具有免疫成分的基本三维 （3D） 肠道模型系统

Summary

在这里，我们描述了构建一个基本的三维（3D）肠道细胞系模型系统和一个石蜡包埋方案，用于固定肠道当量的光学显微评估。对选定的蛋白质进行染色可以分析来自单个实验的多个视觉参数，以潜在地用于临床前药物筛选研究。

Abstract

体内和体外肠道模型在研究炎症性肠道疾病的病理生理学、潜在有益物质的药理学筛选以及潜在有害食品成分的毒性研究方面的使用有所增加。与此相关的是，目前需要开发基于细胞的体外模型来替代动物模型。在这里，提出了一个使用细胞系的基本“健康组织”三维（3D）肠道等效模型的方案，具有提供实验简单性（标准化和易于重复的系统）和生理复杂性（Caco-2肠细胞与U937单核细胞和L929成纤维细胞的支持免疫成分）的双重好处。该协议还包括用于固定肠道当量的光学显微镜评估的石蜡包埋，从而提供了从单个实验中分析多个视觉参数的优势。苏木精和伊红 （H&E） 染色切片显示 Caco-2 柱状细胞在对照处理中形成紧密且规则的单层，用于验证该模型作为实验系统的功效。使用麸质作为促炎食品成分，从切片中分析的参数包括单层厚度减少，以及与底层基质 （H&E） 的破坏和分离、闭合蛋白染色所示的紧密连接蛋白表达降低（可统计学量化），以及迁移的 U937 细胞的免疫激活，如分化簇 14 （CD14） 染色和 CD11b 相关分化为巨噬细胞所证明的那样。如使用脂多糖模拟肠道炎症所示，可以测量的其他参数是粘液染色和细胞因子表达增加（如中间因子），这些参数可以在固定前从培养基中提取。基本的三维 （3D） 肠粘膜模型和固定切片可推荐用于炎症状态和屏障完整性研究，并可以分析多个视觉可量化参数。

Introduction

肠上皮屏障是包含不同类型上皮细胞的单细胞厚内膜，构成了身体外部和内部环境之间的第一个物理防御屏障或界面 ^1,2。柱状肠细胞是最丰富的上皮细胞类型。它们负责通过包括紧密连接 （TJ） 在内的多个屏障组件之间的相互作用来维持上皮屏障的完整性，在屏障收紧中起着重要作用 ^1,3。TJ 结构由细胞内斑块蛋白组成，例如闭塞带 （ZO） 和扣带蛋白，与跨膜蛋白（包括闭塞蛋白、claudins 和连接粘附分子 （JAM））合作，形成紧密连接相邻细胞的拉链状结构 ^3,4。跨膜蛋白调节小化合物的被动细胞旁扩散，排除有毒的大分子。

潜在有毒的食物化合物和食物污染物会刺激炎性细胞因子的产生，从而破坏上皮通透性，激活免疫细胞并引起慢性肠道组织炎症 ^5,6,7。相比之下，据报道，各种抗氧化和抗炎植物化学物质可通过恢复 TJ 蛋白表达和组装来降低炎性细胞因子表达并增强肠道 ....

Protocol

1. 基本3D重建肠黏膜模型的制备

注意：整个过程必须在无菌层流罩中进行。涉及使用细胞培养箱的程序中的所有步骤都意味着将培养物在含有5%CO₂ 的湿润气氛中在37°C下孵育（除非方案中另有说明_）。

1. 肠道模型系统中使用的细胞系的预先制备
   1. 在 F25 烧瓶中以 5 x 10⁵ 的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞，在 5 mL 含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素 （Pen-Strep） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，并在构建肠道模型前 4 天在培养箱中培养。48小时后，使用移液管除去培养基。然后加入新鲜培养基（5mL），并将细胞进一步孵育48小时。
      注意：细胞在使用前必须达到 80% 汇合。
   2. 在F75细胞瓶中的10mL DMEM培养基（含有10%FBS和1%Pen-Strep）中接种Caco-2细胞（浓度为2×10,6），并在构建肠粘膜模型前4天在培养箱中培养。48小时后，按照步骤1.1.1中的说明更换培养基，并进一步孵育48小时至汇合度为80%。
      注意：细胞必须处于活跃的增殖阶段：不要太稀疏，也不要太汇合。建议汇合率为 50-60%。细胞不能在制作模型的前一天播种，因为这可能会减慢细胞的增殖能力，从而无法在重建的 3D 模型中完美地扎根。<....

Results

第一个重要方面是确定用于实验目的的基本 3D 肠道等效粘膜的可接受性。这是使用组织学和组织病理学实验室中最广泛使用的染色剂进行的，即苏木精（染色核材料深蓝紫色）和伊红（染色细胞质材料深浅不一的粉红色）。首先对未经处理的对照进行H&E染色，该对照在与实验处理相同的条件和时间范围内培养。通过可视化细胞的模式、形状和结构，该肠道细胞模型系统的成功取决于 Caco-2 细胞在 5 天后在富含细胞外基质 （ECM） 的固有层上方形成紧密且规则的单层（图 1A）。被认为无法进行进一步分析的模型系统的例子包括那些显示过度生长和上皮层杂乱无章的模型系统，如10天后所示（图1B）。另一个例子是上皮层太厚且杂乱无章（图1C），这是由过量的Caco-2细胞的接种或过度孵育引起的。畸形（图1D），归因于未处于增殖活跃期的接种细胞，或固有层的制备或石蜡固定期间的问题（细胞脱落/破坏），也是不可接受的重建肠粘膜的一个例子。同样不.......

Discussion

这里介绍的基本重建肠粘膜模型系统（图6）结合了生理复杂性（含有Caco-2单层的生理上更相关的3D细胞培养物，以及含有成纤维细胞和单核细胞的富含ECM的固有层支持物）和实验简单性（使用商业人类细胞系产生标准化且易于重复的系统）¹³.因此，该模型系统被认为是小鼠模型的合适替代品，旨在评估潜在药物/食品成分对肠道屏障完整性的影响。在这方面，以前的文章证实了当前细胞培养模型在测试潜在有益化合物（加上剂量依赖性）以及有害食品成分方面的功效^7,16,17。此外，LPS或替代的促炎试剂（2,4,6-三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸钠）可以添加到目前的肠粘膜模型中，以模拟IBD症状。通过这样做，有可能从结构方面以及细胞因子的表达来研究肠道疾病的病因，例如促炎性MDK，这是IBD¹⁵的标志物。这种基本模型系统也具有针对更.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue/PAS 套件	ScyTek实验室公司	APS-1，APS-2	免疫组化染色套件
蓝色特莱潘溶液	赛莫飞舍尔	15250061	细胞计数分析
Caco-2结直肠腺癌细胞	空军交通管制委员会	空军交通管制中心HTB-37	细胞系
基于柠檬-组织蛋白-清亚门烯基	组蛋白实验室	R0050CITRO	石蜡嵌体试剂
杜尔贝科'改良型鹰型中型（DMEM）	GIBCO	11965092	细胞聚合试剂
嵌入中心	组蛋白实验室	TEC2900	石蜡嵌合仪器
胎牛血清（FBS）	GIBCO	A5256701	细胞聚合试剂
汉克斯'平衡盐溶液（HBSS）	GIBCO	12350039	细胞聚合试剂
人类中介 ELISA 套件	凝聚生物科学	CEK1270	套件ELISA
倒置显微镜	Eclipse Ts2，尼康	MFA34100	显微镜
L929小鼠成纤维细胞	空军交通管制委员会	ATCC ®-CCL1	细胞系
LC3-II	Novus生物制品	NB910-40752超级新星包	抗体
左旋谷氨酰胺	GIBCO	A2916801	细胞聚合试剂
遮蔽	Novus生物制品	NBP1-87402	抗体
石蜡实验室-O-蜡 PLUS 56 °C–58 °C	组蛋白实验室	R0040 PLUS	石蜡嵌合仪器
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞聚合试剂
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞聚合试剂
鼠尾胶原蛋白I型	GIBCO	A1048301	细胞聚合试剂
罗斯韦尔公园纪念学院中学（RPMI）	GIBCO	21870076	细胞聚合试剂
丙酮酸钠	GIBCO	11360070	细胞聚合试剂
Thermo Fisher Countess II FL 自动电池计数器	赛莫飞舍尔	TF-CACC2FL	细胞计数仪器
特兰斯韦尔	联合主演科宁	3413	细胞聚合的塑料
胰蛋白酶	GIBCO	15090046	细胞聚合试剂
U937 一种前单核细胞的人类骨髓性白血病细胞系	空军交通管制委员会	ATCC CRL-1593.2	细胞系
UltraTek Alk-Phos 防多价（永久红色）染色套件	ScyTek实验室公司	AMH080	免疫组化染色套件