方法文章

使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E-/- 敲除细胞系

DOI：

10.3791/65476

⸱

2023年6月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文报道了利用CRISPR/Cas9系统构建着丝粒相关蛋白E（CENP-E）基因敲除细胞及三种基于表型的筛选策略。我们已利用CENP-E 基因敲除细胞系建立了一种新方法，用于验证CENP-E抑制剂的特异性和毒性，该方法对药物开发和生物学研究具有重要意义。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9 系统已成为在多种生物体中进行精确高效基因编辑的强大工具。着丝粒相关蛋白 E（CENP-E）是一种向微管正端移动的驱动蛋白，参与动粒-微管捕获、染色体排列以及纺锤体组装检验点的调控。尽管 CENP-E 蛋白的细胞功能已被广泛研究，但使用传统方法研究其直接功能仍存在困难，因为 CENP-E 的缺失通常会导致纺锤体组装检验点激活、细胞周期阻滞以及细胞死亡。在本研究中，我们利用 CRISPR/Cas9 系统在人 HeLa 细胞中完全敲除了 CENP-E 基因，并成功构建了 CENP-E-/- HeLa 细胞系。

建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型以及CENP-E蛋白的荧光强度检测，这些策略显著提高了CENP-E基因敲除细胞的筛选效率和实验成功率。重要的是，CENP-E基因的缺失会导致染色体排列异常、有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶B（BubR1）蛋白定位异常以及有丝分裂缺陷。此外，我们利用CENP-E基因敲除的HeLa细胞模型，开发了一种针对CENP-E特异性抑制剂的鉴定方法。

本研究建立了一种验证CENP-E抑制剂特异性和毒性的有效方法。此外，本文介绍了利用CRISPR/Cas9系统进行CENP-E基因编辑的实验方案，该方法可作为研究CENP-E在细胞分裂中作用机制的有力工具。同时，CENP-E 基因敲除细胞系将有助于CENP-E抑制剂的发现与验证，对肿瘤药物研发、细胞生物学中细胞分裂机制的研究以及临床应用具有重要意义。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因组编辑技术可实现对多种细胞和生物体中基因的靶向修饰。在真核生物中，可通过使用序列特异性核酸酶诱导靶标DNA的同源重组，从而实现位点特异性突变1。近年来，已开发出多种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶（ZFNs）2,3、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）4,5以及归巢大核酸酶（homing meganucleases）6,7，这些技术均可在基因组特定位点进行切割，但往往需要复杂的蛋白质工程和重复的实验流程。研究表明，II型原核生物成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统是一种高效的基因编辑技术，可在多种细胞和物种中特异性地介导RNA引导的位点特异性DNA切割8,9,10,11。CRISPR/Cas9基因敲除技术已彻底改变了基础生物学、生物技术和医学领域12。

细菌和大多数古菌进化出了一种基于RNA的适应性免疫系统，该系统利用CRISPR和Cas蛋白来识别并摧毁病毒和质粒13。Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）核酸酶包含类RuvC的Holliday连接体解离酶（RuvC）结构域和组氨酸-天冬酰胺-组氨酸（HNH）结构域，通过提供包含CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）的合成单导向RNA（sgRNA），可高效介导序列特异性的双链断裂（DSBs）14,15,16。双链断裂可通过产生插入缺失的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复，从而在哺乳动物细胞中引入多种突变，包括插入、缺失或无痕的单核苷酸替换1,8。易错的NHEJ途径和高保真的HDR途径均可用于介导基因敲除，通过插入或缺失导致移码突变和提前终止密码子的产生10。

驱动蛋白-7 CENP-E 在细胞分裂过程中对动粒-微管连接和染色体排列至关重要17,18,19抗体显微注射20,21，siRNA 耗竭22,23，化学抑制24,25,26，以及基因敲除27,28,29 CENP-E的缺失会导致染色体排列异常、纺锤体组装检查点激活以及有丝分裂缺陷，进而引起非整倍性和染色体不稳定性19,30在小鼠中， CENP-E 缺失会导致发育异常，并在发育的极早期阶段引发胚胎致死27,29,31基因敲除 CENP-E 通常会导致染色体错位和细胞死亡26,27,29，这阻碍了对CENP-E蛋白功能和作用机制的研究。

最近一项研究利用一种可诱导的生长素CRISPR/Cas9基因编辑方法建立了条件性CENP-E基因敲除细胞系32，可在相对较短的时间内实现CENP-E蛋白的快速降解33。然而，迄今为止尚未建立稳定的CENP-E基因敲除细胞系，这是CENP-E生物学领域尚未解决的一项技术挑战。考虑到遗传稳健性34、遗传补偿反应35,36,37以及复杂的细胞内环境，完全删除CENP-E的直接后果可能十分复杂且难以预测。因此，建立CENP-E基因敲除细胞系对于研究染色体排列机制、纺锤体组装检查点以及下游信号通路具有重要意义。

CENP-E抑制剂的发现及其应用对癌症治疗具有重要意义。迄今为止，已发现并合成了七类CENP-E抑制剂，包括GSK923295及其衍生物24,25、PF-277138,39、咪唑并[1,2-a]吡啶骨架衍生物40,41、化合物A42,43、syntelin44,45、UA6278446以及苯并[d]吡咯并[2,1-b]噻唑衍生物47。在这些抑制剂中，GSK923295是一种变构性且高效的CENP-E抑制剂，可结合于CENP-E的马达结构域，抑制CENP-E微管刺激的ATP酶活性，其Ki值为3.2 ± 0.2 nM24,25。然而，与GSK923295在培养的癌细胞中的抑制效果相比，其在临床癌症患者中的治疗效果并不理想48,49，这也引发了人们对GSK923295作用于CENP-E特异性的担忧。此外，其他CENP-E抑制剂对CENP-E蛋白的特异性及其副作用也是癌症研究中的关键问题。

本研究利用 CRISPR/Cas9 系统在 HeLa 细胞中完全敲除了 CENP-E 基因。我们建立了三种优化的基于表型的筛选策略，包括细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及 CENP-E 蛋白的荧光强度检测，以提高 CENP-E 基因编辑的筛选效率和成功率。此外，CENP-E 基因敲除细胞系可用于验证候选化合物对 CENP-E 的特异性。

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方案

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1. CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

  1. 选择人类基因组DNA中的目标序列 CENP-E 基因（GenBank 登录号 NM_00128674.2）并使用在线 CRISPR 设计工具（http://crispor.tefor.net/）设计 sgRNA。
  2. 输入一条基因组序列，选择“Homo sapiens人UCSC 2013年12月版本（hg38分析集）+ 单核苷酸多态性（SNPs）：dbSNP148，选择原间隔序列邻近基序“20 bp-NGG-spCas9”。根据特异性评分，选择两条引导序列，包括sgRNA-1（5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3'）和sgRNA-2（5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3'）50，预测效率10，且脱靶效应最小。
  3. 订购并合成单链DNA寡核苷酸（ssODNs）。将ssODNs溶解于ddH₂O中2O至终浓度100 µM。为磷酸化并退火sgRNA寡核苷酸，于一聚合酶链式反应（PCR）管中加入1 µL正向寡核苷酸、1 µL反向寡核苷酸、0.5 µL T4多核苷酸激酶、1 µL T4多核苷酸激酶缓冲液及6.5 µL无RN酶水，于37 °C孵育30分钟，95 °C孵育5分钟；随后以5 °C/min速率降温至25 °C-1.
  4. 使用 BbsI 酶切 pX458 质粒Chemical equilibrium; K_eq=multiplicative relation; balance and reaction rates visual. 限制性内切酶。加入1 µg pX458质粒、2 µL 10x缓冲液G、1 µL BbsChemical equilibrium; K_eq=multiplicative relation; balance and reaction rates visual.，并加入无RNase的ddH₂O2将体积补至20 µL放入1.5 mL离心管中。37 °C孵育2 h。随后根据生产商说明书，使用柱式DNA胶回收试剂盒纯化线性化质粒。
  5. 将sgRNA寡核苷酸连接至pX458质粒（pSpCas9(BB)-2A-绿色荧光蛋白（GFP）质粒，Addgene编号：48138）。加入1 µL退火后的寡核苷酸、25 ng线性化质粒、1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、0.5 µL T4 DNA连接酶（350 U/µL），用ddH₂O补足至10 µL。2在1.5 mL离心管中。将连接反应液于16 °C孵育2 h。
  6. 将10 µL构建好的质粒与感受态DH5α细胞在冰上孵育30 min，42 °C热激45 s，立即放回冰上放置5 min。加入500 µL LB（Luria-Bertani）培养基，将细胞接种至含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB平板上。37 °C孵育16 h后筛选抗性克隆。
  7. 用无菌的移液器吸头挑选5-10个单菌落，转移至含氨苄青霉素（100 µg/mL）的1 mL LB培养基中。在37 °C、180 rpm条件下振荡培养12-16 h。
  8. 使用质粒提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明提取质粒DNA。通过Sanger测序对每个菌落的质粒DNA进行验证 U6 启动子位点，使用 U6-Fwd 引物 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'。
  9. 使用无内毒素质粒DNA试剂盒，按照生产商的说明书提取和纯化质粒。

2. 转染、分离及筛选 CENP-E 敲除的HeLa细胞

  1. 在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HeLa细胞，培养条件为37 °C、5% CO₂的湿润培养箱2.
  2. 使用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）在37 °C下孵育HeLa细胞2-3分钟，轻轻吹打使细胞解离，然后按1:4的传代比例将细胞接种至新的培养板中。
  3. 在12孔板中接种细胞，培养至60–70%融合度后进行转染。根据制造商说明书，使用参考试剂将pX458-sgRNA质粒转染至HeLa细胞中（参见 材料表).
    1. 在A管中，轻轻混合1 µg经验证的pX458-sgRNA质粒和50 µL低血清培养基。在B管中，轻轻混合2 µL转染试剂和50 µL低血清培养基。将A管和B管分别在室温下孵育5分钟。
    2. 轻轻混合A管和B管，并在室温下孵育5分钟。将混合物加入12孔板中，孵育细胞6小时，然后更换为新鲜的DMEM培养基。
  4. 在转染后24小时或48小时，使用荧光显微镜观察HeLa细胞以评估转染效率。转染48小时后，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA在37 °C处理3–5分钟，将转染后的HeLa细胞完全解离，用Neubauer计数板或自动细胞计数仪计数细胞，并根据梯度稀释法将细胞接种至三个独立的96孔板中，每个转染细胞群体分别接种三份10.
  5. 将细胞放回加湿的培养箱中，继续培养1-2周，每3天更换一次培养基。用于基于表型的筛选与验证 CENP-E 在24孔板或12孔板中对细胞进行敲除、解离并扩增培养5-7天。
  6. 使用配备10倍和20倍物镜的倒置显微镜，筛选菌落直径较小的突变细胞。
    注意： CENP-E 突变通常会导致细胞克隆中分裂细胞数量显著增加，这可能成为筛选的关键指标之一 CENP-E 突变细胞。
  7. 使用柱式动物基因组DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书提取细胞DNA。PCR反应体系设置如下：0.25 µL Taq DNA聚合酶，5 µL 10x缓冲液（含Mg²⁺）2+ 加），4 µL dNTP 混合物，500 ng DNA 模板，1 µL 正向引物，1 µL 反向引物，并用 ddH₂O 调整至终体积20 至 50 µL。采用以下 PCR 程序进行基因扩增：98 °C 预变性 10 s；98 °C 变性 10 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 60 s，共 33 个循环；72 °C 最终延伸 10 min，然后 4 °C 保存。
    注意：用于目标位点克隆的特异性引物序列如下所列： CENP-E 靶标 F1，5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'； CENP-E 靶序列 R1，5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'； CENP-E 靶标 F2，5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'； CENP-E 靶标 R2，5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'。
  8. 按照生产商的说明书，将目标DNA连接至pMD18-T载体中。将连接产物转化至感受态DH5α细胞中，培养并筛选克隆。
  9. 进行桑格测序以确定类型 CENP-E 敲除。根据制造商的说明书，使用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。使用M13正向和反向引物对每个菌落的质粒DNA进行Sanger测序。M13F引物序列：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'；M13R引物序列：5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'。
  10. 接种野生型和 CENP-E 分别将突变的HeLa细胞接种于24孔板中的12 mm玻璃盖玻片上。移除完全DMEM培养基，于室温下用4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）固定液固定细胞10分钟。
  11. 用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液在室温下染色细胞核5分钟。筛选并验证 CENP-E 使用配备 Plan Fluor 40x/数值孔径（NA）0.75 物镜的荧光显微镜，根据染色体排列的表型筛选突变细胞。
  12. 使用免疫荧光染色和对CENP-E蛋白的分析（见第3节）筛选并验证CENP-E基因敲除细胞。

3. 免疫荧光染色与高分辨率共聚焦显微镜观察

  1. 在室温下用 4% 多聚甲醛/PBS 固定液固定细胞 10 分钟，并在 1× PBS 中浸洗 2 次，每次 5 分钟。
    注意：确保细胞处于良好状态，并轻柔地收集和固定细胞，以避免中期细胞脱落。
  2. 在室温下用 0.25% Triton X-100/PBS 处理细胞 10 分钟，然后在 1× PBS 中浸洗 2 次，每次 5 分钟。
  3. 在室温下用 1% BSA/PBST（含 0.1% Tween 20 的 PBS）封闭细胞 1 小时。用 1% BSA/PBST 稀释一抗，将样本在 4 °C 下孵育 12 小时。
  4. 弃去一抗溶液，用 1× PBS 漂洗细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下加入稀释的二抗孵育 2 小时。
  5. 弃去二抗溶液，用 1× PBS 漂洗细胞 3 次，每次 5 分钟。
  6. 在室温下用 DAPI 染色细胞核 5 分钟。用封片剂封片，并用指甲油密封盖玻片。
  7. 使用配备 63×/NA 1.40 物镜的激光扫描共聚焦显微镜观察并采集荧光图像。

4. 染色体标本制备与核型分析

  1. 培养野生型和 CENP-E-/- 在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完全DMEM培养基中培养HeLa细胞24小时，然后孵育野生型和 CENP-E-/- HeLa细胞用300 nM秋水仙素处理5小时。
  2. 将细胞在37 °C下用0.25%胰蛋白酶/EDTA孵育3分钟，并将细胞收集至1.5 mL离心管中。
  3. 以 1,000 × g 离心细胞 g 室温孵育5分钟，弃去上清液，加入1.2 mL 0.075 mol/L KCl溶液，37 °C孵育20分钟。
  4. 以 1,000 × g 室温孵育5分钟，弃去上清液，加入0.2 mL固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1）进行预固定，轻轻混匀1分钟。
  5. 以 1,000 × g 离心细胞 g 室温下孵育5分钟，收集沉淀物，加入1.5 mL室温固定液，作用10分钟，然后在1,000 × g 室温下孵育5分钟。
  6. 弃去上清液，加入0.6 mL固定液，制备细胞悬液。将细胞悬液从35–40 cm高度滴加3–5滴至预冷的载玻片上。
    注意：将细胞悬液滴加到载玻片上时，高度应保持在35–40 cm；否则染色体可能过于分散或彼此无法分离。
  7. 立即用酒精灯烘干载玻片，用10%吉姆萨染色液对样品染色7分钟，用流水冲洗载玻片2分钟，然后使用配备Plan Fluor 40x/NA 0.75物镜的光学显微镜观察样品。

5. 细胞克隆形成实验

  1. 在6孔板中制备细胞悬液，细胞密度为每孔1,000–2,000个细胞。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。
  2. 将6孔板放入CO2培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养2–3周，每5天更换一次培养基。使用配备10倍和20倍物镜的倒置显微镜记录图像。当细胞克隆可见（每个克隆包含数百个细胞）时，收集细胞。
  3. 为研究GSK923295的作用，先将细胞在6孔板中培养24小时，然后加入2 mL GSK923295，使其终浓度分别为10、25、50、100和200 nM。
    注意：在克隆形成的早期阶段，不要移动培养皿，以避免细胞脱落形成新的克隆，从而影响转染细胞的筛选。
  4. 弃去培养基，加入1%多聚甲醛于室温固定细胞10分钟。用0.1%结晶紫染色液于室温染色15分钟。用1× PBS冲洗样本三次。使用ImageJ软件记录细胞克隆图像并测量各克隆的直径。选择直线选择工具，点击分析，选择测量，记录长度。
  5. 用1 mL 10%乙酸溶液冲洗克隆5分钟。取200 µL上清液转移至96孔板中，使用酶标仪在A600 nm处测定吸光度值。

6. 细胞活力检测

  1. 将细胞接种于24孔板中，在37 °C培养48小时，至细胞密度达到80–90%。
  2. 加入100 µL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液，于37 °C孵育3分钟。
  3. 用移液器将400 µL PBS与细胞混合，取100 µL细胞悬液转移至96孔板中。
  4. 每孔加入20 µL MTS溶液，终浓度为317 µg/mL，按照试剂盒说明书轻轻混匀。将样品置于CO2培养箱中，37 °C孵育1–3小时。
  5. 使用酶标仪在A490 nm波长处测定各孔的吸光度值，并以A630 nm作为参考波长，扣除细胞碎片及非特异性吸收带来的背景信号（细胞活力 = A490nm - A630 nm）。

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结果

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该 CENP-E-/- HeLa细胞已通过CRISPR/Cas9系统成功构建（图1）。该方法的时间线和关键实验步骤如下所示： 图1首先，我们设计并合成了 CENP-E特异性的sgRNA，将sgRNA退火并连接至pX458质粒中，将该质粒转染入HeLa细胞，并培养48小时。转染后的细胞经消化分散，通过连续稀释法接种于96孔板中图1A）。挑选单菌落，并采用三种基于表型的策略进行筛选。突变类型及 CENP-E 敲除细胞通过PCR、Sanger测序和免疫荧光实验进行验证（图1A）。第1外显子和第13外显子 CENP-E 基因被选为4号染色体上的靶向位点（图1B）。CRISPR/Cas9 系统利用 RuvC 和 HNH 核酸酶结构域，在原间隔序列邻近基序（PA...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

驱动蛋白-7 CENP-E 是细胞分裂过程中染色体排列和纺锤体组装检查点的关键调控因子17,19,20。CENP-E 的基因缺失通常会导致纺锤体组装检查点激活、细胞周期阻滞以及细胞死亡27,29,51,52。因此，构建稳定的 CENP-E 基因敲除细胞系是 CENP-E 生物学研究中一个尚未解决的重要问题。本研究利用 CRISPR/Cas9 系统成功构建了 CENP-E 基因敲除的 HeLa 细胞。本研究建立了三种优化的基于表型的筛选策略——细胞克隆筛选、染色体排列表型分析以及 CENP-E 蛋白荧光强度检测——显著提高了 CENP-E 基因敲除细胞的筛选效率和成...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢福建医科大学细胞骨架实验室所有成员的有益讨论。感谢福建医科大学公共技术服务中⼼的林俊进、黄志宏、林玲、庞丽丽、周林英、林曦和吴敏霞提供的技术支持。感谢福建医科大学基础医学实验教学中心郑思怡、林颖和柯祺给予的支持。本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（项目编号 82001608 和 82101678）、中国福建省自然科学基金（项目编号 2019J05071）、中国福建省科技创新增量联合资金（项目编号 2021Y9160）以及福建医科大学高层次人才科研启动基金项目（项目编号 XRCZX2017025）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
1.5 mL 离心管AxygenMCT-150-C
24孔板康宁3524
4S Gelred，水中10,000倍浓缩液上海桑谷生物技术有限公司A616697
50 mL 离心管康宁430828
6 cm 培养皿康宁430166
95% 乙醇国药化学试剂10009164
96孔板康宁3599
乙酸国药集团化学试剂10000218溶于 H2O 以配制10%的工作液。
琼脂糖生工生物（上海）A620014
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG(H+L)BeyotimeA0428用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG(H+L)BeyotimeA0423用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。
Alexa Fluor 555 标记的驴抗小鼠 IgG(H+L)BeyotimeA0460用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:500 稀释。
无水乙醇国药集团化学试剂有限公司100092690
抗BubR1兔单克隆抗体Abcamab254326用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:100 稀释 
抗CENP-B小鼠单克隆抗体Santa Cruz Biotechnologysc-376392用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:50 稀释。
抗CENP-E兔单克隆抗体Abcamab133583用于免疫荧光。用 1% BSA/PBST 溶解，按 1:100 稀释。
抗荧光淬灭封片剂BeyotimeP0131减缓荧光信号的淬灭
抗-α微管蛋白小鼠单克隆抗体Abcamab7291用于免疫荧光。溶于 1% BSA/PBST 中，按 1:100 稀释。
Biotek Epoch 微孔板分光光度计Biotek InstrumentsBiotek Epoch
牛血清白蛋白（BSA）国药集团化学试剂69003435
BpiI (BbsI)赛默飞世尔科技ER1011
CellTiter 96 Aqueous 单溶液细胞增殖检测PromegaG3580
离心Eppendorf5424BK745380
秋水仙碱国药集团化学试剂61001563
共聚焦扫描显微镜LeicaLeica TCS SP8
盖玻片CITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α 感受态细胞上海桑谷生物技术有限公司B528413
DL2000 DNA markerTaKaRa3427A
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）GibcoC11995500BT
无内毒素质粒小提试剂盒 <图像替代文本"公式 2" 源文本：src="/files/ftp_upload/65476/65476eq02.jpg" 样式="margin: auto;"/>OmegaD6950
Ezup柱式动物基因组DNA纯化试剂盒上海桑谷生物技术有限公司B518251
胎牛血清浙江天航生物科技11011-8611
龙胆紫国药集团化学试剂71019944用 PBS 溶解，配制 0.1% 龙胆紫/PBS 溶液。
吉姆萨染色液国药集团化学试剂有限公司71020260
GraphPad Prism 8.0 版本软件GraphPadwww.graphpad.com统计分析。
GSK923295MedChemExpressHY-10299
HeLa细胞系ATCCCCL-2
加湿培养箱Heal ForceHF90/HF240
Image J 软件美国国立卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/图像处理与分析
倒置显微镜南京江南永新光学XD-202
LB 琼脂粉上海桑谷生物技术有限公司A507003
Lipo6000 转染试剂BeyotimeC0526
尼康 Ti-S2 显微镜尼康Ti-S2
Opti-MEM 降低的 血清 培养基Gibco31985070
多聚甲醛国药集团化学试剂80096618用 PBS 溶解，配制 4% 多聚甲醛/PBS 溶液。
青霉素-链霉素溶液HyCloneSV30010
SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒上海桑谷生物技术有限公司B518131
SanPrep 柱 质粒 小量质粒提取 试剂盒生工生物（上海）B518191
T4 DNA连接酶TaKaRa2011A
T4多核苷酸激酶TaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100国药化学试剂30188928用 PBS 溶解，配制 0.25% Triton X-100/PBS 溶液。
Tween 20国药集团化学试剂30189328用 PBS 溶解，配制 0.1% Tween 20/PBS。

参考文献

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