观察豚鼠离体右心房的收缩功能

摘要

本方案描述了一种利用分离的豚鼠右心房高效筛选增强心肌收缩力药物的方法。

摘要

常见慢性心力衰竭（CHF）的特征是心室充盈和/或射血功能受损，导致心输出量无法满足机体需求并使发病率升高。心室收缩功能下降是CHF发病机制中的关键因素。收缩功能简单来说，即左心室充盈含氧血液，随后在每次心跳时将血液泵送至全身。心脏功能减弱以及左心室在心跳时无法有效收缩，提示收缩功能不良。已有多种传统草药被建议可用于增强患者的心脏收缩功能。然而，在民族药物研究过程中，目前仍缺乏稳定且高效的实验方法用于筛选可增强心肌收缩力的化合物。本文以地高辛为例，提供了一种利用豚鼠离体右心房组织筛选增强心肌收缩力化合物的系统化、标准化实验方案。结果显示，地高辛可显著增强右心房的收缩力。该系统化、标准化的实验方案旨在为筛选治疗CHF的民族药物活性成分提供方法学参考。

引言

心力衰竭由心肌梗死、心肌病、血流动力学超负荷、炎症及其他心肌损伤原因引起，这些因素会改变心肌的解剖结构和功能活动，最终导致心室泵血或充盈功能失常。心悸、乏力和液体潴留是主要的早期临床症状¹。慢性心力衰竭（CHF）是一种可长期维持、逐渐恶化或随时间出现失代偿的心脏疾病，其发病率和患病率随年龄增长而升高²。心脏收缩功能下降是CHF发病机制中的关键因素³。目前对该疾病的药物治疗主要包括使用降压药，如血管紧张素转换酶抑制剂、β-肾上腺素能受体阻滞剂（用于抑制神经激素系统——即交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活），以及利尿剂（用于减轻充血）⁴。然而，在研究这些药物治疗影响的实验中，常未充分关注由心输出量和心脏储备功能降低所引起的心力衰竭临床表现⁵。

正性肌力药物旨在增强心肌收缩力。临床上用于治疗心力衰竭的正性肌力药物包括强心苷类、磷酸二酯酶抑制剂和β-肾上腺素能受体激动剂。强心苷类主要是Digitalis（洋地黄属）的衍生物，其中地高辛是最常用的Digitalis衍生物，来源于Digitalis lanata（毛花洋地黄）⁶。这类药物可选择性地结合细胞膜上的Na⁺/K⁺-ATP酶，提高细胞内钙离子浓度，从而增强心肌收缩力和每搏输出量，且不增加氧耗，因而可提高心脏效率⁷。除强心苷类外，大多数正性肌力药物（如磷酸二酯酶抑制剂和β-肾上腺素能受体激动剂）在通过增加心肌细胞内钙负荷以增强心肌收缩力的同时，也会加快心率并增加心肌耗氧量，可能导致严重的临床心律失常和低血压，从而增加死亡率⁸。因此，这些正性肌力药物的临床应用受到限制。为避免因细胞内钙离子水平升高所引发的并发症，有必要开发更安全且高效的正性肌力调节剂，用于治疗慢性心力衰竭（CHF）（图1）。

近几十年来，已开展大量研究以合成和分析能够增强心脏血流动力学正性肌力作用的化合物。许多传统中药（TCM），例如 吴茱萸 (Juss.) Benth., 罗布麻 L. 和 苦豆子 L. 等可增强心肌收缩力^9,10,11研究表明，与正性肌力药物相比，中药及其活性单体可通过不同的机制发挥正性肌力作用。例如，川芎嗪C位甲基化衍生物——川芎嗪二醇（liguzinediol），作为一种活性单体，₂ 和 C₅ （一种活性成分 川芎根茎），可通过增强肌浆网钙瞬变来显著提高离体大鼠心脏的收缩力，且不增加心率，因此可能具有较少的副作用，是治疗慢性心力衰竭（CHF）的更优选择¹²此外，苦参碱是从中药植物中提取的一种生物碱 苦参 Ait. 氧化苦参碱可抑制β的上调₃-AR 蛋白表达，并降低心力衰竭模型大鼠中 eNOS 的表达，从而增强其心肌收缩力¹³然而，在民族医药研究中，尚缺乏稳定高效的实验方法用于筛选能够增强心肌收缩力的化合物。

众所周知，与其他啮齿类动物相比，豚鼠在电生理学和钙处理特性方面与人类更为相似¹⁴。一方面，豚鼠的心电图与人类具有足够的相似性，其逐搏钙离子（Ca²⁺）处理机制也比大鼠或小鼠更接近人类生理状态^15,16。另一方面，针对豚鼠心肌细胞的计算模型已得到广泛研究，并包含了能量代谢和活性氧物质代谢等关键的细胞亚系统¹⁷。因此，分离自豚鼠的右心耳组织被广泛用于筛选增强心肌收缩力的化合物。本文以地高辛为例，提供了一套利用豚鼠离体右心耳组织筛选增强心肌收缩力化合物的系统化、标准化实验方案。本研究为筛选民族药物中治疗慢性心力衰竭（CHF）的有效成分提供了方法学参考。

方案

实验方案严格遵循宁夏医科大学实验动物使用与机构动物护理和使用委员会的要求进行。本研究选用体重为300-450 g的雄性Dunkin-Hartley豚鼠。观察地高辛对豚鼠离体右心房收缩力的影响（图2）。

1. 豚鼠离体右心房的供氧准备

1. 准备实验仪器，包括生物信号采集与处理系统、JH-2 肌肉张力换能器、迈氏浴槽（Magnus bath）、L形通气钩、粗剪刀、培养皿、石蜡等（参见材料表）。
2. 通过向1,000 mL双蒸水中加入7.02 g NaCl（120.0 mM）、2.10 g NaHCO₃（25.0 mM）、0.30 g KCl（4.0 mM）、0.07 g MgSO₄ （0.6 mM）、0.07 g NaH₂PO₄ （0.6 mM）、0.28 g CaCl₂ （2.5 mM）和1.98 g葡萄糖（11.0 mM），配制1,000 mL Krebs-Henseleit溶液（K-H溶液），并用该溶液冲洗迈氏浴槽2至3次（参见表1和材料表）。
   注：K-H溶液温度应维持在37 °C ± 1 °C。
3. 通过向100 mL双蒸水中加入0.70 g NaCl（120.0 mM）、0.21 g NaHCO₃ （25.0 mM）、0.03 g KCl（4.0 mM）、0.01 g MgSO₄ （0.6 mM）、0.01 g NaH₂PO₄ （0.6 mM）、0.01 g CaCl₂ （0.8 mM）和0.20 g葡萄糖（11.0 mM），配制100 mL低钙K-H溶液（参见表1和材料表）。
4. 在操作皿中加入约20 mL 37 °C的K-H溶液（参见材料表）。
5. 在培养皿底部铺上约5 mm厚的石蜡，然后加入37 °C的K-H溶液至充满培养皿（参见材料表）。
6. 将L形通气钩安装在膀胱的乳胶管末端，放入培养皿中，并调节至每秒产生1-2个气泡（参见材料表）。
   ​注：应缓慢调节气泡速度；若操作过快，氧气可能迅速耗尽。

2. 豚鼠分离右心房的制备

1. 使用天平称量豚鼠的体重（参见 材料表).
2. 使用含有5%异氟烷的100%氧气通过诱导箱进行麻醉诱导，随后转换为鼻罩给予1.5%-3%异氟烷以维持麻醉（参见 材料表).
3. 用粗剪刀剪断颈动脉，放血后将组织置于培养皿中。随后用剪刀打开胸腔（从剑突开始，完全分离两侧组织以暴露心脏），并剥离心包膜。
   1. 用左手托住心脏，右手从主动脉根部剪下心脏，并迅速将其放入盛有K-H溶液的手术皿中。最后用手轻轻按压心室两到三次，挤出心室内血液，再将心脏置于培养皿中。
      注意：操作应迅速，需在2-5分钟内完成，温度必须控制在35 °C。K-H溶液的温度必须控制在37 °C。
4. 用针将心脏尖端固定在石蜡涂层的培养皿上，同时供氧（60 个气泡/分钟）。
5. 确定右心房。
   注意：在豚鼠中，心房在腹侧面由肺动脉分隔，背侧面由主动脉分隔。左心房和右心房均以类似袋状的结构连接于心室 "倒三角形"，右心房略小于左心房，边缘不规则。右心室心肌较薄，其上端塌陷处为右心房；左心室较为膨大，冠状血管分布丰富¹⁸ (图3).
6. 用眼科镊子轻轻提起右心房边缘，沿房室交界处剪开（参见 材料表).
   注意：避免损伤窦房结，沿房室交界处剪切时应尽量靠近心室侧。此步骤中可观察到右心房的自动节律性收缩。
7. 使用4-0外科缝线（参见 材料表）分别结扎右心房的上端和下端（两端的） "对角线"），一端打成环状，另一端留有较长的线头，也打成环状。
   ​注意：连接两端时，尽量连接尽可能少的组织 "对角线" 心房的

3. 豚鼠离体右心房收缩功能的测量与记录

1. 打开计算机，进入生物信号采集与处理系统（参见材料表）。确定连接通道（第一通道，张力）后，调节增益（50 mV）、时间常数（DC）、滤波（20 Hz）和扫描速度（1.00 s/div）。
2. 将标本一端挂在L型通气钩上，培养皿及氧气置于麦氏浴槽旁；另一端挂在JH-2型肌力换能器上（参见材料表）。
3. 观察心房收缩曲线，调节前负荷至0.5–1.0 g，并等待其稳定（约30分钟）。
   注意：每20分钟更换一次K-H溶液。当曲线恢复正常后，以此曲线作为标准，并标记为"正常"。若屏幕扫描速度稍快，需适当调慢。
4. 加入0.2 mL低钙K-H溶液，观察5分钟，直至曲线不再下降。
5. 加入0.2 mL 5%洋地黄毒苷溶液（参见材料表），观察5分钟，随后快速冲洗三次，恢复至正常状态。
   注意：标记给药时间点。当效应明显时，加快屏幕扫描速度。当曲线不再上升，即收缩幅度不再增加时，立即快速冲洗三次；否则将引发心律失常，影响后续药物实验结果。
6. 采集数据，并保存至软盘中。

结果

心肌收缩力下降会导致心输出量不足，从而引发充血性心力衰竭（图1）。本实验方案可用于记录不同药物对离体豚鼠右心房收缩功能的影响，并快速筛选具有增强心肌收缩力作用的民族药化合物。依次连接右心房组织、JH-2型肌力换能器和生物信号采集处理系统后，适当设置参数，观察收缩曲线（图2）。曲线的幅度代表右心房收缩的强度。实验共使用四只动物，数据采用描述性统计和频数分布进行分析。如图4所示，在正常条件下出现明显的收缩曲线；加入0.2 mL低钙K-H溶液后，曲线逐渐下降并最终趋于稳定，表明右心房收缩力减弱；而加入0.2 mL 5%地高辛溶液后，曲线开始逐渐上升，提示右心房收缩力增强。

讨论

心脏的正常节律性活动需要适宜的物理和化学环境，离体右心房的活动同样如此。离体右心房脱离了机体的神经支配和体液因素的直接作用，因此在改变其所接触药物时，可直接观察到右心房活动的变化。可兴奋细胞生物电活动的根本原因在于细胞膜对离子通透性的改变以及离子沿膜的继发性扩散¹⁹因此，心肌细胞膜外离子浓度的变化会显著影响心肌细胞的生物电活动和生理特性。在各种离子中，K⁺，Na⁺和 Ca²⁺ 是最重要的。当血液 K⁺ 当血钾浓度过高（超过7.9 mmol/L）时，心肌的兴奋性、自律性、传导性和收缩性均下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞。严重情况下，心脏可能在舒张期停搏。²⁰. 当血液中的 Ca²⁺ 浓度升高时，心肌的收缩能力增强。然而，若Ca浓度继续升高²⁺ 过高时，心室可能在收缩期停止。此时，血液中的 Ca²⁺ 水平可能下降，心肌收缩力可能减弱²¹此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 外科缝线	Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd
5% 地高辛（可溶于二甲基亚砜）	TCI 上海	D1828	CAS: 20830-75-5；纯度：>96.0%
BL-420N 生物信号采集与处理系统	成都泰盟软件有限公司	1700142S
CaCl2	上海源叶生物科技有限公司	S24110	CAS: 10043-52-4；纯度：96%
葡萄糖	上海源叶生物科技有限公司	S11022	CAS: 50-99-7；纯度：99%
异氟烷	RWD 生命科学有限公司	R510-22-16
JH-2 肌肉力传感器	中国北京航天医学工程研究所
KCl	上海源叶生物科技有限公司	S24120	CAS: 7447-40-7；纯度：99.5%
麦氏浴槽	上海未来实验设备有限公司	L046525
MgSO4	上海源叶生物科技有限公司	S24253	CAS: 7487-88-9；纯度：98%
NaCl	上海源叶生物科技有限公司	S24119	CAS: 7647-14-5；纯度：99.5%
NaH2PO4	上海源叶生物科技有限公司	S24161	CAS: 7558-80-7；纯度：99%
NaHCO3	上海源叶生物科技有限公司	S24153	CAS: 144-55-8；纯度：99.8%
手术盆	广州特宽医疗器械有限公司		305 mm x 230 mm
眼科镊	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
眼科手术剪	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
石蜡	Leica Biosystems	39601095
培养皿	Corning	430167	100 mm x 20 mm
啮齿类动物麻醉机	上海玉研仪器设备有限公司		ABS 型（单通道）
电子天平	上海越平科学仪器有限公司	YP1002
手术板	Zhengzhou Ketai Experiment Equipment Co., Ltd		21 cm x 31 cm
组织剪	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd	SL0023