使用光刺激网格绘制光遗传学蛋白的细胞分布图

Summary

该方案涉及转染 cAMP 传感器和 bPAC-nLuc（一种光遗传学蛋白），以准确跟踪其细胞分布和对光刺激的反应。使用点扫描系统创建 cAMP 反应图的创新方法具有推进不同领域光遗传学蛋白质研究的潜力。

Abstract

我们的目标是准确追踪光遗传学蛋白的细胞分布，并评估其在特定细胞质位置的功能。为了实现这一目标，我们使用核靶向 cAMP 传感器和我们实验室开发的光遗传学蛋白细菌光激活腺苷酸环化酶-纳米荧光素酶 （bPAC-nLuc） 共转染细胞。bPAC-nLuc 在用 445 nm 光或荧光素酶底物刺激时，生成 3'，5'-环磷酸腺苷 （cAMP）。我们采用了连接到点扫描系统的固态激光照明器，使我们能够在整个 HC-1 细胞的细胞质中创建小照明点 （~1 μm²） 的网格/基质图案。通过这样做，我们能够有效地跟踪核靶向 bPAC-nLuc 的分布并生成全面的 cAMP 反应图。该图准确代表了 bPAC-nLuc 的细胞分布，其对光刺激的响应根据照射点中蛋白质的量而变化。这种创新方法有助于扩展可用于研究细胞光遗传学蛋白的技术工具包。高精度绘制其分布和响应的能力具有深远的潜力，可以推动各个领域的研究。

Introduction

光遗传学是作为一种彻底改变神经科学的工具而诞生的，现在是一个不断发展的研究领域，也是一项新兴的技术，被全球许多实验室和生物学的各个研究领域经常使用。我们通过将来自 Beggiatoa sp.（细菌光激活腺苷环化酶;bPAC）的光敏腺苷酸环化酶 （AC） 与纳米荧光素酶 （nLuc）^{1，2，3 融合，开发了一种多功能光遗传学蛋白}。当受到蓝光刺激时，bPAC 产生第二个信使 3'，5'-环磷酸腺苷 （cAMP）。nLuc 是一种最近开发的小荧光素酶，在其底物之一存在下，可以产生生物发光并激活 cAMP 产生⁴。因此，这种光遗传学蛋白可以通过使用短暂的光脉冲或用 Furimazine 或其他荧光素酶底物稳定地激活，使我们能够模拟不同的 cAMP 信号传导模式并评估细胞反应（转录因子的激活、基因表达、细胞增殖、迁移等）。^{第 2 个}信使信号转导的最新进展强调了发生在非常受限的胞质区域的事件的重要性（例如，用于 cAMP 反应元件结合蛋白 （CREB） 磷酸化的内体 cAMP 产生或活化 T 细胞核因子 （NFAT） 易位到细胞核的 Ca²⁺ 微结构域）^5，6.因此，开发一致和系统的策略来评估、模拟和阻断活细胞中这些区室的信号转导非常重要。为了显示 bPAC-nLuc 在不同细胞区室中被特异性激活的能力，我们将肝瘤衍生细胞系 （HC-1） 与核靶向 bPAC-nLuc 和 H208、Förster 共振能量转移 （FRET） cAMP 传感器 （NLS-bPAC-nLuc;NLS-H208 的源自 HTC 系的 HC-1 细胞缺乏可测定的 AC 活性，这导致基础 cAMP 水平非常低，使其成为测量推定的 cAMP 产生的理想选择，同时利用 FRET 传感器的完整动态范围^7，8。使用连接到点扫描系统（UGA-42 Geo、Rapp OptoElectronic）的固态激光器（445 nm、LDI-7、89 North），我们描述了一种方案，以系统地刺激单个细胞内非常小的圆形区域或斑点 （~1 μm²）。点扫描系统连接到双层显微镜的后端口之一，这使我们能够通过独立的光路同时刺激细胞并进行 FRET 测量。我们在该协议中提出了一种方法，其中使用 Rapp OptoElectronic 提供的刺激系统提供的 SysCon Geo 软件对细胞质进行全面扫描。该方法涉及通过设置一系列以网格模式刺激细胞的照明来生成 cAMP 反应图（图 1）。

Protocol

1. HC-1 细胞培养和成像准备

1. 将 HC-1 细胞维持在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、青霉素 （100 IU/L）、链霉素 （100 mg/L） 和 L-谷氨酰胺的 DMEM 中，在 10 cm 培养皿中，并在 37 °C、5% CO_{2 下}在 95% 加湿空气中孵育。
2. 使用 1：5 或 1：10 稀释度，一旦细胞达到 ~90% 汇合度，每 2-4 天传代一次细胞。
3. 实验前 2 天在玻璃盖玻片上接种用于转染的细胞。
   1. 在无菌条件下，在组织培养通风橱中用预热的培养基和 PBS 工作，从接近汇合的细胞培养皿中吸出培养基，并用 5 mL PBS 轻轻洗涤。
   2. 吸出 PBS 并加入 1 mL 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 3-5 分钟，直到细胞分离。
   将
   3. 细胞重悬于 4 mL 培养基中，并将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中。
   4. 使用血细胞计数器计数细胞数并计算细胞密度。
   5. 将细胞稀释至 1.5 x 10⁴ 个细胞/mL 的密度。
   将
   6. 2 mL 细胞悬液移液到 6 孔培养皿中涂有聚-D-赖氨酸涂层的 25 mm 玻璃盖玻片上。
   7. 将细胞在培养箱中孵育约 24 小时，直至 70% 汇合。
4. 按照制造商的说明使用转染试剂盒转染细胞，每 3 μL 转染试剂中含有 0.25 μg NLS-bPAC-nLuc DNA/0.75 μg NLS-H208 DNA，以及 2 μL 在缺乏酚红的 Opti-MEM 培养基中稀释的 P3000 试剂。
5. 将细胞置于培养箱中 ~48 小时，以允许足够的 bPAC-nLuc 表达，这对于产生可检测水平的 cAMP.
   至关重要 注意：bPAC-nLuc 表达的最低所需水平将根据刺激系统的效力和刺激的参数而变化。
6. 在盖玻片上准备细胞以进行成像。
   1. 从一个孔中吸出培养基，并用 2 mL PBS 洗涤两次。
   2. 使用一对镊子小心地提起盖玻片并将其放入成像室中。
   3. 向成像室中加入 1 mL 缺乏酚红的 Opti-MEM。细胞也可以在 HBSS 或任何其他生理荧光兼容溶液中成像。

2. 光模拟和活细胞成像

1. 在黑暗环境中对表达 NLS-bPAC-nLuc 的细胞进行细胞培养和作。为避免暴露在 <500 nm 波长下，请使用带有 13 W 琥珀色紧凑型荧光灯泡（材料表）的红色安全灯（材料表）。
2. 在配备 6 行多 LED 光引擎（材料表）、发射滤光片轮（材料表）、XY 载物台（材料表）、ORCA-Fusion 数字 CMOS 相机（材料表）和 100x/1.4 NA 油物镜 （∞/0.17/FN26.5） 的电动两层显微镜（材料表）中进行实验。使用数字显微镜软件（材料表）捕获图像。该装置能够通过使用 ZT458rdc 二向色滤光片提供的独立光路（材料表）来刺激细胞并同时进行 FRET 测量><。 注意：如果允许使用兼容的传感器同时进行光遗传学刺激和 FRET/强度测量成像，则可以使用任何采集设置。
3. 打开 UGA - 42 Geosystem。打开显微镜并使用适当的参数进行设置，以使用 H208 FRET 传感器进行采集。采集配置将取决于 FRET 传感器的表达水平。典型参数为 YFP/mScarletI 的 40 ms 仿真时间、15% 的 LED 功率和 0.5 Hz。
4. 打开 SysCon 软件和控制显微镜的成像软件。
5. 在 Camera （相机） 窗口中，选择 Calibration （校准） 选项卡，然后选择与光遗传学蛋白兼容的激光波长。要刺激 bPAC-nLuc，请使用 445 nm 的波长。
6. 每次使用前校准系统。这很重要，因为设置中的微小变化，甚至室温 （RT） 的变化，都会改变刺激的精度。
7. 在相机窗口中，选择 Camera 选项卡，然后单击以从想象软件开始采集。
8. 在 Image Viewer 窗口中，可视化从成像软件获取的细胞荧光的实时或先前采集，这将指导刺激对象的定位。
9. 在开始实验之前，使用 Click and Fire 模式快速评估单个单元格的响应能力。
10. 使用 Sequence-Manager 窗口，选择 以创建新序列。
    注意：要验证系统校准是否正确，请在 Image Viewer 窗口中绘制各种形状和大小。这些应与投射到细胞上的刺激模式精确对应，确保与预期设计准确对齐。
11. 在 Image Viewer 窗口 中，选择左侧工具栏中的 圆形 图标以绘制圆形刺激对象。
12. 创建多个相同的小圆圈并均匀分布，以确保均匀覆盖要刺激的细胞的整个细胞质。
13. 右键单击每个对象以验证圆形刺激对象的均匀性。将出现一个窗口;使用它来检查它们的半径、位置等。
14. 将半径设置在 1 到 5 之间，具体取决于使用的目标和单元格的大小。
15. 为了帮助使圆的间距和对齐方式均匀，请使用 View 子窗口中的 按钮。此外，使用 按钮设置网格的属性。
16. 确保均匀分布的圆形刺激对象的网格或矩阵完全覆盖细胞，并且其大小（例如，6 x 6 或 10 x 10）由细胞的大小决定。作为不应触发任何细胞事件的零刺激的对照，包括一些位于细胞外的圆圈。
17. 在 Image Viewer 窗口中创建的每个对象都将出现在 Timeline 窗口中。
    1. 在 Object Timing 子窗口中，配置每个刺激对象的临时属性（开始时间、持续时间、延迟）。
    2. 在 Lightsource 子窗口中，配置每个对象的波长和强度。对于此协议，请确保每个对象使用相同的波长，并且持续时间和强度相同。每个物体的开始时间会有所不同，它们之间的延迟可以根据预期结果而变化，以避免叠加不同刺激的效果。
18. 在 Timeline （时间轴） 窗口中，根据需要更改每个刺激对象的激活顺序。根据特定的实验，以规则模式（例如，从左到右，从上到下）或随机模式配置刺激。
19. 将序列上传到系统，并配置系统将执行的序列周期（运行）数。
20. 将感兴趣区域 （ROI） 放置在成像软件中的所需位置。
21. 开始使用显微镜获取荧光图像，然后按 UGA-42 窗口上的<播放>。

3. 数据分析

1. 虽然刺激系统提供的软件允许保存序列以供进一步使用，但它并不记录实际的实验信息。因此，请仔细记录与实验过程中采用的刺激点和序列相关的所有细节，包括位置、强度、持续时间、运行次数等参数。记录任何其他相关的实验条件，例如药物或特定解决方案。
2. 在实验过程中，将指定的 ROI 放置在成像软件上，以捕获来自整个细胞或细胞内特定位置的荧光强度变化。
3. 特别注意 ROI 相对于刺激点的位置。测量受刺激区域内或远离受刺激区域时的荧光强度变化。在实验后调整 ROI 的位置，提供成像软件以允许保存实验期间采集的图像，而不仅仅是 ROI 强度值。

Results

图 1 中呈现的结果表明，只有针对细胞核的刺激才能产生可测量的 cAMP 升高。这证实了 NLS-bPAC-nLuc 仅在 HC-1 细胞的核区室中表达。可以使用这种网格/基质模式精确刺激光遗传学蛋白，以绘制其细胞内分布图。此外，朝向核中心的较高 cAMP 升高反映了与位于核外围的点相比，中心点模拟的 bPAC-nLuc 质量更高（图 1）。

图 1：网格刺激协议和 cAMP 响应图。对转染 NLS-H208（cAMP 传感器）和 NLS-bPAC-nLuc 的 HC-1 细胞进行连续蓝光刺激（445 nm;脉冲间隔 30 s;脉冲序列：50 ms，总持续时间 500 ms，10 Hz，7% 激光功率）。左图显示了 H208 的黄色荧光蛋白 （YFP） 荧光，它与 sCMOS 相机捕获的实际光脉冲叠加在一起，以单个图像表示。右侧的轨迹显示了 NLS-bPAC-nLuc 刺激在每个刺激点触发的瞬时 cAMP 增加。使用覆盖整个细胞核的单个 ROI 测量减去背景的 NLS-H208 荧光，并计算归一化比值 （R/R0）。外部区域（第 1 行和第 7 行，A 列和 G 列）的响应为阴性，未显示。棒 = 3 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

本研究的目的是精确监测光遗传学蛋白的细胞内分布，并评估其在特定细胞质区室内的性能。我们还展示了点扫描系统对表达光遗传学蛋白的细胞的精确刺激能力。为了实现这一目标，我们采用了一种具有高表达水平但分布非常有限的细胞核靶向 bPAC-nLuc，仅限于细胞核。结果表明，仅相隔 ~1 μm 的刺激点可以触发 cAMP 的产生，也可以不触发 cAMP 的产生，具体取决于光遗传学蛋白的细胞分布;只有针对细胞核的刺激才能提高 cAMP 水平。在该协议中，目标不是产生局部的cAMP升高，而是表明短暂的光刺激可以足够准确，可以在细胞非常有限的区域激活光遗传学蛋白，而不会刺激周围的蛋白质。然而，这种方法构成了研究具有弥漫性分布和/或局部cAMP升高产生的其他光遗传学蛋白的必要控制。这可以通过改变光遗传学蛋白的表达水平、刺激的强度和频率等来实现。为了准确测量这些局部信号，仔细考虑采集参数和传感器特性至关重要。这包括选择适当的 ROI 位置和大小，确定采集频率，以及选择具有最佳亲和力、强度、动态范围和解离常数的 FRET/强度传感器。

在最近发表的一篇文章中，我们使用类似的策略在功能上证明了核靶向 bPAC-nLuc 的分布以及修饰磷酸二酯酶 （PDE;ΔRI-PDE8） 消除甲状腺衍生细胞系中 cAMP 升高的能力⁹。在本文中，我们沿直线而不是网格进行细胞刺激，并且照明点相对于细胞标志（例如，核中心、核边缘等）而不是以系统模式放置。值得注意的是，即使是针对核边缘的刺激也不足以触发可检测到的 cAMP 反应。我们推断这可能是由于刺激了足够的 NLS-bPAC-nLuc⁹ 质量。然而，在本方案中，一些针对核边缘附近的刺激引起了可检测到的cAMP增加。这种差异可归因于多种因素，包括bPAC-nLuc的表达水平、刺激的特征、细胞核的形态、内源性偏微分方程、缓冲蛋白的存在等。

虽然其他靶向或非靶向光遗传学蛋白可能表现出更分散的分布，但这种系统方法支持通过仔细设置实验和分析数据来得出有意义的结论。此外，这种方法能够靶向专门的细胞结构（例如片状伪足、树突、初级纤毛等），促进这些结构和/或细胞体的远端和近端区域反应之间的比较。

该策略还可用于评估 cAMP 通路中下游元件的激活，例如蛋白激酶 A （PKA） 或 cAMP 直接激活的交换蛋白 （EPAC1）。此外，由于 bPAC-nLuc 不受与内源性 AC 相同的调节剂的影响，内源性 AC 可能受到与蛋白质或其他因素的局部相互作用的影响，因此可以假设在相同的表达水平下，它可以始终产生相同数量的 cAMP。通过检查 cAMP 升高的降低或暂时升高后 cAMP 水平的降低，该方法可以评估 cAMP 降解、扩散或内源性或转染的偏微分方程的功能和分布。事实证明，该策略对于评估任何光遗传学蛋白在不同细胞位置的行为特别有用，有助于避免在细胞质内任意放置刺激点的偏差。

重要的是要考虑到刺激点的大小及其能量最终将取决于所用设置的特定特性（光路、物镜、扫描系统等）。为确保结果准确，在每个特定系统中进行每个实验时，应考虑光遗传学蛋白的相对表达、细胞对所用波长的敏感性以及任何其他参数。还必须注意的是，我们还没有研究系统在实施更小的刺激点和/或更密集的网格（即间距较小的刺激点）时可以驱动的全部程度，以系统地评估更小的细胞结构，并具有更高的精度。此外，我们仅使用 UGA-42 地理点扫描系统测试了此策略。这种方法可以使用不同的系统，前提是它们可以可重复地生成均匀分布的局部点。应优化每个系统以产生类似的结果。

最后，应仔细评估刺激系统对FRET传感器的潜在刺激。例如，青色荧光蛋白（CFP）肯定会被本协议中使用的445nm激光器刺激甚至漂白。使用更高的激光效力（或更高的透射率中性密度 （ND） 滤光片）将增加刺激荧光传感器的机会，并向实验引入错误信息和/或产生数据分析问题。还应仔细评估 FRET/强度传感器的正常光漂白。最后，由于bPAC对环境光敏感，即使在黑暗条件下也会产生cAMP（bPAC的暗活性已测量为33 ± 5 pmol/min/mg的蛋白质³），因此转染bPAC-nLUC后应小心作细胞以避免光污染（例如，在培养箱中，实验前和/或实验期间等）。可选地，细胞可以与PDE抑制剂（例如，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤;IBMX¹⁰）确定bPAC-nLuc的基线活性，并确认所使用的照明条件适当黑暗。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13 W 琥珀色紧凑型荧光灯泡 - 低蓝光	光子学发展
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （IBMX）	Sigma	I7018
6 行多 LED 流明光谱 X	流明		6 线多 LED 光引擎
康宁 - DMEM	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - 常规胎牛血清	Thermo Fischer	MT35011CV
盖眼镜：圆圈	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 深红色安全灯滤光片 5.5"	柯达	1416827	红色安全灯
Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 10x	Thermo Fischer	14185052	稀释至 1x，调节 pH
LDI-7	89 North
L-谷氨酰胺	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	Thermo Fischer	L3000001	转染试剂盒
奥林巴斯 IX83 电动 双层 显微镜	奥林巴斯		电动双层显微镜
Opti-MEM，无酚红	Thermo Fischer	11058021
ORCA-fusion 数字 CMOS 相机	滨松	C14440-20UP
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Thermo Fischer	15140122
磷酸盐缓冲溶液 （1x）	Lonza	17516F
Prior 排放滤光片转盘和滤光片组	Prior Scientific， Inc.		发射滤光片轮
之前 Proscan XY 载物台	Prior Scientific， Inc.		XY 载物台
幻灯片 6	智能成像创新		数字显微镜软件
SysCon 软件	SysCon 软件		由刺激系统提供
UGA-42 地理	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA 油物镜 （∞/0.17/FN26.5）
ZT458RDC 二向色性	Chroma Technology Corp		BS，波长 （CWL）： 498 纳米