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方法文章

基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

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DOI：

10.3791/65469

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2023年7月7日

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1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于符合GMP标准的可溶性微载体的全封闭系统，用于实现贴壁细胞的大规模生产。该方法已验证可用于人源间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养，其产量和质量均满足细胞与基因治疗产业的要求。

摘要

细胞与基因治疗（CGT）领域的研究人员长期以来一直面临细胞高效、大规模扩增的重大挑战。为克服二维（2D）平面培养系统的固有缺陷，我们创新性地开发了一种基于GMP级可溶性多孔微载体的自动化封闭式工业化细胞生产（ACISCP）平台，用于贴壁细胞的三维（3D）培养，包括人源间充质干细胞/基质细胞（hMSCs）、HEK293T细胞和Vero细胞。为实现大规模扩增，采用5 L和15 L搅拌罐式生物反应器进行两阶段扩增，在9天内获得1.1 × 1010个hMSCs，总体扩增倍数达128倍。通过完全溶解微载体收获细胞，并利用基于连续流离心的细胞处理系统进行浓缩、洗涤和制剂，随后由细胞分装系统进行分装。与2D平面培养相比，从3D培养中收获的hMSCs在质量上无显著差异。我们还将此类可溶性多孔微载体应用于CGT领域其他常用细胞类型；具体而言，HEK293T细胞和Vero细胞的峰值细胞密度分别达到1.68 × 107 个细胞/mL和1.08 × 107 个细胞/mL。本研究提供了一套利用生物工艺工程平台的方案，该平台结合GMP级可溶性微载体的特性与先进的封闭式设备，实现贴壁细胞的工业化规模生产。

引言

过去二十年间，细胞与基因治疗（CGT）产业经历了指数级扩张。下一代药物的研发有望治疗并治愈多种难治性疾病1。自2017年首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CGT产品Kymriah问世以来，全球CGT相关的研究与开发持续快速发展，FDA收到的CGT类新药临床试验申请数量在2018年已增至500项2。据预测，到2030年，美国获批的CGT产品数量可能达到54至74种2。

尽管细胞与基因治疗（CGT）领域的研究与创新进展迅速令人振奋，但在实验室研究与能够以可承受的成本将这些有前景的药物提供给尽可能多患者的工业化规模生产之间，仍存在巨大的技术鸿沟。目前用于临床试验的工艺是在实验室中为小规模实验建立的，要实现CGT制造的改进与创新仍需付出巨大努力3。CGT产品种类繁多，其中大多数基于活细胞，包括同种异体、自体、工程化或天然细胞。这些活体药物比小分子药物或生物制剂复杂得多，因此大规模制造面临重大挑战4,5,6。在本研究中，我们展示了一种适用于三种广泛应用于CGT领域的贴壁依赖性细胞的大规模细胞生产方案。这些细胞包括已被用于细胞治疗的人类间充质干细胞/基质细胞（hMSCs），以及用于生产最终治疗用细胞产品所需病毒的HEK293T细胞和Vero细胞。贴壁依赖性细胞通常在平面培养系统中进行培养，该过程需要人工操作。然而，人工培养方法劳动强度大，且易受污染，可能影响终产品的质量。此外，缺乏在线过程控制，导致不同批次间产品质量存在显著差异7。以干细胞治疗为例，目前有超过200种干细胞治疗候选产品正处于研发管线中，据估计，为满足临床应用需求，每年需要约300万亿个hMSCs8。因此，实现治疗性细胞的大规模制造已成为满足如此高细胞需求的治疗干预的前提条件9。

为克服平面培养系统的局限性，研究人员已致力于开发基于传统不可溶微载体的搅拌式生物反应器大规模生产工艺。10,11,12,13但这些方法存在制备步骤复杂和细胞收获效率低的问题14最近，我们创新性地开发了一种可溶解的微载体用于干细胞扩增，旨在克服从传统不可溶解的商用微载体中收获细胞所面临的挑战。15这种新型的、市售的符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的三维可溶性多孔微载体3D TableTrix，在大规模细胞生产中展现出巨大潜力。事实上，基于此类多孔微载体的三维培养体系有望重建有利于细胞黏附、增殖、迁移和活化的仿生微环境16微载体的多孔结构和相互连通的孔隙网络可提供更大的细胞黏附面积，并促进氧气、营养物质和代谢产物的交换，从而为细胞生长创造理想的基质 体外 细胞扩增17这些符合GMP标准的三维可溶多孔微载体具有高孔隙率，可实现人源间充质干细胞（hMSCs）的大规模扩增，且微载体可完全溶解的特性有助于高效收获扩增后的细胞。18它也是一种GMP级产品，并已在中国药品审评中心注册为药用辅料（备案号：F20210000003 和 F20200000496）19 美国食品药品监督管理局（FDA，USA；药品主文件编号：35481）20.

本文展示了利用可分散且可溶解的多孔微载体，在自动化封闭式工业级细胞生产（ACISCP）系统18中进行人源间充质干细胞（hMSC）、HEK293T细胞和Vero细胞扩增的方法。我们成功实现了hMSC的两级扩增（在9天内累计扩增128倍），从5 L生物反应器扩增至15 L生物反应器，最终单批次获得高达1.1 × 1010个hMSC。细胞通过完全溶解微载体释放后，利用基于连续流离心的细胞处理系统进行浓缩、洗涤和制剂制备，再通过细胞分装系统进行分装。此外，我们对hMSC产品的质量进行了评估以确认其符合相关标准。我们还展示了此类可溶解微载体在另外两种广泛应用于细胞与基因治疗（CGT）产业的贴壁细胞——HEK293T细胞和Vero细胞——规模化生产中的应用。HEK293T细胞的峰值细胞密度达到1.68 × 107 个细胞/mL，Vero细胞的峰值密度达到1.08 × 107 个细胞/mL。该ACISCP系统可适用于多种贴壁细胞的培养，有望成为推动CGT产业化的有力平台。

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方案

人脐带取自北京清华长庚医院。所有关于人脐带间充质干细胞（UCMSCs）的获取、分离和培养的操作与方案均在获得知情同意并经北京清华长庚医院伦理委员会批准（备案编号 22035-4-02）后进行，且相关操作与方案均符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。

1. hMSCs、HEK293T 细胞和 Vero 细胞的单层培养

  1. 根据已报道的方法21从华通氏胶中分离原代人脐带间充质干细胞（UCMSCs），使用无血清（SF）hMSC培养基进行原代UCMSCs的分离和扩增，在第2代收获细胞，并冻存作为主细胞库（MCB）。
  2. 将6 × 105个人类UCMSCs（建议使用第2代或第3代细胞）接种于一个T75培养瓶中（即二维平面培养容器中的接种密度为8,000个细胞/cm2），加入15 mL完全无血清hMSC培养基进行单层培养。通过“8”字形晃动培养瓶确保细胞均匀分布。在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养至80%-90%汇合度。
  3. 收获时，倾去细胞培养基，用3-5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞两次。然后加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育1-2分钟，直至在倒置明场显微镜下以4倍物镜观察到大多数细胞变圆并从培养瓶表面脱落。加入3 mL无血清hMSC培养基终止消化。
  4. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，以179 × g离心5分钟。弃去上清液，用PBS重悬并清洗细胞沉淀两次，最后用约3-5 mL无血清hMSC培养基重悬，用于接种至生物反应器中的微载体。
    ​注意：检测细胞活力，确保细胞活力>90%。仅在完成生物反应器所有准备工作后（步骤2.1-3.6）才进行细胞制备。
  5. 对于HEK293T细胞和Vero细胞的单层培养，分别将2 × 106-3 × 106个细胞接种至每个T75培养瓶中，并使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM或含10%新生牛血清（NBS）的DMEM进行培养。
  6. 按照步骤1.3-1.4的方法收获细胞，用含10% FBS的DMEM重悬于3-5 mL中。

2. 细胞接种前搅拌罐式生物反应器的准备

  1. 在第 −1 天，用流动的去离子水（DI）将玻璃容器彻底冲洗一次。
  2. 将所有不锈钢管道和搅拌桨从顶板上拆下，浸入去离子水中，并在 40 kHz 和 60 °C 条件下使用超声波清洗机超声清洗 1 小时，以彻底清洁。
    注意：5 L 生物反应器中的一级扩增和 15 L 生物反应器中的二级扩增的准备工作和操作步骤相同。文中括号内为 15 L 生物反应器的参数。若括号内未提供参数，则表示 5 L 和 15 L 生物反应器的参数相同。
  3. 仔细检查所有 O 型圈是否完好并正确就位，然后根据制造商的说明将已拆下的部件重新安装到顶板上。
    注意：如有必要，在组装前更换任何磨损或破损的 O 型圈。磨损的 O 型圈会破坏容器的气密性，从而影响其无菌性。
  4. 向 5 L 容器中加入 7 L（15 L 生物反应器为 18 L）0.5 M NaOH 溶液，并将装有管道的顶板放置在容器边缘，使管道浸入 NaOH 溶液中。静置 12 小时或过夜，以去除管道和玻璃容器中的内毒素。
    注意：不要超过 7 L（18 L），因为这是 5 L（15 L）玻璃容器的最大容量。处理 NaOH 溶液时应穿戴适当的个人防护装备，因其具有腐蚀性。
  5. 取下顶板，将 NaOH 溶液倒入合适的废液瓶中，并按照实验室安全规定丢弃。用无内毒素的去离子水或注射用水彻底冲洗容器、顶板及其部件，以去除残留的碱性物质。
  6. 向容器中加入 2 L（5 L）PBS，重新组装所有部件，并根据制造商的说明将顶板用螺栓固定到容器的金属框架上。
  7. 根据制造商的说明，将封闭系统耗材包安装到顶板上的相应不锈钢（SS）部件/管道/接口上。夹紧所有 Robert 夹具，建议使用止血钳进行加固。保持其中一根连接至冷凝器末端带有 0.22 μm 空气通气滤器的管道不夹紧。
    注意：将硅胶管套在止血钳尖端，以防止刺穿硅胶管。仅夹紧硅胶管，避免夹紧本套件中包含的 C-flex 管。保持冷凝器上一根管道不夹紧，可在灭菌过程中实现压力释放。
  8. 在可高压灭菌的 500 mL GL 45 玻璃瓶中配制 250 mL 0.1 M NaOH 溶液，并安装带有两个接口的 GL 45 多通道连接螺帽。将一段长 180 mm、内径 × 外径为 0.13 in × 0.25 in 的硅胶管连接至螺帽下侧的一个接口；该管长度应足以刚好接触瓶底。
  9. 将另一段比前一段长 500 mm 的硅胶管连接至螺帽上侧的同一接口，并将另一端连接至 5 L 容器顶板上的滴加进样口。将一个 0.22 μm 空气通气滤器连接至螺帽的另一个接口。
  10. 根据制造商的说明对 pH 探针进行两点校准。然后将 pH、溶解氧（DO）和活细胞计数探针插入容器相应的 PG13,5 接口，并拧紧至顶板上。
  11. 根据制造商的说明对完全组装的容器进行气密性检查。维持 0.4 bar ± 0.01 bar 的压力至少 30 分钟。系统通过测试后缓慢释放压力。如果气密性测试失败，应仔细查找泄漏点，并加强容器的组装。
  12. 将完全组装的容器连同耗材包在 15 psi 和 121 °C 条件下高压灭菌 60 分钟。灭菌完成后，检查所有空气通气滤器，确保其完好且干燥。移除所有止血钳。
    注意：潮湿的空气通气滤器无法有效过滤气体，可能在细胞培养过程中破坏容器的无菌性。若空气通气滤器潮湿，应更换并重新对整个容器进行高压灭菌。
  13. 将灭菌后的容器转移至洁净室，并等待其完全冷却至室温。将温度探针插入测温套管中，并将控制器的电机、pH 探针和 DO 探针电缆连接至容器上相应的部件。将加热垫紧密包裹在容器周围。
  14. 松开排气气体冷凝器、环形鼓泡器、NaOH 滴加进样口和气体覆盖进样口上的柔性管道上的 Robert 夹具。打开控制器，登录系统，并根据制造商的说明将 表 1 中列出的参数输入系统。这些管道在培养过程中任何时候均不应夹紧。
  15. 点击 开始，命名实验以启动生物反应器。让生物反应器以这些设置运行至少 12 小时或过夜，使 PBS 被氧气充分饱和，以便后续对 DO 探针进行单点校准。
  16. 在生物反应器控制器上校准泵 1 和泵 2 的液体处理体积流速。分别在每台泵上安装一段 0.13 in × 0.25 in 的硅胶管，一端浸入装有水的瓶子中，另一端插入量筒中。
  17. 将泵转速设为 300 rpm，计时 1 分钟。记录两台泵分别向量筒中输送的水量。这些数值将在后续步骤中使用。
  18. 根据制造商的说明配制 500 mL SF hMSC 培养基，并将培养基瓶的瓶盖更换为一次性 C-Flex EZ Top 容器密封盖及配套瓶盖。在生物安全柜（BSC）内进行瓶盖更换操作。
  19. 将培养基瓶的出口管与含 10 g 预灭菌 W01 微载体的 MSC 瓶的进口 C-flex 管焊接。将一段管道安装至生物反应器控制器的泵 1 上，将泵转速设为 300 rpm，将所有培养基从瓶中 泵入微载体瓶中。将这些微载体在 4 °C 下保存，待第 0 天使用。
    ​注意：微载体应在第 −1 天制备。对于 15 L 生物反应器培养，共需准备四瓶（即 40 g，含 4 × 500 mL SF 培养基）。

3. 在5 L搅拌罐式生物反应器中进行细胞接种、培养和收获

  1. 在第0天，根据制造商的说明，对生物反应器控制器上的溶氧探头进行单点校准（即100%校准）。搅拌式生物反应器现已准备就绪，可用于细胞培养。
  2. 准备一个 2 L（5 L）玻璃瓶用于废液收集，配备带有两个端口的 GL 45 多端口连接螺帽，两个端口均连接 30 mm、0.25 英寸 × 0.44 英寸的 C-Flex 管，并进行高压灭菌以实现灭菌。使用管路焊接仪将废液瓶其中一个端口的 C-Flex 管与生物反应器罐头板上的收获管进行焊接连接。
  3. 暂时停止生物反应器控制器上的温度、pH 和溶氧控制，将连接在收获管上的硅胶管按正确液体流向安装到蠕动泵 2 上，并将容器中的全部 PBS 排入废液瓶中。从泵上取下管路，密封并断开废液瓶。
    注意：在每一步涉及液体流动的柔性管路操作中，务必先松开所有罗伯特夹具。在完成液体转移、封管和断开连接之前，应重新夹紧管路，夹闭位置应靠近头板侧。除非另有说明，后续所有步骤均需执行松开和夹闭操作。
  4. 配制 7 L（30 L）完全 SF hMSC 培养基，并将每个原始瓶盖替换为一次性 C-Flex EZ Top 容器封口及配套瓶盖。将一次性过滤模块焊接至 10 L（50 L）一次性储存袋的一个端口上。在生物安全柜内进行瓶盖更换操作。
  5. 通过将细胞培养基瓶与胶囊过滤器的另一端焊接，并使用生物反应器控制器上的泵，逐瓶过滤并将培养基转移至储存袋中。将其标记为补料袋。
  6. 将进料袋的一个出液口焊接至头板进料管的C-flex管，并将该管路安装到生物反应器控制器的泵1上。将进料袋的另一个出液口焊接至排放管，并将该管路按液体流动的正确方向安装到生物反应器控制器的泵2上。
    注意：将由硅胶管制成的管段安装在泵上，相较于C-Flex管，硅胶管具有更优的耐磨性。确保管路安装方向正确。
  7. 将泵1的转速设为300 rpm，根据步骤2.17中记录的液体流速，从补料袋向反应器中加入1 L（或5 L）培养基后停止泵送。重新启动温度、pH和溶氧控制，参数设置与步骤2.14所述相同。
  8. 密封并断开连接喂养袋与头板上喂养管的管路。将步骤2.18中制备的分散微载体悬液瓶上的C-Flex管焊接至喂养管，泵入瓶中全部内容物至反应器中。密封并断开微载体悬液空瓶。用75%乙醇对瓶的整个表面进行消毒，并将其置于生物安全柜中，作为细胞悬液转移瓶使用。
    注意：在密封和断开一次性配件时，应在头板侧保留一段较长的C-Flex管，因为在后续步骤中将对同一根管进行多次焊接和断开操作。
  9. 确保控制器显示的温度达到37 °C的稳定状态（通常需要约30分钟）后，再进行步骤1.3–1.4中的种子细胞制备。重悬2.5 × 108 将hMSCs加入500 mL无血清培养基中，并转移至先前盛有微载体悬浮液的空瓶中。
    注意：15 L 生物反应器扩增所用的种子细胞应按照步骤 3.21 准备，目标接种密度为 1.0 × 109 500 mL 中的细胞。
  10. 将装有细胞悬液的瓶子上的C-Flex管焊接至头板上的进料口，泵入瓶内所有内容物至反应器中，以启动细胞接种至微载体的过程。密封并断开空瓶。重新将进料袋的进料口焊接至头板上的进料管。
  11. 调整控制器的振荡设置，以实现间歇性振荡，从而提高hMSCs的接种效率，具体参数设置如下：V1 = 35 (30) rpm/5 min；V2 = 0 rpm/25 min；循环次数 = 12 (24)；最终振荡速度 = 35 (30) rpm。
    注意：如果在培养过程中观察到微载体分布不均或发生沉降，可将振荡速度调整为40（35）rpm或45（40）rpm。
  12. 在生物反应器控制器的“培养基更换”界面中，设置自动添加补充物和更换培养基的程序。根据文中所述参数设置hMSC培养的条件。 表 2.
    注意：在此阶段，应松开所有参与液体流动的软管上的罗伯特夹，特别是进料管和放空管。在整个培养过程中，这些管路均需保持松开状态。
  13. 通过连接一次性采样袋，使样品经采样管通过 通过 在预定时间点（通常每天一次）使用鲁尔接头取样，每次向采样袋中分装10 mL。先取2–3 mL样品加入第一个采样袋中弃去，然后每次将实际所需的10 mL样品分装至新的采样袋中。
    注意：最初的 2-3 mL 样品可能是前一次取样时间点后残留在管中的液体，可能无法准确反映容器内的实际状况。每次连接或断开连接前后，务必使用 75% 乙醇对鲁尔接头进行消毒，并采取额外的无菌操作措施。
  14. 将采集的样品转移至15 mL锥形离心管中。对样品进行以下检测。
    1. 取200 μL含细胞的微载体悬浮液，按照说明书使用Calcein-AM/PI细胞双染试剂进行染色，于荧光显微镜下观察。
    2. 通过重力沉降微载体，通常需要 5–10 分钟。吸除上清液，按照葡萄糖仪制造商的说明检测葡萄糖浓度。绘制葡萄糖水平曲线图。
    3. 将载有细胞的微载体沉淀物与新配制的3-5 mL含1 mg/mL消化液的溶液在37 °C下孵育20-30分钟，以完全溶解微载体。使用AO/PI染色后，通过自动荧光细胞分析仪对细胞进行计数。绘制细胞生长曲线，并与控制器上生成的实时活细胞生长曲线进行比对分析。
  15. 在培养的第4天或第5天，配制50 mL（200 mL）浓度为30 mg/mL的消化液。消化液与可溶性微载体之间的质量工作比为3:20至5:20。使用0.22 μm囊式滤器进行无菌过滤，随后在500 mL（2 L）含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中进一步稀释。转移至3 L容器中 一次性储存袋
    ​注意：仅在收获细胞前配制消化液。尽量确保细胞数量至少达到 1.0 x 109-1.2 × 109 用于第一阶段扩增的细胞及 1.0 x 1010 用于第二阶段扩增的细胞。若细胞生长较快，则在第4天收获；否则在第5天收获。不建议超过第5天。
  16. 将微载体的搅拌速度在控制器上设为0，使其沉降，通常在20分钟内完成。关闭自动换液程序，并停止生物反应器控制器上的温度、pH和溶氧控制。在控制器上手动启动泵2，转速设为300 rpm，将上清液排入进料系统，使反应器内保留约1 L（或2 L）的培养悬浮液（可依据步骤2.17中记录的排液速度，或根据反应器器壁上的刻度标记进行判断）。密封并完全断开进料袋连接。
  17. 将步骤3.15中 freshly prepared 消化液袋与进料管焊接，泵入全部内容物至反应容器中。启动搅拌速度为45（40）rpm。确保温度控制仍维持在37 °C。微载体将在40–60分钟内溶解。在30分钟时用无菌鲁尔锁扣注射器取1 mL样品，随后每5–10分钟取样一次，在明场显微镜下观察微载体的溶解情况。
  18. 微载体溶解后，将一个3 L储存袋（15 L生物反应器使用两个3 L储存袋）焊接至收获管，使用泵2以300 rpm将细胞悬液完全泵出。另取一次性储存袋，按照前述步骤中所述方法及配件，分别准备含1%人血清白蛋白（HSA）的生理盐水1 L（3.5 L）作为洗涤缓冲液，以及完全无血清培养基500 mL（以500 mL细胞冻存液为例，其组成为10%二甲基亚砜（DMSO）和90%无血清培养基）。
  19. 打开细胞处理系统，根据制造商说明将一次性细胞处理试剂盒安装至仪器上，将细胞悬液袋、洗涤缓冲液袋和SF培养基（冷冻保存缓冲液）袋焊接至一次性细胞处理试剂盒，并严格遵循用户界面显示的所有操作提示，完成试剂盒的初始化，并检查其完整性及安装是否正确。
  20. 安装完成后，输入所列出的参数 表3 使用洗涤缓冲液洗涤细胞，并用SF培养基（冷冻保存缓冲液）重悬，然后输入软件以启动洗涤和重悬程序。整个过程将自动进行，期间包含若干手动检查步骤。
  21. 从离心室中按照细胞处理系统的提示取样，并根据制造商说明书使用自动细胞分析仪计算细胞密度。调整重悬体积，使细胞密度达到 2 x 106 细胞/mL 或最大总体积 250 mL。
  22. 将细胞转移袋从一次性细胞处理套件上密封并断开，此时系统已将细胞从腔室中抽吸完毕。重新调整细胞密度至 2 x 106 必要时，用完全SF培养基将细胞重悬至适当浓度（cells/mL），转移至较大的细胞转移袋/培养基储存袋中。这些细胞将作为15 L生物反应器二级扩增的种子细胞。

4. 细胞制剂的配制、灌装与终末处理

  1. 在从5 L生物反应器收获细胞的前一天，开始准备15 L生物反应器。完整执行第2和第3节操作步骤，但参数采用括号中注明的15 L对应值。
  2. 将细胞重悬于250 mL冻存缓冲液中，待系统将细胞从培养室中抽吸完毕后，密封并断开细胞转移袋与一次性细胞处理试剂盒的连接。
  3. 转移 2,000 将第4.2步中重悬的250 mL细胞与适量冷冻保存缓冲液混合，加入至3 L细胞转移袋。将该转移袋与一次性灌装袋进行焊接&Finish 消耗品试剂盒 
    注意：此处使用的冷冻保存缓冲液体积应根据步骤3.21中获得的计数结果，结合配方说明和总细胞数计算来确定。
  4. 组装一次性填充部件& 完成耗材试剂盒与细胞填充系统的连接，并根据制造商说明启动预冷却系统。按照系统提示操作，设置每批共20袋，每袋填充20 mL。填充完成后，将这些袋子从试剂盒上密封并断开连接，随后遵循标准的冷冻保存程序。使用冷冻储存袋。
  5. 将一套新的20个冷冻保存袋焊接至一次性填充装置& 完成耗材试剂盒，重复灌装和分装程序，直至所有细胞分装完毕。按照标准程序对这些细胞进行冷冻保存。

5. 细胞质量的表征

  1. 从可溶解微载体中取样收获的hMSCs，并使用细胞处理系统通过流式细胞术进行表征，以确定细胞身份，具体方法参照文献18所述。
  2. 解冻冻存的细胞，并将其重新接种至传统的二维培养瓶或微孔板中，进一步表征细胞特性，包括细胞形态及三系分化能力，具体方法参照文献18所述。

6. 在搅拌罐式生物反应器中使用 G02 微载体扩增 HEK293T 细胞

  1. 按照步骤2所述准备一个5 L的生物反应器。对于HEK293T细胞，使用无菌的G02微载体代替W01进行培养。培养过程与方案第3节相似，但部分参数有所不同，将在后续步骤中详细说明。在生物反应器中安装专用的灌注管路以替代放料管路，因为HEK293T细胞的培养需要灌注。
  2. 与方案第3节所述不同，为5 L生物反应器在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中准备20 g G02微载体（即两瓶），第0天的培养体积设定为3.5 L（即终浓度约为5.71 g/L）。在加入两瓶G02微载体前，先向反应器中加入2 L培养基，并接种500 mL含1.75 × 109个HEK293T细胞的悬液（即终密度为5 × 105个细胞/mL）。
  3. 采用与方案第3节不同的搅拌程序和培养基更换程序（基于每天所需更换的培养基量，以每日培养体积CVD表示），具体参数见表4。
    注意： 需手动启动泵1和泵2，使两者持续运行以实现灌注。根据泵的体积输送速度校准结果，每天调节泵速以达到所需的灌注速率，通常该数值为个位数范围。对于HEK293T细胞，使用新鲜培养基作为补料，将废培养基完全排入废液瓶中；而与hMSCs不同，hMSCs的培养基是循环使用的。
  4. 在进行第二阶段扩增至15 L生物反应器时，采用微载体到微载体的细胞转移方式，而非像hMSCs那样完全溶解微载体。具体操作为：当达到目标细胞密度后停止搅拌，使微载体沉降，然后通过灌注管尽可能吸除上清液；加入相当于残留悬液体积3倍的PBS进行洗涤，重复洗涤三次；最后一次洗涤后，尽可能吸除并弃去PBS。
  5. 加入3.5 L的1×重组胰蛋白酶以使细胞从微载体上解离，同时保持G02微载体结构完整。将温度设为37 °C，搅拌速度设为60 rpm。当超过80%的细胞已解离时，在45分钟内加入等量的完全培养基终止消化反应。
  6. 直接通过收获口将细胞转移至已准备好的15 L反应器中进行第二阶段扩增。

7. 在搅拌罐式生物反应器中使用 V01 微载体扩增 Vero 细胞

  1. 将冻干的V01微载体与PBS一同转移至生物反应器罐体中，使微载体浓度达到20 mg/mL。按照第2节方案所述组装并灭菌罐体，但灭菌时间改为30分钟。
  2. 灭菌后，V01微载体会自然沉降。使用排液和补料管路以基础DMEM置换上清液两次，然后加入含10% NBS的完全DMEM，体积占罐体容量的50%–75%，再进入第3节方案进行细胞接种与培养。
  3. 与第3节方案不同，4 L Vero细胞培养使用24 g V01微载体（即最终浓度为6 g/L），并接种500 mL浓度为4 × 109的Vero细胞（即最终细胞密度为1 × 106 cells/mL）。
  4. 按照步骤6.3–6.6设定培养过程参数，并将细胞传代至15 L搅拌式生物反应器进行二级扩增。

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结果

ACISCP 平台是一个完全封闭的系统，采用一系列搅拌罐式生物反应器进行规模扩增，配备细胞处理系统用于自动化收获和配制细胞，以及细胞灌装系统（图1）。贴壁细胞附着在多孔微载体上，微载体可分散于生物反应器中，从而实现贴壁细胞的悬浮培养。

按照所述方案，首先将 2.5 × 108 个 hMSCs 与 10 g W01 微载体接种于 5 L 搅拌式生物反应器中进行初始扩增。在第 4 天，通过细胞处理系统浓缩并洗涤细胞，共获得约 2.9 × 109 个细胞，其中 1.0 × 109 个收获的细胞被传代至含 40 g W01 微载体的 15 L 搅拌式生物反应器中，进入第二阶段培养。最终，在第 9 天收获了 1.1 × 1010 个 MSCs，并将其配制成制剂，分装至 70 多个制剂袋中（图 2A）。每日监测细胞数量、活力及葡萄糖消耗情况（图 2...

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讨论

免疫治疗和干细胞治疗均使用活细胞作为药物；然而，其最终产品不应像小分子或病毒那样进行纯化或灭菌。因此，在细胞生产过程中的化学制造与控制（CMC）环节，必须始终牢记并切实应用质量源于设计（QbD）原则。23一个完全封闭的细胞培养系统，以及相应的处理系统和灌装系统，优先被考虑用于满足相关要求。本研究中，我们介绍了一种利用基于GMP级可溶性多孔三维微载体的ACISCP平台进行hMSCs两级扩增的操作方案。一些研究人员已探索了使用生物反应器结合微载体扩增hMSCs的可行性。 体外，但大多数已报道的研究表明，规模扩大将导致hMSC产量下降，从6.1 × 105 细胞/mL，甚至12.5 × 105 细胞/mL，在100 mL工作体积中至2.7 × 105 2 L 工作体积中每毫升细胞数24,25,26尽管搅拌罐式生物反应器具有最高的...

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披露

Y.D. 是科学顾问，H.X.、Y.Z.、L.G.、M.L.、Y.Y.、W.L. 和 X.Y. 是北京赛诺 Nich Biotechnology Co. Ltd. 的员工。其他作者对本文所述产品或公司无任何商业、所有权或财务利益。其余所有作者声明不存在竞争性利益。

致谢

本工作受到国家杰出青年科学基金（82125018）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶 EDTA基础培养基S310JV用于二维细胞收获。
3D FloTrix 消化法赛诺菲克生物技术R001-500这是一种可特异性溶解3D TableTrix微载体的试剂。
3D FloTrix MSC 无血清培养基赛微 nich 生物科技RMZ112这是一种无血清、无动物成分的培养基，用于间充质干细胞在二维平面培养以及基于3D TableTrix微载体的三维培养中的扩增与维持。
3D FloTrix一次性过滤模块赛微 nich 生物科技R020-00-10该模块包含 0.22 μ用于培养基和消化液过滤的 m capsule 滤器。
3D FloTrix一次性使用储存袋（10 L）赛诺 Nich 生物科技R020-00-03用作5 L生物反应器的进料袋。
3D FloTrix一次性使用储存袋（3 L）赛微 nich 生物科技R020-00-01用作细胞接种或转移袋。
3D FloTrix一次性使用储存袋（50 L）赛诺 Nich 生物科技R020-00-04用作15 L生物反应器的进料袋。
3D FloTrix vivaPACK 一次性填充包&Finish 消耗品套装赛微 nich 生物科技PACK-01-01这是一种适用于3D vivaPACK灌装与完成系统的标准试剂盒。
3D FloTrix vivaPACK 细胞分装与完成系统赛微 nich 生物科技vivaPACK该系统为封闭式液体处理装置，具有自动混合和排气功能。重悬于冷冻保存液中的细胞可快速且均匀地分装至每批次20个袋子中。
3D FloTrix vivaPREP PLUS 细胞处理系统赛微 nich 生物科技vivaPREP PLUS该系统是一种基于连续流离心机的装置，可在完全封闭的条件下对细胞进行浓缩、洗涤和重悬。
3D FloTrix vivaPREP PLUS 一次性细胞处理试剂盒赛诺 Nich 生物科技PREP-PLUS-00这是一种适用于3D vivaPREP PLUS细胞处理的标准试剂盒。
3D FloTrix vivaSPIN  15 L 生物反应器赛微 nich 生物科技FTVS15该生物反应器产品采用控制器、15 L玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。
3D FloTrix vivaSPIN  5 L 生物反应器赛微 nich 生物科技FTVS05该生物反应器产品采用控制器、5 L 玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。
3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（10/15 L）赛微 nich 生物科技R020-10-10这是一种适用于3D vivaSPIN 15 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。
3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（2/5 L）赛微 nich 生物科技R020-05-10这是一种适用于3D vivaSPIN 5 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。
3D TableTrix 微载体 G02赛微 nich 生物科技G02-10-10g这些多孔且可降解的微载体适用于HEK293T细胞培养。产品以10 g/瓶的规格提供，已预先灭菌，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。
3D TableTrix 微载体 V01赛微 nich 生物科技V01-100-10g这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，以非无菌形式提供，使用前需在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行高压灭菌。它们特别适用于疫苗生产。
3D TableTrix 微载体 W01赛诺 Nichi 生物科技W01-10-10g（一次性包装）；
W01-200（片剂）		这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，尤其适用于需要收获作为终产物的细胞。产品以每瓶10克、预灭菌形式提供，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。该产品已获得中国药品审评中心（CDE）两项药用辅料资质，注册号为[F20200000496；F20210000003]。同时已获得美国食品药品监督管理局（FDA）药用辅料DMF资质，注册号为[DMF:35481]。
APC 抗人 CD45 抗体BioLegend368512用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术
Calcein-AM/PI 双重染色试剂盒DojindoC542Calcein-AM/PI 双染试剂盒用于活细胞和死细胞的同步荧光染色。该试剂盒包含 Calcein-AM 溶液和碘化丙啶（PI）溶液，分别用于染色活细胞和死细胞。
NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器盖（50 个装）圣戈班CAP-38品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。
C-Flex 管路，配方 374（0.25 英寸 × 0.44 英寸）圣戈班374-250-3用于管道焊接和断开。
CryoMACS 冻存袋 50Miltenyi Biotec 200-074-400用于扩增 3D FloTrix vivaPACK 一次性填充&Finish 消耗品套装
二甲基亚砜（DMSO） SigmaD2650-100mL用于制备冻存溶液。
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）基础培养基L120KJ用于HEK293T细胞和Vero细胞的培养。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（2 L）DWK生命科学218016357用于收集5 L生物反应器的废弃物。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（5 L）DWK生命科学218017353用于收集15 L生物反应器的废弃物。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（500 mL）DWK生命科学218014459用于0.1 M NaOH补充瓶。
NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器密封盖Saint-GobainEZ500 ML-38-2品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌替代。
优质胎牛血清（FBS）Wisent086-150用于HEK293T细胞的培养。
FITC 标记抗人 CD14 抗体BioLegend301804用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
FITC 标记的抗人 CD34 抗体BioLegend343504用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
FITC 标记的抗人 CD90（Thy1）抗体BioLegend328108用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
流式细胞术贝克曼库尔特CytoFLEX用于细胞身份鉴定。
荧光细胞分析仪生命科学Countstar Rigel S2用于细胞计数。细胞活力可通过AO/PI染料染色计算。
GL 45 多端口连接螺旋盖，带2个端口 DWK生命科学292632806品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。
葡萄糖检测仪三诺生物6243578用于检测细胞培养基和上清液中的葡萄糖浓度。
含钙和镁的汉克平衡盐溶液（HBSS）Gibco14025092用于消化液的配制。
20% 白蛋白（贝林）（HSA）CSL BehringN/A用于配制洗涤缓冲液。
倒置荧光显微镜OLYMBUSCKX53SF用于明场和荧光观察及成像。
Nalgene 量筒（500 mL）赛默飞世尔科技3662-0500PK用于校准蠕动泵的液体处理体积速度。
新生牛血清（NBS）超细级MINHAI BIOSC101.02用于Vero细胞的培养。
OriCell 人源间充质干细胞成脂分化与鉴定试剂盒CyagenHUXUC-90031用于hUCMSCs的三系分化。
OriCell 人源间充质干细胞软骨分化与鉴定试剂盒CyagenHUXUC-90041用于hUCMSCs的三系分化。
OriCell 人骨髓间充质干细胞成骨分化与鉴定试剂盒CyagenHUXUC-90021用于hUCMSCs的三系分化。
PE 抗人 CD105 抗体BioLegend800504用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 CD19 抗体BioLegend302208用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 CD73（胞外-5'-核苷酸酶）抗体BioLegend344004用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 HLA-DR 抗体BioLegend307605用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent311-010-CL用于玻璃容器和V01微载体的高压灭菌以及培养基的更换。
Sani-Tech 铂金固化卫生级硅胶管（0.13 英寸 × 0.25 英寸）圣戈班ULTRA-C-125-2F用于由蠕动泵驱动的溶液转移。
无菌生理盐水HopebiolHBPP008-500用于配制洗涤缓冲液。
Trypzyme 重组胰蛋白酶基础培养基S342JV该试剂用于HEK293T细胞和Vero细胞的微珠间转移。
管路封口机英奇生物技术Tube Sealer I该封口机与C-Flex管路和PVC管路均兼容。
用于PVC管路的管路焊接仪楚生物技术Tube Welder Micro I用于聚氯乙烯管路的焊接。
用于TPE管路的管路焊接机英奇生物技术管式焊接仪 I-V2用于TPE管路的焊接。
ViaStain AO / PI 活性染色试剂NexcelomCS2-0106-25mL双荧光活力检测法，使用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI），是针对含有碎片的样本中PBMCs及干细胞等原代细胞进行准确活力分析的推荐方法。

参考文献

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