基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

摘要

本文介绍了一种基于符合GMP标准的可溶性微载体的全封闭系统，用于实现贴壁细胞的大规模生产。该方法已验证可用于人源间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养，其产量和质量均满足细胞与基因治疗产业的要求。

摘要

细胞与基因治疗（CGT）领域的研究人员长期以来一直面临细胞高效、大规模扩增的重大挑战。为克服二维（2D）平面培养系统的固有缺陷，我们创新性地开发了一种基于GMP级可溶性多孔微载体的自动化封闭式工业化细胞生产（ACISCP）平台，用于贴壁细胞的三维（3D）培养，包括人源间充质干细胞/基质细胞（hMSCs）、HEK293T细胞和Vero细胞。为实现大规模扩增，采用5 L和15 L搅拌罐式生物反应器进行两阶段扩增，在9天内获得1.1 × 10¹⁰个hMSCs，总体扩增倍数达128倍。通过完全溶解微载体收获细胞，并利用基于连续流离心的细胞处理系统进行浓缩、洗涤和制剂，随后由细胞分装系统进行分装。与2D平面培养相比，从3D培养中收获的hMSCs在质量上无显著差异。我们还将此类可溶性多孔微载体应用于CGT领域其他常用细胞类型；具体而言，HEK293T细胞和Vero细胞的峰值细胞密度分别达到1.68 × 10⁷ 个细胞/mL和1.08 × 10⁷ 个细胞/mL。本研究提供了一套利用生物工艺工程平台的方案，该平台结合GMP级可溶性微载体的特性与先进的封闭式设备，实现贴壁细胞的工业化规模生产。

引言

过去二十年间，细胞与基因治疗（CGT）产业经历了指数级扩张。下一代药物的研发有望治疗并治愈多种难治性疾病¹。自2017年首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CGT产品Kymriah问世以来，全球CGT相关的研究与开发持续快速发展，FDA收到的CGT类新药临床试验申请数量在2018年已增至500项²。据预测，到2030年，美国获批的CGT产品数量可能达到54至74种²。

尽管细胞与基因治疗（CGT）领域的研究与创新进展迅速令人振奋，但在实验室研究与能够以可承受的成本将这些有前景的药物提供给尽可能多患者的工业化规模生产之间，仍存在巨大的技术鸿沟。目前用于临床试验的工艺是在实验室中为小规模实验建立的，要实现CGT制造的改进与创新仍需付出巨大努力³。CGT产品种类繁多，其中大多数基于活细胞，包括同种异体、自体、工程化或天然细胞。这些活体药物比小分子药物或生物制剂复杂得多，因此大规模制造面临重大挑战^4,5,6。在本研究中，我们展示了一种适用于三种广泛应用于CGT领域的贴壁依赖性细胞的大规模细胞生产方案。....

方案

人脐带取自北京清华长庚医院。所有关于人脐带间充质干细胞（UCMSCs）的获取、分离和培养的操作与方案均在获得知情同意并经北京清华长庚医院伦理委员会批准（备案编号 22035-4-02）后进行，且相关操作与方案均符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或同等伦理标准。

1. hMSCs、HEK293T 细胞和 Vero 细胞的单层培养

1. 根据已报道的方法²¹从华通氏胶中分离原代人脐带间充质干细胞（UCMSCs），使用无血清（SF）hMSC培养基进行原代UCMSCs的分离和扩增，在第2代收获细胞，并冻存作为主细胞库（MCB）。
2. 将6 × 10⁵个人类UCMSCs（建议使用第2代或第3代细胞）接种于一个T75培养瓶中（即二维平面培养容器中的接种密度为8,000个细胞/cm²），加入15 mL完全无血清hMSC培养基进行单层培养。通过“8”字形晃动培养瓶确保细胞均匀分布。在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中培养至80%-90%汇合度。
3. 收获时，倾去细胞培养基，用3-5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞两次。然后加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育1-2分钟，直至在倒置明场显微镜下以4倍物镜观察到大多数细胞变圆并从培养瓶表面脱落。加入3 mL无血....

结果

ACISCP 平台是一个完全封闭的系统，采用一系列搅拌罐式生物反应器进行规模扩增，配备细胞处理系统用于自动化收获和配制细胞，以及细胞灌装系统（图1）。贴壁细胞附着在多孔微载体上，微载体可分散于生物反应器中，从而实现贴壁细胞的悬浮培养。

按照所述方案，首先将 2.5 × 10⁸ 个 hMSCs 与 10 g W01 微载体接种于 5 L 搅拌式生物反应器中进行初始扩增。在第 4 天，通过细胞处理系统浓缩并洗涤细胞，共获得约 2.9 × 10⁹ 个细胞，其中 1.0 × 10⁹ 个收获的细胞被传代至含 40 g W01 微载体的 15 L 搅拌式生物反应器中，进入第二阶段培养。最终，在第 9 天收获了 1.1 × 10¹⁰ 个 MSCs，并将其配制成制剂，分装至 70 多个制剂袋中（图 2A）。每日监测细胞数量、活力及葡萄糖消耗情况（图 2.......

讨论

免疫治疗和干细胞治疗均使用活细胞作为药物；然而，其最终产品不应像小分子或病毒那样进行纯化或灭菌。因此，在细胞生产过程中的化学制造与控制（CMC）环节，必须始终牢记并切实应用质量源于设计（QbD）原则。²³一个完全封闭的细胞培养系统，以及相应的处理系统和灌装系统，优先被考虑用于满足相关要求。本研究中，我们介绍了一种利用基于GMP级可溶性多孔三维微载体的ACISCP平台进行hMSCs两级扩增的操作方案。一些研究人员已探索了使用生物反应器结合微载体扩增hMSCs的可行性。 体外，但大多数已报道的研究表明，规模扩大将导致hMSC产量下降，从6.1 × 10⁵ 细胞/mL，甚至12.5 × 10⁵ 细胞/mL，在100 mL工作体积中至2.7 × 10⁵ 2 L 工作体积中每毫升细胞数^24,25,26尽管搅拌罐式生物反应器具有最高的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶 EDTA	基础培养基	S310JV	用于二维细胞收获。
3D FloTrix 消化法	赛诺菲克生物技术	R001-500	这是一种可特异性溶解3D TableTrix微载体的试剂。
3D FloTrix MSC 无血清培养基	赛微 nich 生物科技	RMZ112	这是一种无血清、无动物成分的培养基，用于间充质干细胞在二维平面培养以及基于3D TableTrix微载体的三维培养中的扩增与维持。
3D FloTrix一次性过滤模块	赛微 nich 生物科技	R020-00-10	该模块包含 0.22 μ用于培养基和消化液过滤的 m capsule 滤器。
3D FloTrix一次性使用储存袋（10 L）	赛诺 Nich 生物科技	R020-00-03	用作5 L生物反应器的进料袋。
3D FloTrix一次性使用储存袋（3 L）	赛微 nich 生物科技	R020-00-01	用作细胞接种或转移袋。
3D FloTrix一次性使用储存袋（50 L）	赛诺 Nich 生物科技	R020-00-04	用作15 L生物反应器的进料袋。
3D FloTrix vivaPACK 一次性填充包&Finish 消耗品套装	赛微 nich 生物科技	PACK-01-01	这是一种适用于3D vivaPACK灌装与完成系统的标准试剂盒。
3D FloTrix vivaPACK 细胞分装与完成系统	赛微 nich 生物科技	vivaPACK	该系统为封闭式液体处理装置，具有自动混合和排气功能。重悬于冷冻保存液中的细胞可快速且均匀地分装至每批次20个袋子中。
3D FloTrix vivaPREP PLUS 细胞处理系统	赛微 nich 生物科技	vivaPREP PLUS	该系统是一种基于连续流离心机的装置，可在完全封闭的条件下对细胞进行浓缩、洗涤和重悬。
3D FloTrix vivaPREP PLUS 一次性细胞处理试剂盒	赛诺 Nich 生物科技	PREP-PLUS-00	这是一种适用于3D vivaPREP PLUS细胞处理的标准试剂盒。
3D FloTrix vivaSPIN  15 L 生物反应器	赛微 nich 生物科技	FTVS15	该生物反应器产品采用控制器、15 L玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。
3D FloTrix vivaSPIN  5 L 生物反应器	赛微 nich 生物科技	FTVS05	该生物反应器产品采用控制器、5 L 玻璃搅拌罐反应器及配套附件，并配有特殊的灌流管。
3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（10/15 L）	赛微 nich 生物科技	R020-10-10	这是一种适用于3D vivaSPIN 15 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。
3D FloTrix vivaSPIN 封闭系统耗材包（2/5 L）	赛微 nich 生物科技	R020-05-10	这是一种适用于3D vivaSPIN 5 L生物反应器的标准管路套件，包含取样袋。
3D TableTrix 微载体 G02	赛微 nich 生物科技	G02-10-10g	这些多孔且可降解的微载体适用于HEK293T细胞培养。产品以10 g/瓶的规格提供，已预先灭菌，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。
3D TableTrix 微载体 V01	赛微 nich 生物科技	V01-100-10g	这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，以非无菌形式提供，使用前需在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行高压灭菌。它们特别适用于疫苗生产。
3D TableTrix 微载体 W01	赛诺 Nichi 生物科技	W01-10-10g（一次性包装）； W01-200（片剂）	这些多孔且可降解的微载体适用于贴壁细胞培养，尤其适用于需要收获作为终产物的细胞。产品以每瓶10克、预灭菌形式提供，并配有C-Flex管路，可用于与生物反应器的管道焊接。该产品已获得中国药品审评中心（CDE）两项药用辅料资质，注册号为[F20200000496；F20210000003]。同时已获得美国食品药品监督管理局（FDA）药用辅料DMF资质，注册号为[DMF:35481]。
APC 抗人 CD45 抗体	BioLegend	368512	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术
Calcein-AM/PI 双重染色试剂盒	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI 双染试剂盒用于活细胞和死细胞的同步荧光染色。该试剂盒包含 Calcein-AM 溶液和碘化丙啶（PI）溶液，分别用于染色活细胞和死细胞。
NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器盖（50 个装）	圣戈班	CAP-38	品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。
C-Flex 管路，配方 374（0.25 英寸 × 0.44 英寸）	圣戈班	374-250-3	用于管道焊接和断开。
CryoMACS 冻存袋 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	用于扩增 3D FloTrix vivaPACK 一次性填充&Finish 消耗品套装
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650-100mL	用于制备冻存溶液。
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	基础培养基	L120KJ	用于HEK293T细胞和Vero细胞的培养。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（2 L）	DWK生命科学	218016357	用于收集5 L生物反应器的废弃物。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（5 L）	DWK生命科学	218017353	用于收集15 L生物反应器的废弃物。
DURAN 原装 GL 45 实验室瓶（500 mL）	DWK生命科学	218014459	用于0.1 M NaOH补充瓶。
NALGENE 容器（500 mL）用 EZ Top 容器密封盖	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌替代。
优质胎牛血清（FBS）	Wisent	086-150	用于HEK293T细胞的培养。
FITC 标记抗人 CD14 抗体	BioLegend	301804	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
FITC 标记的抗人 CD34 抗体	BioLegend	343504	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
FITC 标记的抗人 CD90（Thy1）抗体	BioLegend	328108	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
流式细胞术	贝克曼库尔特	CytoFLEX	用于细胞身份鉴定。
荧光细胞分析仪	生命科学	Countstar Rigel S2	用于细胞计数。细胞活力可通过AO/PI染料染色计算。
GL 45 多端口连接螺旋盖，带2个端口	DWK生命科学	292632806	品牌和目录编号仅作示例，类似产品可由不同供应商提供，只要功能相同，即可使用其他品牌的产品替代。
葡萄糖检测仪	三诺生物	6243578	用于检测细胞培养基和上清液中的葡萄糖浓度。
含钙和镁的汉克平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14025092	用于消化液的配制。
20% 白蛋白（贝林）（HSA）	CSL Behring	N/A	用于配制洗涤缓冲液。
倒置荧光显微镜	OLYMBUS	CKX53SF	用于明场和荧光观察及成像。
Nalgene 量筒（500 mL）	赛默飞世尔科技	3662-0500PK	用于校准蠕动泵的液体处理体积速度。
新生牛血清（NBS）超细级	MINHAI BIO	SC101.02	用于Vero细胞的培养。
OriCell 人源间充质干细胞成脂分化与鉴定试剂盒	Cyagen	HUXUC-90031	用于hUCMSCs的三系分化。
OriCell 人源间充质干细胞软骨分化与鉴定试剂盒	Cyagen	HUXUC-90041	用于hUCMSCs的三系分化。
OriCell 人骨髓间充质干细胞成骨分化与鉴定试剂盒	Cyagen	HUXUC-90021	用于hUCMSCs的三系分化。
PE 抗人 CD105 抗体	BioLegend	800504	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 CD19 抗体	BioLegend	302208	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 CD73（胞外-5'-核苷酸酶）抗体	BioLegend	344004	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
PE 抗人 HLA-DR 抗体	BioLegend	307605	用于间充质干细胞身份鉴定的流式细胞术。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Wisent	311-010-CL	用于玻璃容器和V01微载体的高压灭菌以及培养基的更换。
Sani-Tech 铂金固化卫生级硅胶管（0.13 英寸 × 0.25 英寸）	圣戈班	ULTRA-C-125-2F	用于由蠕动泵驱动的溶液转移。
无菌生理盐水	Hopebiol	HBPP008-500	用于配制洗涤缓冲液。
Trypzyme 重组胰蛋白酶	基础培养基	S342JV	该试剂用于HEK293T细胞和Vero细胞的微珠间转移。
管路封口机	英奇生物技术	Tube Sealer I	该封口机与C-Flex管路和PVC管路均兼容。
用于PVC管路的管路焊接仪	楚生物技术	Tube Welder Micro I	用于聚氯乙烯管路的焊接。
用于TPE管路的管路焊接机	英奇生物技术	管式焊接仪 I-V2	用于TPE管路的焊接。
ViaStain AO / PI 活性染色试剂	Nexcelom	CS2-0106-25mL	双荧光活力检测法，使用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI），是针对含有碎片的样本中PBMCs及干细胞等原代细胞进行准确活力分析的推荐方法。