具有免疫成分的基本三维 （3D） 肠道模型系统

Summary

在这里，我们描述了构建一个基本的三维（3D）肠道细胞系模型系统和一个石蜡包埋方案，用于固定肠道当量的光学显微评估。对选定的蛋白质进行染色可以分析来自单个实验的多个视觉参数，以潜在地用于临床前药物筛选研究。

Abstract

体内和体外肠道模型在研究炎症性肠道疾病的病理生理学、潜在有益物质的药理学筛选以及潜在有害食品成分的毒性研究方面的使用有所增加。与此相关的是，目前需要开发基于细胞的体外模型来替代动物模型。在这里，提出了一个使用细胞系的基本“健康组织”三维（3D）肠道等效模型的方案，具有提供实验简单性（标准化和易于重复的系统）和生理复杂性（Caco-2肠细胞与U937单核细胞和L929成纤维细胞的支持免疫成分）的双重好处。该协议还包括用于固定肠道当量的光学显微镜评估的石蜡包埋，从而提供了从单个实验中分析多个视觉参数的优势。苏木精和伊红 （H&E） 染色切片显示 Caco-2 柱状细胞在对照处理中形成紧密且规则的单层，用于验证该模型作为实验系统的功效。使用麸质作为促炎食品成分，从切片中分析的参数包括单层厚度减少，以及与底层基质 （H&E） 的破坏和分离、闭合蛋白染色所示的紧密连接蛋白表达降低（可统计学量化），以及迁移的 U937 细胞的免疫激活，如分化簇 14 （CD14） 染色和 CD11b 相关分化为巨噬细胞所证明的那样。如使用脂多糖模拟肠道炎症所示，可以测量的其他参数是粘液染色和细胞因子表达增加（如中间因子），这些参数可以在固定前从培养基中提取。基本的三维 （3D） 肠粘膜模型和固定切片可推荐用于炎症状态和屏障完整性研究，并可以分析多个视觉可量化参数。

Introduction

肠上皮屏障是包含不同类型上皮细胞的单细胞厚内膜，构成了身体外部和内部环境之间的第一个物理防御屏障或界面 ^1,2。柱状肠细胞是最丰富的上皮细胞类型。它们负责通过包括紧密连接 （TJ） 在内的多个屏障组件之间的相互作用来维持上皮屏障的完整性，在屏障收紧中起着重要作用 ^1,3。TJ 结构由细胞内斑块蛋白组成，例如闭塞带 （ZO） 和扣带蛋白，与跨膜蛋白（包括闭塞蛋白、claudins 和连接粘附分子 （JAM））合作，形成紧密连接相邻细胞的拉链状结构 ^3,4。跨膜蛋白调节小化合物的被动细胞旁扩散，排除有毒的大分子。

潜在有毒的食物化合物和食物污染物会刺激炎性细胞因子的产生，从而破坏上皮通透性，激活免疫细胞并引起慢性肠道组织炎症 ^5,6,7。相比之下，据报道，各种抗氧化和抗炎植物化学物质可通过恢复 TJ 蛋白表达和组装来降低炎性细胞因子表达并增强肠道 TJ 屏障完整性 ^4,6,8。因此，有益和有害化合物对上皮屏障完整性的调节已经看到体内和体外模型的使用增加，这些模型旨在模拟肠道屏障进行药物筛选和毒性研究。鉴于人们对了解肠病 （IBD）、坏死性小肠结肠炎和癌症的病理生理学的兴趣日益浓厚，这一点尤其重要，这些都可以在实验模型^{中模拟 8、9、10}。

为了实现动物试验中“3R”的目标，人们一直需要开发基于细胞的体外模型。这些措施包括替代使用动物的替代品，减少使用的动物数量，以及改进采用减轻痛苦的方法11,12,13。此外，人类和小鼠模型（啮齿动物是使用最广泛的物种）之间的潜在分子、细胞和生理机制是独特的，导致关于小鼠模型作为人类反应预测因子的功效的争议^12,13。体外人类细胞系模型的众多优点包括靶标限制实验、直接观察和连续分析¹³。

二维 （2D） 培养物中的单细胞型单层已成为强大的模型。然而，这些不能精确地再现人体组织的生理复杂性^8,13,14。因此，3D培养系统正在开发中，并不断改进，以概括健康和患病肠道组织的生理复杂性，作为下一代风险评估工具箱^13,14。这些模型包括具有不同细胞系的 3D Transwell 支架、类器官培养物和使用细胞系和类器官（来自健康和患病组织）的微流体装置（肠芯片）^8,13,14。

本研究中提出的 3D“健康组织”肠道等效方案基于在生理复杂性和实验简单性之间取得平衡¹³。该模型代表了 3D Transwell 支架，由三种细胞系（肠细胞 [金标准结肠腺癌 Caco-2 系]和支持免疫成分 [U937 单核细胞和 L929 成纤维细胞]）组成，构成了一个标准化且易于重复的系统，适用于初步筛选对肠上皮屏障完整性和免疫反应感兴趣的膳食分子。该协议包括石蜡包埋，用于使用固定肠道等效物对上皮屏障完整性进行光学显微镜评估。本方法的优点是可以使包埋组织的许多切片从单个实验中对多个参数进行染色。

Protocol

1. 基本3D重建肠黏膜模型的制备

注意：整个过程必须在无菌层流罩中进行。涉及使用细胞培养箱的程序中的所有步骤都意味着将培养物在含有5%CO₂ 的湿润气氛中在37°C下孵育（除非方案中另有说明_）。

1. 肠道模型系统中使用的细胞系的预先制备
   1. 在 F25 烧瓶中以 5 x 10⁵ 的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞，在 5 mL 含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素 （Pen-Strep） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，并在构建肠道模型前 4 天在培养箱中培养。48小时后，使用移液管除去培养基。然后加入新鲜培养基（5mL），并将细胞进一步孵育48小时。
      注意：细胞在使用前必须达到 80% 汇合。
   2. 在F75细胞瓶中的10mL DMEM培养基（含有10%FBS和1%Pen-Strep）中接种Caco-2细胞（浓度为2×10,6），并在构建肠粘膜模型前4天在培养箱中培养。48小时后，按照步骤1.1.1中的说明更换培养基，并进一步孵育48小时至汇合度为80%。
      注意：细胞必须处于活跃的增殖阶段：不要太稀疏，也不要太汇合。建议汇合率为 50-60%。细胞不能在制作模型的前一天播种，因为这可能会减慢细胞的增殖能力，从而无法在重建的 3D 模型中完美地扎根。
   3. 在模型设置前 2 天，将悬浮液（浓度为 1 x 10⁶）的 U937 细胞加入 10 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基（含有 2 mM L-谷氨酰胺、1% 丙酮酸钠、10% FBS 和 1% Pen-Strep）的 F75 细胞瓶中，并置于培养箱中 48 小时。
2. Transwell共培养板插件的制备
   1. 选择包含带有 0.4 μm 过滤器的插入物的 24 孔板。
      注：0.4 μm 过滤器是药物转运研究的标准选择。不建议使用 3 μm 和 8 μm 的过滤器尺寸，以防止胶原包埋细胞的任何可能损失。
   2. 使用移液管，在过滤器插件下方和上方用 500 μL Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 水合 Transwell 过滤器（以下称为膜插件）。
   3. 关闭多孔板并将其置于培养箱中至少2小时。
      注：膜插入物可在HBSS中停留长达24小时。此操作可以在构建模型的前一天执行。重要的是，膜插件必须完全水合，并且过滤器不会变干，因为这会使样品更难正确粘附。
   4. 2小时（或24小时）后从培养箱中取出板。使用移液管小心地从膜插入物的上方和下方吸出HBSS，并使其干燥10分钟。
3. 基本 3D 肠道模型系统的无细胞胶原蛋白固有层的制备（第 1 天）
   1. 在冰上的50 mL无菌管中制备无细胞胶原溶液，其中含有DMEM中的以下成分：10%胎牛血清（FBS），200mM L-谷氨酰胺，1%碳酸氢钠和1.35mg / mL1型大鼠尾胶原。
      注意： 所有这些组件必须保持在冰上，并用冷却的移液器吸头添加到 DMEM 中。1 型大鼠尾胶原蛋白必须最后添加，因为它会随着温度和 pH 值的升高而聚合。制备的无细胞胶原蛋白溶液的量将取决于所需的肠道当量的数量。
   2. 向每个板插入物（膜过滤器上方）中加入 250 μL 溶液，以获得所选的肠道当量数量，并将盖子放在多孔板上。让胶原溶液在室温 （RT） 下在层流罩下聚合。
      注意：除了过渡到更固态的相外，聚合也从颜色从黄色变为粉红色中显而易见。聚合通常在10-15分钟内完成。
4. 制备、细胞计数以及将成纤维细胞 （L929） 和单核细胞 （U937） 添加到模型系统中（第 1 天）
   1. 从培养箱中取出L929细胞培养物（步骤1.1.1）。使用真空泵吸出培养基，用 5 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS;不含 Ca 和 Mg）替换，然后冲洗细胞。
   2. 使用真空泵吸出 PBS。加入 2 mL 预制的胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液），放入培养箱中 3-5 分钟。
   3. 使用倒置显微镜（例如，Eclipse Ts2，尼康）确定细胞是否从粘附表面脱落。如果发生这种情况，请立即加入 2 mL DMEM（含 10% FBS）以阻断胰蛋白酶反应并冲洗细胞。
   4. 将细胞溶液转移到无菌的 15 mL 管中，并以 645 x g 离心 5 分钟。使用真空泵吸出上清液。
      注意： 需要注意不要打扰颗粒。DMEM在L929和U937细胞上进行了测试，未显示对生长有不利影响。
   5. 向沉淀中加入 1 mL DMEM 并悬浮细胞。
      注意：细胞必须均匀悬浮在溶液中。
   6. 在DMEM中取出20μL细胞，并加入20μL台盼蓝溶液。取出 20 μL 混合物，并使用细胞计数室在显微镜下评估细胞密度。
   7. 从培养箱中取出U937细胞培养物（步骤1.1.3）。将细胞溶液以645× g 离心5分钟。使用真空泵吸出上清液以避免干扰沉淀。
   8. 将细胞悬浮在 1 mL RPMI 中。与 L929 细胞一样，确保细胞均匀悬浮在溶液中。
   9. 类似地，建立步骤1.4.6中报告的细胞密度。
   10. 按照步骤1.3.1中的说明制备胶原蛋白溶液。
       注：要制备的溶液量必须考虑每个插入片段（或型号）的 450 μL。
   11. 制备DMEM溶液，分别含有50,000个L929细胞和15,000个U937细胞，体积为50μL，用于构建每个肠道等效模型。
       注意：细胞数量是一个关键因素。这两种细胞类型过多会导致固有层过多地充满细胞，而这些细胞将没有得到充分的组织。较少数量的成纤维细胞（产生胶原蛋白）会导致固有层不那么紧凑，而单核细胞太少会阻碍对刺激的免疫反应。如果每 50 μL 等分试样中存在正确的细胞计数，则可以为每个 24 孔板中存在的 12 个过滤器插入物制备 600 μL 的总体积。
   12. 在步骤1.4.10中，将含有细胞的每50μL等分试样加入到450μL胶原溶液中。充分混合。
   13. 为每个模型用 500 μL 含胶原蛋白的细胞溶液覆盖预包被的无细胞胶原蛋白固有层。
       注意：快速增加每个插入物的体积很重要，因此，建议一次将重建的肠粘膜模型的数量限制为 12 个或更少。
   14. 关闭板并将其置于培养箱中2小时，以使溶液凝固。
5. 制备、细胞计数和将上皮 Caco-2 细胞添加到肠道模型中（第 1 天）
   1. 从培养箱中取出Caco-2细胞培养物（步骤1.1.2）。重复步骤1.4.1中的步骤，使用10mL PBS进行初步冲洗。然后加入 5 mL 预制的胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的无钙和无镁 PBS 溶液），并置于培养箱中 5-8 分钟。
   2. 重复步骤 1.4.3（但使用 5 mL DMEM 阻断胰蛋白酶反应）至 1.4.6，使用细胞计数室对细胞进行计数。
   3. 制备DMEM溶液，在50μL中含有150,000个Caco-2细胞。
      注意：使用的单元格数量是一个临界点。超过 150,000 个细胞可能导致致密的杂乱无章的上皮层，而太少（小于 100,000 个）的细胞难以生长并且不能充分覆盖基底膜，从而形成不连续的肠上皮层。确保细胞有效悬挂。200 μL 移液器的吸头可用于确保均匀分布。鉴于在任何给定时间可以构建 12 个模型，可以制备 600 μL 细胞溶液。
   4. 在步骤 1.4.14 中要求的 2 小时后，将 50 μL 悬浮在 DMEM 中的 Caco-2 细胞添加到每个基底膜的中间。关闭多孔板的盖子。
   5. 在无菌层流罩下孵育10分钟。然后转移到培养箱中30分钟。
   6. 制备含有 10% FBS 和 1% Pen/Strep 的 DMEM 溶液。
      注意：准备足够的溶液以使用每个模型 1 mL 体积。
   7. 在重建模型上方加入 500 μL 培养基，在过滤器下方加入 500 μL。
      注意： 在过滤器上方添加介质时需要小心，以避免分离或对细胞施加压力。
   8. 关闭多孔板系统并将其放入培养箱中。
6. 模型准备/形成和使用（第 2 天至第 6 天）
   1. 第2天：使用移液管小心地从重建模型上方和过滤器下方取出溶液。分别在过滤器上方和下方更换新鲜的 500 μL 新鲜 DMEM（10% FBS 和 1% Pen/Strep）。
   2. 第 3 天：重复上述步骤 1.6.1。
   3. 第 4 天：重复上述步骤 1.6.1。
      注意：该肠道模型是静态细胞模型;因此，为了有利于分子的释放以及细胞的生长和刺激，每天更换培养基非常重要。
   4. 第 5 天：此时，模型已完全形成/开发。使用这些模型进行进一步的研究。
      注意：使用该模型的最佳时间是 5 天。虽然细胞可以在培养箱中维持更长的时间，但时间越长，上皮细胞以不受控制的方式生长的可能性就越大，从而导致难以使用的无组织和紧凑层。
   5. 5天后，将模型与有毒（麸质或脂多糖[LPS]）或感兴趣的有益成分（多酚）一起孵育。将它们添加到悬浮在DMEM介质中的重建模型的上部。
      注意：必须计算每种目标组分的合适浓度并将其悬浮在 DMEM 培养基中。必须设置仅包含DMEM培养基的未处理对照，以便与实验模型进行比较。
   6. 将对照和实验模型在培养箱中孵育24小时。
   7. 第 6 天：用移液管去除过滤器上方和下方的介质。
      注：培养基可用于后续的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 型测试，以测量炎性细胞因子的释放。为此，必须将培养基添加到无菌小瓶中并储存在-20°C以进行进一步分析。

2. 重建肠粘膜模型的石蜡包埋

注意： 整个过程必须在化学通风橱下进行。必须严格遵守每个步骤和相应的时间分配。因此，提前准备好所有试剂非常重要。

1. 将石蜡机设置为58°C，以便可以使用。
2. 在无菌 24 孔板中使用钳子将膜插入物转移到清洁孔中。
3. 在过滤器上方加入 500 μL 37% 缓冲福尔马林的 PBS 溶液，在过滤器下方加入 1 mL。盖上盖子，在室温下将其放在化学通风橱下2小时。
   注意：作为替代方案，4%缓冲福尔马林可以在室温下使用1小时。
4. 取出福尔马林，在过滤器上方和下方加入HBSS溶液。然后移除 HBSS。
5. 从膜插入物上拆下固有层。
   注意：肠粘膜的细胞通常很容易从膜插入物上分离，因为它们不附着在膜插入物上。此外，两个样品室（顶端和基部）保持连接，保留 3D 结构。如果由于某种原因，它们不容易分离，则使用无菌的一次性手术刀刀片从膜插入物中去除肠粘膜非常重要。膜插入物可以被切割，从而将其与塑料分离。注意不要用手术刀接触样品。从胶原包埋细胞中去除膜插入物的动机是，该过滤器可能会在随后的固定或石蜡包埋阶段脱落，从而使肠粘膜模型之间的比较不成比例。此外，嵌入切片内的膜插入物具有不同的稠度，这可能会干扰切片。
6. 将 100 mL 烧杯放在化学通风橱下方，每个烧杯都正确标记以包括一个正在研究的重建肠粘膜模型系统。向每个烧杯中加入 25 mL 35% ETOH，然后加入重建的肠粘膜。孵育 10 分钟。
7. 用 25 mL 的 50% 乙醇代替 35% 乙醇并孵育 10 分钟。
8. 用 25 mL 70% 乙醇代替 50% 乙醇并孵育 10 分钟。
9. 用 25 mL 80% 乙醇代替 70% 乙醇并孵育 10 分钟。
10. 用 25 mL 95% 乙醇代替 80% 乙醇并孵育 10 分钟。
11. 用 25 mL 的 100% 乙醇代替 95% 乙醇并孵育 10 分钟。
12. 用另外 25 mL 的 100% 乙醇替换 100% 乙醇并孵育 10 分钟。
13. 将 100 mL 烧杯放在通风橱下，每个烧杯都正确标记以包括一个正在调查的模型。加入 50 mL 二甲苯或组织学清除剂 10-20 分钟。
    注意：建议使用 Histo-Clear（组织学清除剂），因为该剂可增强嗜酸性染色剂的透明度和活力。清除时间可能因一个重建的肠粘膜样本而异，必须每 2-3 分钟检查一次外观透明度。
14. 一旦样品透明，将它们放入金属组织盒支架中，然后将其浸入加热机器内的液体石蜡中 45 分钟。
15. 更换石蜡，将样品留在加热的机器内再放置 45 分钟。
16. 取下纸巾盒支架，放在冰上冷却。当冷却的样品块从金属支架上分离时，可以在室温下进一步冷却。
17. 将块存储在室温下。
    注意：如果目标是立即准备切片，则可以将块放置在4°C下，以便在使用时充分冷却。
18. 使用切片机切割 4 μm 切片。
19. 将切割部分放在载玻片上，并在37°C的烤箱中干燥24小时。
20. 幻灯片已准备就绪。将它们储存在室温下，直到进行 H&E 组织学染色或免疫组织化学反应染色（抗原抗体类型）。
    1. 对于免疫组织化学染色，选择感兴趣的抗体（用于研究 TJ 蛋白（如闭合蛋白或用于单核细胞活化、迁移和分化）并使用商业试剂盒检测表达（通过染色）。
    2. 同样，使用阿尔新蓝和高碘酸-希夫 （PAS） 染色试剂盒测量粘液。
    3. 通过计算从显微镜拍摄的显微照片上阳性像素的百分比来量化感兴趣的染色 TJ 蛋白，例如闭合素。
    4. 使用图像分析软件（例如，ImageJ2软件[Wayne Rasband，版本2.9.0 / 1.53t]）分析细胞的图像。
       1. 要执行像素分析，请将数字图像处理为 300 像素/英寸并将其转换为 8 位。然后，通过 Color Deconvolution 插件处理二值图像，以分析目标蛋白质的染色，在本例中为闭塞素的永久红色染色。
       2. 将所选图片另存为 tiff，并使用图形编辑器（例如，Adobe PhotoshopCC [版本 20.0.4]）对其进行“清理”程序以消除伪影。
       3. 此后，使用应用程序 Analyze Particle of ImageJ2 测量所有感兴趣的字段，并将数据报告为像素数。
          注意：每个实验应一式三份进行，并针对每个重复分析三个内部重复字段。为了量化粘液，测量像素的相同原理可以分别应用于紫色洋红色染色的中性粘蛋白和明亮的蓝色染色酸性粘液的图像。

Results

第一个重要方面是确定用于实验目的的基本 3D 肠道等效粘膜的可接受性。这是使用组织学和组织病理学实验室中最广泛使用的染色剂进行的，即苏木精（染色核材料深蓝紫色）和伊红（染色细胞质材料深浅不一的粉红色）。首先对未经处理的对照进行H&E染色，该对照在与实验处理相同的条件和时间范围内培养。通过可视化细胞的模式、形状和结构，该肠道细胞模型系统的成功取决于 Caco-2 细胞在 5 天后在富含细胞外基质 （ECM） 的固有层上方形成紧密且规则的单层（图 1A）。被认为无法进行进一步分析的模型系统的例子包括那些显示过度生长和上皮层杂乱无章的模型系统，如10天后所示（图1B）。另一个例子是上皮层太厚且杂乱无章（图1C），这是由过量的Caco-2细胞的接种或过度孵育引起的。畸形（图1D），归因于未处于增殖活跃期的接种细胞，或固有层的制备或石蜡固定期间的问题（细胞脱落/破坏），也是不可接受的重建肠粘膜的一个例子。同样不...

Discussion

这里介绍的基本重建肠粘膜模型系统（图6）结合了生理复杂性（含有Caco-2单层的生理上更相关的3D细胞培养物，以及含有成纤维细胞和单核细胞的富含ECM的固有层支持物）和实验简单性（使用商业人类细胞系产生标准化且易于重复的系统）¹³.因此，该模型系统被认为是小鼠模型的合适替代品，旨在评估潜在药物/食品成分对肠道屏障完整性的影响。在这方面，以前的文章证实了当前细胞培养模型在测试潜在有益化合物（加上剂量依赖性）以及有害食品成分方面的功效^7,16,17。此外，LPS或替代的促炎试剂（2,4,6-三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸钠）可以添加到目前的肠粘膜模型中，以模拟IBD症状。通过这样做，有可能从结构方面以及细胞因子的表达来研究肠道疾病的病因，例如促炎性MDK，这是IBD¹⁵的标志物。这种基本模型系统也具有针对更...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue/PAS 套件	ScyTek实验室公司	APS-1，APS-2	免疫组化染色套件
蓝色特莱潘溶液	赛莫飞舍尔	15250061	细胞计数分析
Caco-2结直肠腺癌细胞	空军交通管制委员会	空军交通管制中心HTB-37	细胞系
基于柠檬-组织蛋白-清亚门烯基	组蛋白实验室	R0050CITRO	石蜡嵌体试剂
杜尔贝科'改良型鹰型中型（DMEM）	GIBCO	11965092	细胞聚合试剂
嵌入中心	组蛋白实验室	TEC2900	石蜡嵌合仪器
胎牛血清（FBS）	GIBCO	A5256701	细胞聚合试剂
汉克斯'平衡盐溶液（HBSS）	GIBCO	12350039	细胞聚合试剂
人类中介 ELISA 套件	凝聚生物科学	CEK1270	套件ELISA
倒置显微镜	Eclipse Ts2，尼康	MFA34100	显微镜
L929小鼠成纤维细胞	空军交通管制委员会	ATCC ®-CCL1	细胞系
LC3-II	Novus生物制品	NB910-40752超级新星包	抗体
左旋谷氨酰胺	GIBCO	A2916801	细胞聚合试剂
遮蔽	Novus生物制品	NBP1-87402	抗体
石蜡实验室-O-蜡 PLUS 56 °C–58 °C	组蛋白实验室	R0040 PLUS	石蜡嵌合仪器
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞聚合试剂
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞聚合试剂
鼠尾胶原蛋白I型	GIBCO	A1048301	细胞聚合试剂
罗斯韦尔公园纪念学院中学（RPMI）	GIBCO	21870076	细胞聚合试剂
丙酮酸钠	GIBCO	11360070	细胞聚合试剂
Thermo Fisher Countess II FL 自动电池计数器	赛莫飞舍尔	TF-CACC2FL	细胞计数仪器
特兰斯韦尔	联合主演科宁	3413	细胞聚合的塑料
胰蛋白酶	GIBCO	15090046	细胞聚合试剂
U937 一种前单核细胞的人类骨髓性白血病细胞系	空军交通管制委员会	ATCC CRL-1593.2	细胞系
UltraTek Alk-Phos 防多价（永久红色）染色套件	ScyTek实验室公司	AMH080	免疫组化染色套件