Vaxx多肽疫苗诱导的抗体对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效应
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