含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

摘要

本文介绍了一种构建基础的三维（3D）肠道细胞系模型系统的方法，以及对固定后的肠道类似物进行石蜡包埋以用于光学显微镜观察的实验方案。通过对特定蛋白进行染色，可从单次实验中分析多个可视化参数，有望应用于临床前药物筛选研究。

摘要

近年来，体内和体外肠道模型在研究炎症性肠病的病理生理机制、筛选潜在有益物质的药理学作用以及评估可能有害食品成分的毒性方面得到了越来越多的应用。尤其值得注意的是，目前迫切需要开发基于细胞的体外模型以替代动物模型。本文介绍了一种基于细胞系构建基础“健康组织”三维（3D）肠道等效模型的实验方案，该模型兼具实验操作简便性（标准化且易于重复的系统）和生理复杂性（包含Caco-2肠上皮细胞以及U937单核细胞和L929成纤维细胞作为支持性免疫组分）。该方案还包括对固定后的肠道等效组织进行石蜡包埋，以便通过光学显微镜进行评估，从而实现从单次实验中分析多个可视化参数的优势。经苏木精和伊红（H&E）染色的切片显示，在对照处理组中，Caco-2柱状细胞形成紧密且规则的单层结构，可用于验证该模型作为实验系统的有效性。以麦胶蛋白（gluten）作为促炎性食品成分时，通过切片分析的参数包括单层厚度减少、与基底基质的连接断裂和细胞脱落（H&E染色）、紧密连接蛋白（通过闭合蛋白染色显示）表达下降（可进行统计学量化），以及迁移的U937细胞发生免疫活化，表现为分化簇14（CD14）染色阳性及CD11b相关的向巨噬细胞分化。通过使用脂多糖（lipopolysaccharide）模拟肠道炎症表明，还可检测其他参数，如黏液染色增强和细胞因子（如中期素，midkine）表达升高，后者可在固定前从培养基中提取并检测。该基础三维（3D）肠黏膜模型及其固定切片适用于炎症状态和屏障完整性研究，并可实现多个可视化可量化参数的同步分析。

引言

肠道上皮屏障是一层由多种上皮细胞构成的单细胞厚度的内层结构，构成了外界与机体内部环境之间的第一道物理防御屏障或界面^1,2柱状型肠上皮细胞是上皮细胞中最丰富的类型。这些细胞是 通过多种屏障组分（包括紧密连接（TJs））之间的相互作用，维持上皮屏障完整性，在屏障紧密化过程中发挥重要作用^1,3紧密连接结构由细胞内斑块蛋白（如闭合蛋白复合物（ZO）和带状蛋白（cingulin））与跨膜蛋白（包括闭合蛋白（occludins）、claudins和连接黏附分子（JAMs））协同组成，这些蛋白形成拉链样结构，将相邻细胞紧密连接在一起。^3,4跨膜蛋白可调节小分子化合物的被动旁细胞扩散，并阻止有毒的大分子进入。

潜在有毒的食品成分和食品污染物会刺激炎症性细胞因子的产生，破坏上皮通透性，激活免疫细胞，并导致慢性肠道组织炎症^5,6,7。相反，多种具有抗氧化和抗炎作用的植物化学物质已被报道可降低炎症性细胞因子的表达，并通过恢复紧密连接蛋白的表达与组装来增强肠道紧密连接（TJ）屏障的完整性^4,6,8。因此，有益和有害化合物对上皮屏障完整性的调控作用，促使越来越多的研究采用体内（in vivo）和体外（in vitro）模型来模拟肠道屏障，用于药物筛选和毒性研究。这一点尤为重要，因为目前对肠道疾病（IBD）、坏死性小肠结肠炎以及癌症等疾病的发病机制日益关注，而这些疾病均可在实验模型中进行模拟^8,9,10。

人们一直要求开发基于细胞的 体外 为实现动物实验“3R”原则的目标而采用的模型，包括替代动物使用的替代方法、减少使用动物数量以及采用减轻动物痛苦的优化方法^11,12,13此外，人类与小鼠模型（啮齿类动物是最常用的物种）之间在分子、细胞和生理机制方面存在显著差异，这引发了关于小鼠模型在预测人类反应方面有效性的争议^12,13. 多种优势 体外 人类细胞系模型包括靶向受限实验、直接观察和连续分析¹³.

二维（2D）培养中的单细胞类型单层模型已被广泛用作强大的研究工具。然而，这些模型无法精确再现人体组织的生理复杂性^8,13,14。因此，三维 培养系统正不断得到改进，以更真实地模拟健康和病变肠道组织的生理复杂性，成为下一代风险评估工具箱^13,14。这些模型包括采用多种细胞系的三维Transwell支架、类器官培养系统，以及基于细胞系和类器官（来源于健康和病变组织）的微流控装置（即“肠芯片”）^8,13,14。 

本研究中提出的三维“健康组织”肠道等效模型方案，旨在生理复杂性与实验简便性之间取得平衡¹³。该模型代表一种三维Transwell支架系统，包含三种细胞系（肠上皮细胞[标准结肠腺癌Caco-2细胞系]，以及免疫支持组分[U937单核细胞和L929成纤维细胞]），构成一个标准化且易于重复的体系，适用于对膳食分子在肠道上皮屏障完整性和免疫反应方面的作用进行初步筛选。该方案包括石蜡包埋步骤，以便对固定的肠道等效模型进行光学显微镜下上皮屏障完整性的评估。本方法的优势在于，可从单次实验获得的包埋组织中制备大量切片，用于多种参数的染色分析。

方案

1. 基本三维重建肠黏膜模型的制备

注意：整个操作过程必须在无菌的超净工作台中进行。操作步骤中所有涉及使用细胞培养箱的部分，均表示将培养物置于含5% CO₂的湿润环境中37 °C培养（除非实验方案中另有说明）_。

1. 肠道模型系统所用细胞系的前期准备
   1. 以 5 x 10⁵ 个细胞/孔的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞⁵ 在5 mL含有2 mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中 F25培养瓶中培养细胞，在构建肠道模型前4天放入培养箱中培养。48小时后，用移液器移除培养基，然后加入新鲜培养基（5 mL），继续培养细胞48小时。
      注意：细胞在使用前必须达到80%融合度。
   2. 接种Caco-2细胞（浓度为2 × 10⁶) 加入10 mL DMEM培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素）中，置于 F75 细胞培养瓶中培养细胞，在构建肠黏膜模型前于培养箱中培养 4 天。48 小时后，按照步骤 1.1.1 所述更换培养基，继续培养 48 小时，直至细胞融合度达到 80%。
      注意：细胞必须处于活跃增殖阶段：密度不宜过低或过高，建议汇合度为50%-60%。建立模型前一天不应接种细胞，因为这可能降低细胞的增殖能力，导致细胞无法在重建的三维模型中完全贴附生长。
   3. 加入悬浮培养的U937细胞（浓度为1 x 10⁶) 加入含 2 mM L-谷氨酰胺、1% 丙酮酸钠、10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基中，接种于 F75 培养瓶，于模型建立前 2 天放入培养箱培养 48 小时。
2. Transwell 共培养板插件的制备
   1. 选择一个含有0.4 µm滤膜插件的24孔板。
      注意：0.4 µm 滤膜是药物转运研究中的标准选择。不推荐使用 3 µm 和 8 µm 滤膜，以避免包埋在胶原中的细胞可能发生的损失。
   2. 使用移液器在滤膜插件（以下简称膜插件）的上方和下方各加入 500 µL 的亨克氏平衡盐溶液（HBSS），以润湿 Transwell 滤膜。
   3. 盖上多孔板，放入培养箱中孵育至少2小时。
      注意：膜插件可在HBSS中保存最多24小时，此操作可在构建模型的前一天进行。必须确保膜插件充分水化，滤膜不得干燥，否则可能影响样本的正常贴附。
   4. 2小时（或24小时）后从培养箱中取出培养板。使用移液器小心吸去膜插件上方和下方的HBSS，并静置干燥10分钟。
3. 基础三维肠道模型系统无细胞胶原固有层的制备（第1天）
   1. 在冰上，于50 mL无菌管中制备无细胞胶原溶液，其中包含以下成分：DMEM培养基中含10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺、1%碳酸氢钠和1.35 mg/mL Ⅰ型大鼠尾胶原。
      注意：所有组分必须保持在冰上，并使用预冷的移液器吸头加入 DMEM 中。I 型大鼠尾胶原必须最后加入，因其会随温度和 pH 升高而发生聚合。所制备的无细胞胶原溶液的用量取决于所需肠等效物的数量。
   2. 向每个培养板插件（膜过滤器上方）中加入 250 µL 溶液，溶液量根据所选肠道等效物的数量确定，然后盖上多孔板盖。将胶原溶液置于超净台内室温（RT）条件下静置，使其聚合。
      注意：除了向更固态的转变外，聚合反应还可通过颜色由黄色变为粉红色来判断。聚合反应通常在10–15分钟内完成。
4. 成纤维细胞（L929）和单核细胞（U937）的制备、细胞计数及接种至模型系统（第1天）
   1. 从培养箱中取出L929细胞培养物（步骤1.1.1）。使用真空泵吸去培养基，加入5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS；不含Ca和Mg），轻轻冲洗细胞。
   2. 使用真空泵吸去 PBS。加入 2 mL 预先配制的胰蛋白酶-EDTA 溶液（含 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液），放入培养箱中孵育 3–5 分钟。
   3. 使用倒置显微镜（例如 Eclipse Ts2，Nikon）观察细胞是否从贴壁表面脱落。若出现脱落现象，立即加入 2 mL DMEM（含 10% FBS）以终止胰蛋白酶反应，并冲洗细胞。
   4. 将细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中，以645 x g 5 分钟后，使用真空泵抽吸上清液。
      注意：操作时需小心，避免扰动沉淀。已测试DMEM对L929和U937细胞的影响，结果表明其对细胞生长无不良影响。
   5. 向沉淀中加入1 mL DMEM，重悬细胞。
      注意：细胞必须在溶液中均匀悬浮。
   6. 从DMEM中的细胞悬液中取出20 µL，加入20 µL台盼蓝溶液。取20 µL混合液，使用细胞计数板在显微镜下评估细胞密度。
   7. 将U937细胞培养物（步骤1.1.3）从培养箱中取出。以645 x g 5 分钟。使用真空泵抽吸上清液，避免扰动沉淀。
   8. 将细胞重悬于1 mL RPMI培养基中。与L929细胞相同，确保细胞在溶液中均匀悬浮。
   9. 同样，按照步骤 1.4.6 中所述建立细胞密度。
   10. 按照步骤1.3.1所述制备胶原蛋白溶液。
       注意：配制溶液的总量需考虑每个小室（或模型）需要 450 µL。
   11. 配制DMEM溶液，使每50 µL溶液中含有50,000个L929细胞和15,000个U937细胞，用于构建每种肠等效模型。
       注意：细胞数量是一个关键因素。两种细胞数量过多会导致固有层细胞过于密集，无法充分有序排列。成纤维细胞（产生胶原蛋白）数量不足会导致固有层结构不够致密，而单核细胞数量过少则会削弱对刺激的免疫反应。若每份50 µL细胞悬液中细胞数量准确，则可为每个24孔板中的12个滤膜插入物制备总共600 µL的细胞悬液。
   12. 将每份含有细胞的50 µL等分试样加入步骤1.4.10中的450 µL胶原溶液中，充分混匀。
   13. 将含有细胞的胶原溶液每模型500 µL覆盖于预先包被的无细胞胶原黏膜下层上。
       注意：必须迅速将液体加入每个插入物中，因此建议每次重建的肠黏膜模型数量不超过12个。
   14. 关闭培养板，放入培养箱中孵育2小时，使溶液凝固。
5. 肠模型中上皮样Caco-2细胞的制备、计数及接种（第1天）
   1. 从培养箱中取出Caco-2细胞培养物（步骤1.1.2）。参照步骤1.4.1的操作，使用10 mL PBS进行初步冲洗。随后加入5 mL预配的胰蛋白酶-EDTA溶液（含0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的无钙镁PBS溶液），放入培养箱中孵育5–8分钟。
   2. 重复步骤 1.4.3（但使用 5 mL DMEM 终止胰蛋白酶反应）至步骤 1.4.6，利用细胞计数板对细胞进行计数。
   3. 配制含150,000个Caco-2细胞的DMEM溶液，体积为50 µL。
      注意：细胞使用数量是一个关键点。若细胞数量超过150,000个，可能导致上皮层致密且排列紊乱；而细胞数量过少（少于100,000个）时，细胞生长困难，无法充分覆盖基底膜，从而形成不连续的肠上皮层。确保细胞充分悬浮，可使用200 µL移液枪枪头轻轻吹打以实现均匀分布。鉴于每次最多可同时构建12个模型，可预先配制600 µL细胞悬液。
   4. 在步骤1.4.14所需的2小时后，向每张基底膜中央加入50 µL用DMEM悬浮的Caco-2细胞。盖上多孔板的盖子。
   5. 在无菌超净工作台中孵育10分钟，然后转移至培养箱中孵育30分钟。
   6. 配制含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM溶液。
      注意：需制备足量溶液，以保证每个模型使用 1 mL 体积。
   7. 在重建模型上方加入500 µL培养基，滤膜下方加入500 µL培养基。
      注意：在滤膜上方添加培养基时需小心操作，以避免使细胞脱落或受到损伤。
   8. 关闭多孔板系统并将其放入培养箱中。
6. 模型制备、形成与使用（第2天至第6天）
   1. 第2天：使用移液器小心移除滤膜上方和下方的培养液。分别在滤膜上方和下方加入500 µL新鲜DMEM培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素）。
   2. 第3天：重复步骤1.6.1中的操作。
   3. 第4天：重复步骤1.6.1中的操作。
      注意：该肠道模型为静态细胞模型，因此，为促进分子释放以及细胞的生长和刺激，每天更换培养基至关重要。
   4. 第5天：此时模型已完全形成/发育完成。可使用这些模型进行后续研究。
      注意：使用该模型的最佳时间为第5天。尽管细胞可在培养箱中维持更长时间，但随着时间的推移，上皮细胞可能发生不受控生长，形成无序且致密的细胞层，难以使用。
   5. 在第5天，将模型与感兴趣的毒性成分（麸质或脂多糖 [LPS]）或有益成分（多酚）共同孵育。将这些成分添加至悬浮于DMEM培养基中的重建模型的上层部分。
      注意：必须计算各目标成分的合适浓度，并将其悬浮于DMEM培养基中。需设置仅含DMEM培养基的未处理对照组，以便与实验模型进行比较。
   6. 将对照组和实验组模型在培养箱中孵育24小时。
   7. 第6天：用移液管吸去滤膜上方和下方的培养基。
      ​注意：培养基可保存用于后续的酶联免疫吸附试验（ELISA）类型检测，以测定炎症细胞因子的释放。为此，需将培养基加入无菌小瓶中，并于 -20 °C 保存以备进一步分析。

2. 重建肠黏膜模型的石蜡包埋

注意：整个操作过程必须在化学通风橱中进行。每个步骤及其相应的时间分配必须严格遵守。因此，提前准备好所有试剂非常重要。

1. 将石蜡包埋机温度设置为 58 °C，以便 即可使用。
2. 使用镊子将膜插件转移至无菌24孔板的洁净孔中。
3. 在滤膜上方加入 500 µL 的 37% 缓冲福尔马林 PBS 溶液，滤膜下方加入 1 mL。盖上盖子，在室温下置于化学通风橱中孵育 2 小时。
   注意：作为替代方案，可使用4%缓冲甲醛在室温下固定1小时。
4. 移除甲醛溶液，在滤膜上方和下方均加入HBSS溶液，然后移除HBSS。
5. 将固有层从膜插件上分离。
   注意：肠黏膜细胞通常会非常容易地从膜插件上脱落，因为它们并未与后者发生附着。此外，两个样本区室（顶侧和基底侧）仍保持连接，从而维持三维结构。如果由于某些原因细胞未能顺利脱落，则需使用无菌的一次性手术刀片将肠黏膜从膜插件上小心剥离。此时可将膜插件剪下，使其与塑料支架分离。操作过程中切勿用刀片接触样本。将膜插件从胶原包埋的细胞中移除的原因在于，在后续的固定或石蜡包埋过程中，该滤膜可能自行脱落，导致不同肠黏膜模型之间的比较失衡。此外，包埋切片中的膜插件具有不同的物理一致性，可能干扰切片过程。
6. 将100 mL烧杯置于化学通风橱下，每个烧杯均正确标记，分别用于盛放一种待研究的重建肠黏膜模型系统。向每个烧杯中加入25 mL 35%乙醇，然后加入重建肠黏膜组织。孵育10分钟。
7. 将35%乙醇替换为25 mL 50%乙醇，孵育10分钟。
8. 用25 mL 70%乙醇替换50%乙醇，孵育10分钟。
9. 用25 mL 80%乙醇替换70%乙醇，孵育10分钟。
10. 用25 mL 95%乙醇替换80%乙醇，孵育10分钟。
11. 用25 mL的100%乙醇替换95%乙醇，孵育10分钟。
12. 用另一份25 mL的100%乙醇替换现有100%乙醇，孵育10分钟。
13. 在通风橱下放置100 mL烧杯，每个烧杯均正确标记，用于盛装一种待研究的模型。加入50 mL二甲苯或组织透明剂，处理10–20分钟。
    注意：建议使用Histo-Clear（组织透明剂），该试剂可增强嗜酸性染色的清晰度和鲜艳度。不同重建肠黏膜样本的透明时间可能有所差异，需每隔2-3分钟检查一次样本的透明度。
14. 一旦样品变得透明，立即将其放入金属组织包埋盒中，然后将包埋盒浸入加热装置内的液体石蜡中，孵育45分钟。
15. 更换石蜡，并将样品置于加热设备中继续孵育45分钟。
16. 取出组织包埋盒架并置于冰上冷却。当冷却后的样本块从金属架上脱落时，可于室温下进一步冷却。
17. 将组织块置于室温保存。
    注意：如果目的是立即制备切片，则可将组织块置于 4 °C 环境中充分冷却后再使用。
18. 使用切片机切取 4 µm 厚的切片。
19. 将切好的组织片置于载玻片上，于37 °C烘箱中干燥24 h。
20. 载玻片已可使用。在进行H实验之前，将其在室温下保存。&组织学染色或免疫组织化学反应染色（抗原-抗体型）。
    1. 用于免疫组织化学染色时，选择感兴趣的抗体（可用于研究紧密连接蛋白） 例如闭锁蛋白（occludin）或单核细胞活化、迁移和分化相关蛋白）的表达，并使用商用试剂盒通过染色方法进行检测。
    2. 类似地，使用阿利新蓝和过碘酸-雪夫（PAS）染色试剂盒检测黏液。
    3. 通过计算显微镜拍摄的显微照片中目标紧密连接蛋白（如occludin）染色阳性像素的百分比，来定量分析其表达水平。
    4. 使用图像分析软件（例如 ImageJ2 软件 [Wayne Rasband, 版本 2.9.0/1.53t]）分析细胞图像。
       1. 为进行像素分析，将数字图像处理为300像素/英寸，并转换为8位。然后，对二值图像进行处理 颜色解卷积 用于分析目标蛋白染色情况的插件，在本例中为occludin的永久红染色。
       2. 将选定的图片保存为 tiff 格式并进行后续处理 "纯化" 使用图形编辑软件（例如 Adobe Photoshop CC [版本 20.0.4]）消除伪影的步骤
       3. 随后，使用该应用程序测量所有感兴趣的区域 分析颗粒 ImageJ2 的像素数量，并以像素数报告数据。
          注意：每个实验应设置三个重复，每个重复内分析三个重复区域。对于黏液的定量，可采用相同的像素测量原理，分别应用于中性黏液染成紫红色和酸性黏液染成亮蓝色的图像。

结果

第一个重要方面是确定基本的3D肠道等效黏膜在实验目的上的可接受性。这通过组织学和组织病理学实验室中最常用的染色方法来完成，即苏木精（将细胞核物质染成深蓝紫色）和伊红（将细胞质物质染成不同程度的粉红色）。首先对未经处理的对照组进行H&E染色，该对照组在与实验处理组相同的条件和时间框架下培养。通过观察细胞的形态、形状和结构，可判断该肠道细胞模型系统的成功与否：在培养5天后，Caco-2细胞应在富含细胞外基质（ECM）的固有层上方形成紧密且规则的单层细胞（图1A）。被认为不适合进一步分析的模型系统示例包括上皮层过度生长且结构紊乱的情况，如培养10天后所示（图1B）。另一个示例是上皮层过厚且无序（图1C），这可能是由于接种了过多的Caco-2细胞或培养时间过长所致。畸形（图1D）也是不可接受的重建肠道黏膜的示例，其原因可能是接种的细胞未处于活跃增殖阶段，或在固有层制备过程中或石蜡固定期间出现问题（细胞...

讨论

本文介绍的基础重建肠道黏膜模型系统（图6）结合了生理复杂性（包含Caco-2单层细胞、富含细胞外基质的固有层支持结构以及成纤维细胞和单核细胞的更接近生理状态的三维细胞培养）与实验简便性（使用商业化的人源细胞系构建标准化且易于重复的系统）¹³。因此，该模型系统被认为是一种适用于评估潜在药物或食品成分对肠道屏障完整性影响的合适替代小鼠模型。在此方面，已有研究证实，当前的细胞培养模型在检测潜在有益化合物（包括剂量依赖性）以及有害食品成分方面具有有效性^7,16,17。此外，可在该肠道黏膜模型中添加LPS或其他促炎试剂（如2,4,6-三硝基苯磺酸或葡聚糖硫酸钠），以模拟炎症性肠病（IBD） 的症状。通过这种方式，有可能从结构层面以及细胞因子表达（例如作为IBD标志物的促炎因子MDK）角度研究肠道疾病的病因^15<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔新蓝/PAS 染色试剂盒	ScyTek Laboratories, Inc.	APS-1, APS-2	免疫组织化学染色试剂盒
台盼蓝溶液	Thermo Fisher	15250061	细胞计数分析
Caco-2 结肠腺癌细胞	ATCC	ATCC HTB-37	细胞系
柠檬烯基 Citro-Histo-Clear	Histoline laboratories	R0050CITRO	石蜡包埋用试剂
Dulbecco's 改良伊格尔培养基（DMEM）	GIBCO	11965092	细胞培养试剂
包埋中心	Histoline laboratories	TEC2900	石蜡包埋仪器
胎牛血清（FBS）	GIBCO	A5256701	细胞培养试剂
Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）	GIBCO	12350039	细胞培养试剂
人源中节蛋白 ELISA 试剂盒	Cohesion Biosciences	CEK1270	ELISA 试剂盒
倒置显微镜	Eclipse Ts2, Nikon	MFA34100	显微镜
L929 小鼠成纤维细胞	ATCC	ATCC ®-CCL1	细胞系
LC3-II	Novus Biologicals	NB910-40752SuperNovusPack	抗体
L-谷氨酰胺	GIBCO	A2916801	细胞培养试剂
闭合蛋白（Occludin）	Novus Biologicals	NBP1-87402	抗体
石蜡 Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C	Histoline laboratories	R0040 PLUS	石蜡包埋仪器
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞培养试剂
青霉素-链霉素	GIBCO	15070063	细胞培养试剂
大鼠尾胶原 I 型	GIBCO	A1048301	细胞培养试剂
罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）	GIBCO	21870076	细胞培养试剂
丙酮酸钠	GIBCO	11360070	细胞培养试剂
Thermo Fisher Countess II FL 全自动细胞计数仪	Thermo Fisher	TF-CACC2FL	细胞计数仪器
Transwell	Costar Corning	3413	细胞培养用塑料器皿
胰蛋白酶	GIBCO	15090046	细胞培养试剂
U937 前单核细胞型人髓系白血病细胞系	ATCC	ATCC CRL-1593.2	细胞系
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent（永久红）染色试剂盒	ScyTek Laboratories, Inc.	AMH080	免疫组织化学染色试剂盒