人外周淋巴细胞中γH2AX与53BP1的双重免疫荧光染色

摘要

本方案介绍了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周血淋巴细胞间期细胞核中γH2AX和53BP1焦点，以评估DNA双链断裂形成与修复的方法。

摘要

双链断裂（DSBs）是细胞核内可能发生的最严重的损伤之一，若未得到修复，可能导致包括癌症在内的严重后果。因此，细胞具备复杂的机制来修复双链断裂，这些修复通路涉及组蛋白H2AX在丝氨酸139位点的磷酸化形式（即γH2AX）以及p53结合蛋白1（53BP1）。由于这两种蛋白均能在双链断裂位点形成焦点（foci），因此检测这些标志物被认为是研究双链断裂及其修复动力学的合适方法。根据导致γH2AX和53BP1焦点形成的分子过程，研究这两种蛋白在双链断裂附近的共定位可能更有助于建立一种替代性方法，通过同时检测两种DNA损伤标志物来定量分析双链断裂。因此，本实验方案旨在通过双标免疫荧光法检测γH2AX和53BP1焦点的存在，评估放射模拟剂博来霉素在人淋巴细胞中诱导的基因组损伤。利用该方法，我们还描绘了γH2AX和53BP1焦点数量随时间的变化，作为研究博来霉素诱导的双链断裂修复动力学的初步尝试。

引言

DNA损伤持续由内源性因素（如细胞氧化代谢产生的活性氧ROS）或外源性因素（包括化学物质和物理因素）诱导¹。在各类有害损伤中，双链断裂（DSBs）在导致基因组不稳定性方面起着关键作用，因其可引发染色体畸变，进而可能启动致癌过程。因此，细胞具备复杂而高效的双链断裂修复机制²。

当双链断裂（DSB）发生时，细胞会启动DNA损伤应答（DDR），在此过程中，ATM或ATR激酶与MRE11/RAD50/NBS1复合物共同被招募，以激活其他蛋白，从而减缓或阻滞细胞周期³。这些激酶的一个关键靶点是组蛋白H2AX，其在DSB位点周围数兆碱基范围内丝氨酸139位点被磷酸化（即γH2AX），从而促进多种修复因子的募集，其中包括BRCA1和p53结合蛋白1（53BP1）³。随后，细胞将启动同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）或单链退火（SSA）中的一条通路来修复DSB^4,5。因此，53BP1参与调控HR与NHEJ之间的选择，主要促进NHEJ而非HR的激活⁶。此外，磷酸化的H2AX组蛋白和53BP1均可在DSB位点形成焦点结构。由于这些焦点在双链完整性恢复之前持续存在，因此在特定时间间隔内检测γH2AX或53BP1焦点的出现或消失，被视为评估细胞系统中DSB发生及修复情况的有效方法^6,7。然而，根据上述分子机制，由于在DDR过程中γH2AX和53BP1焦点预期会在DSB附近共定位^8,9，因此采用双标免疫荧光法同时检测这两种标志物的存在将具有重要意义。

因此，本研究的目的是评估同时定量γH2AX和53BP1焦点以检测博来霉素这一放射模拟剂在人外周血淋巴细胞中诱导的基因组损伤的适用性。采用相同的方法，我们还尝试根据先前建立的实验方案¹⁰，阐明博来霉素诱导的DNA双链断裂（DSBs）的修复动力学。

方案

本研究经比萨大学伦理委员会批准，并已获得每位捐赠者的知情同意和签字确认。

1. γH2AX 和 53BP1 焦点的形成

1. 样品制备与诱变处理
   1. 通过静脉穿刺从健康成年个体采集全血样本至采血管中例如，含肝素锂作为抗凝剂的真空采血管（Vacutainer）管。
   2. 为确保血液样本的适当保存，应在采样后24小时内开始操作。
   3. 向含有4.7 mL完全培养基（含0.5%青霉素-链霉素、0.75%植物血凝素、10%预灭活胎牛血清、88.75% RPMI 1640）的试管中加入300 µL样本。
   4. 然后加入博来霉素硫酸盐，使其终浓度为 5 µg/mL。
      警告：硫酸博来霉素是一种诱变剂，避免皮肤接触和吸入。请在通风橱内配制溶液并添加样品。
   5. 每个样本均需设置阴性对照（无诱变剂）。
   6. 将试管置于37 °C恒温器中孵育2 h。
2. 固定
   1. 以 540 x g 离心样品 g 室温下孵育5分钟。
   2. 吸弃上清液，并用涡旋振荡重悬沉淀。
   3. 加入5 mL低渗溶液（将2.87 g KCl溶解于500 mL去离子水中）和400 µL预固定液（冰醋酸:甲醇 = 5:3），以诱导红细胞溶血。
   4. 以 540 x g 离心样品 g 室温下孵育5分钟。
   5. 吸弃上清液，将沉淀物在室温下重悬于5 mL甲醇中，固定细胞至少30分钟。
   6. 或者，将细胞在 -20 °C 保存至使用。
3. 载玻片制备
   1. 以 540 x g 离心样品 g 室温下孵育5分钟。
   2. 吸弃上清液，将沉淀重悬于5 mL甲醇:乙酸（3:1）溶液中。重复此步骤一次。
   3. 最后，将溶液再次在540 x g条件下离心 g 室温下孵育5分钟。
   4. 再次吸去上清液，保留足够溶液（0.5 mL）以重悬沉淀，用力吹打混匀，将重悬的细胞沉淀滴加至载玻片上，室温晾干。将载玻片置于4 °C保存。
4. 免疫荧光
   注意：免疫荧光是一种利用免疫学方法鉴定特定细胞靶标的实验技术，通过靶标特异性的一抗与靶标结合，再使用荧光标记的二抗与一抗结合，从而实现靶标的定位。¹¹在此情况下，一抗使用小鼠单克隆抗53BP1抗体（1:50）和兔多克隆抗γH2AX抗体（1:50），二抗分别使用AlexaFluor568标记的抗小鼠抗体（1:400）和DyLight488标记的抗兔抗体（1:200）。
   1. 将载玻片在50 mL 1×PBS中于考普林瓶内清洗两次，每次5分钟（16张载玻片背对背放置）。
   2. 然后在封闭液（10 mL FBS、10 mL 10x PBS、80 mL 去离子水、300 µL Triton-X）中孵育 30 分钟。
   3. 每张载玻片上各加入10 µL含有初级抗体的两种溶液（溶于封闭液中），用石蜡膜覆盖载玻片，4 °C孵育过夜。
   4. 孵育后，用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
   5. 向每张载玻片分别加入 10 µL 含有溶解于封闭液中的两种二抗的溶液。用石蜡膜覆盖载玻片，并在室温下孵育 2 h。
   6. 用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
   7. 在组装前，于盖玻片上加入2.5 µL含DAPI的抗荧光淬灭剂以对细胞核进行复染。
      ​注意：为了评估焦点动力学，操作步骤与1.1至1.4所述相同，但需注意细胞收获和双重免疫荧光染色分别在博来霉素处理后0 h、2 h，以及去除诱变剂后4 h、6 h和24 h进行。

2. 通过荧光显微镜进行分析

注意："荧光显微镜"是指利用荧光生成图像的任何类型显微镜。样品被特定波长（或多个波长）的光照射，该光被荧光染料吸收，从而使其发射出更长波长的光¹²。AlexaFluor568 和 DyLight 488 分别吸收约 568 nm 和 488 nm 的光，并分别发射 603 nm 和 520 nm 的光。因此，使用 TRITC 或 FITC 滤光片时，它们分别呈现为红色或绿色荧光。

1. 在100倍油镜下对每张切片中的焦点进行评分（图1）。
2. 每张切片评分200个细胞核，并计数每个细胞核中γH2AX/53BP1焦点的数量。
3. 结果以每200个评分细胞核中平均焦点数表示。评分细胞核包括γH2AX/53BP1阳性（显示至少一个荧光信号）和阴性（无任何荧光信号）的细胞核。

结果

通过对外周淋巴细胞进行荧光显微镜分析所获得的数据，使我们能够评估三个主要方面：一是博来霉素治疗因其致突变效应而增加γH2AX和53BP1焦点（从而增加DNA双链断裂，DSB）数量的有效性；二是两种焦点在DSB位点共定位的程度；三是γH2AX和53BP1焦点随时间的变化过程，以描绘博来霉素诱导的DSB修复动力学。正如预期，处理细胞与未处理细胞相比，γH2AX和53BP1焦点的频率显著更高，从而证实博来霉素可诱导外周淋巴细胞中DSB的形成（图2）。

两种标记物的焦点数量存在显著差异；特别是，γH2AX 焦点数量多于 53BP1 焦点，这表明共定位并不总是发生，可能取决于多种因素（图 3）。

关于DSB的修复动力学，首先需要强调的是，焦点的实际修复可能在首个选定的时间点（2小时）之前就已经开始；在不同的时间点，我们既可观察到新形成的焦点，也可观察到先前形成但尚未完成修复的焦点。

讨论

γH2AX和53BP1焦点的免疫荧光分析是评估细胞系统间期细胞核基因组损伤的合适方法。该实验流程包含多个可能影响实验结果的关键环节，主要包括固定和通透所用的试剂、抗体的类型及其稀释倍数，以及诱变剂的浓度。

维持蛋白质完整性至关重要，因为免疫荧光方法旨在识别主要为蛋白质的抗原。在本方案中，使用甲醇固定淋巴细胞。此步骤尤为关键，因为醇类通过置换水分导致可溶性蛋白质沉淀，而其他未固定的细胞组分则可通过生理盐溶液（如PBS）洗涤去除¹³。

另一个关键步骤是通透化，该步骤通过封闭液来实现，在本实验中，封闭液同时完成通透化和封闭作用。封闭是通过在溶液中添加胎牛血清（FBS）实现的：FBS可与样本中的蛋白质结合，防止抗体与非特异性靶点结合，因为FBS与抗体特异性靶点之间的结合可在后续被破坏，而抗体与其靶点本身具有更高的亲和力，从而确保特异性结合。通透化可使用多种溶剂进行，本实验中采用非离子型去污剂Triton X-100：该试剂可插入磷脂双分子层，溶解细胞膜并最终破坏其结构

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlexaFluor 568 山羊抗小鼠 IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 二抗
Bleoprim	Sanofi		博来霉素硫酸盐（诱变剂）
青霉素-链霉素溶液 100X	Euroclone	ECB3001D	培养基用抗生素
PBS 10X	Termofisher	14200075	磷酸盐缓冲液
FBS	Euroclone	EC20180L	免疫荧光用胎牛血清
山羊抗兔 IgG (H+L) DyLight 488 标记	Termofisher	#35552	γH2AX 二抗
小鼠抗 53BP1 单克隆抗体	Merck	MAB 3802	53BP1 一抗
Labophot 2	Nikon		荧光显微镜
磷酸化组蛋白 H2AX (Ser139) 兔抗体	Cell Signaling	#2577	γH2AX 一抗
植物血凝素	Termofisher	R30852801	培养基组分
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Cell Signaling	#8961	用于复染的含 DAPI 抗荧光淬灭溶液
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	培养基
Triton-X100	Sigma	T9284	用于透化的非离子型去垢剂