通过高分辨率呼吸测定法分析精子线粒体功能，可在封闭式反应室系统中测量自由运动精子的耗氧量。该技术可用于测定人类精子的呼吸作用，从而提供有关精子线粒体特征及其完整性的信息。
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摘要
摘要
精液质量通常通过常规精液分析进行研究，此类分析具有描述性，但往往无法得出明确结论。男性不育与精子线粒体活性改变相关，因此检测精子线粒体功能可作为评估精子质量的指标。高分辨率呼吸测定法是一种在密闭腔室系统中测量细胞或组织耗氧量的方法。该技术可用于测定人类精子的呼吸功能，提供有关精子线粒体质量和完整性的信息。高分辨率呼吸测定法允许细胞自由运动，这是一种 先验的 在精子研究中具有优势。该技术可用于完整或通透化处理的精子，能够检测完整精子的线粒体功能以及各呼吸链复合物的活性。高分辨率氧电极仪通过传感器测定氧气浓度，并结合高灵敏度软件计算耗氧量。所得数据可用于计算基于耗氧率比值的呼吸指数。因此，这些指数是两种耗氧速率的比值，并以内源性方式归一化至细胞数量或蛋白质量。呼吸指数可作为精子线粒体功能与功能障碍的指标。
引言
据估计，男性不育占所有夫妇不育病例的40%至50%1。常规精液分析在评估男性生育力方面起着关键作用；然而，约有15%的不育男性其精子参数正常2。此外，常规精液分析提供的精子功能信息有限，且无法反映精子的细微缺陷3。
精子线粒体具有特殊结构，它们以螺旋状鞘层的形式环绕在鞭毛周围。线粒体鞘包含数量可变的线粒体，这些线粒体通过线粒体间连接蛋白相互连接，并通过外膜上有序排列的蛋白质结构锚定于细胞骨架。4,5这一结构使得分离精子线粒体尤为困难。因此，大多数关于精子线粒体功能的研究采用 原位 分析或去膜精子6.
精子线粒体的结构和功能与男性不育密切相关7,8,9,10,11，这表明对这些细胞器的结构和功能进行分析可能是精子分析中值得纳入的指标。
线粒体在细胞能量代谢中发挥着重要作用，特别是通过氧化磷酸化（OXPHOS）利用氧气产生三磷酸腺苷（ATP）。在精子细胞中，ATP的来源（糖酵解与OXPHOS）仍存在争议，大量数据尚无定论，且依赖于不同的实验方法4,12,13。通过氧测定法测量呼吸作用可深入揭示线粒体的呼吸能力、线粒体完整性以及细胞的能量代谢状态14,15,16。传统上，该技术采用克拉克氧电极进行，这种仪器已用于线粒体呼吸测量超过50年17,18。此外，精子线粒体的耗氧量也已通过经典的克拉克氧电极进行分析19,20,21。使用氧图仪（Oroboros）的高分辨率呼吸测定法（HRR）相比传统呼吸测定设备具有更高的灵敏度22。氧图仪由两个带注射口的腔室组成，每个腔室均配有极谱式氧传感器。利用该技术，可分析组织切片、细胞以及分离的线粒体悬液。样品在腔室内持续搅拌，实验过程中连续测定氧气消耗量，并通过专用软件计算耗氧速率。该类腔室的氧气泄漏量较低，是相较于传统氧电极设备的一项优势14,23。
与其他细胞类似，在精子细胞中，高分辨率呼吸测定（HRR）设备的灵敏度高于传统呼吸测定法，这意味着HRR设备可用于分析数量有限的完整或透化精子细胞。通过HRR评估精子线粒体功能主要有两种策略：（a）测定完整细胞中的氧气消耗，需在含有葡萄糖等底物的培养基中重建呼吸功能；或（b）在透化细胞中使用特定的氧化磷酸化（OXPHOS）复合物，并添加特异性底物，分别监测各项功能的氧气消耗。
在本研究中，我们描述了利用高分辨率呼吸测定法（HRR）来测定人类精子细胞中线粒体呼吸的方法。
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方案
实验获得了乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院伦理委员会的批准。
图 1：用于评估完整及通透化人精子线粒体功能的高分辨率呼吸测定工作流程。 本实验方案分为四个步骤：1）样品制备，2）Oroboros仪器中的氧气校准，3）对完整及通透化细胞进行耗氧量测定，以及4）从设备中提取数据并进行分析。缩写：CASA = 计算机辅助精子分析；BWW = Biggers Whitten Whittingham培养基；MRM = 线粒体呼吸介质；ADP = 二磷酸腺苷；FCCP = 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙；AA = 抗霉素A。 请点击此处查看该图的放大版本。
注意：使用高分辨率呼吸测定法（HRR）测量精子细胞耗氧量的工作流程见图1。本方案中所用材料、仪器和试剂的信息见材料表。
1. 样品制备
- 样本采集
- 建议禁欲3天后，通过手淫方式将新鲜的人类精液收集到无菌塑料容器中。样本采集后应立即运送至实验室。
- 将样本在室温（RT）下孵育30–60分钟，使其完全液化24。
- 液化后，将样本保存在37 °C直至实验开始。
- 使用计算机辅助精子分析系统（CASA）进行精子评估
- 混匀样本，取7 µL加入预热的精子计数板中。
- 将计数板置于已预热（37 °C）的光学显微镜载物台上。
- 打开计算机化精子分析软件，进入运动能力与浓度分析模块（点击 运动性（Mot））。
- 选择与人类精子条件相匹配的系统设置。
注意：配置必须根据计数板的类型和深度、样本物种以及CASA系统进行相应调整。 - 点击 分析（Analyze） 按钮，随机分析每个计数板上的10个不同视野。
- 点击 结果（Results） 以获取样本的浓度和运动能力数据。
- 细胞制备
注意：如果高分辨率呼吸测定仪（HRR）尚未校准，请在进行细胞制备（步骤1.3）前先完成步骤2.1–2.2。当精子细胞重悬于培养基中后，应立即测定其耗氧量。- 在室温下以400 × g 离心10分钟。
- 去除精浆，将精子重悬于2 mL Biggers Whitten Whittingham（BWW）培养基中用于完整细胞实验，或重悬于线粒体呼吸介质（MRM）中用于透化细胞研究。培养基的具体成分见 表1。
- 针对精子浓度研究，重复步骤1.2中所述操作。
2. 高分辨率呼吸测定法：OXPHOS 分析
注意：高分辨率呼吸测定系统（HRR）集成了高灵敏度的氧电极仪（Oxygraph-2K；Oroboros Instruments GmbH，奥地利因斯布鲁克）和配套软件（DatLab，版本4.2；Oroboros Instruments GmbH）。实验数据以氧浓度随时间变化的形式显示（单位为 pmol O2/106 细胞·min−1），并实时转换这些数据，使实验人员能够在实验进行过程中持续监测生物和生化样品的呼吸作用（氧气消耗量、氧通量）。HRR可用于监测活细胞和运动细胞的呼吸，尤其适用于精子，因为精子的运动能力与其质量和生育潜力密切相关。本实验室使用配备两个腔室的HRR Oroboros Oxygraph-2k仪器（Oroboros Instruments）。本方案中所述步骤需对两个2 mL腔室分别独立进行。
- 仪器准备
- 打开HRR，将其连接至呼吸测定软件（DatLab）以进行数据采集与分析。
- 用去离子水替换氧电极室中的70%乙醇2O. 在室温下用磁力搅拌子以750 rpm持续搅拌，静置10分钟，然后吸除双蒸水（dd H₂O）。2O 后。
- 用ddH₂O洗涤小室三次2每次 O 5 分钟。
注意：此步骤旨在去除腔室中残留的乙醇。精子细胞对乙醇极为敏感。若省略此步骤，记录结果可能受到影响。
- 氧气传感器的校准
注意：校准步骤因仪器而异。请按照制造商说明对极谱式氧气传感器进行空气校准25本节简要说明校准流程。- 去除 ddH₂O2O，并将用于细胞制备的相同培养基2 mL用移液器加入腔室中。插入塞子，留出一个用于气体交换的气泡。
注意：确定腔室的体积对于计算所需培养基的确切体积至关重要。 - 记录氧气校准值（点击 布局 > 01 校准实验 组3-温度) 通过以750 rpm的转速用搅拌子搅拌培养基至少30分钟，以监测传感器膜的性能 37 °C使用其他设置如下：传感器增益：2；极化电压：800 mV；数据记录间隔：2.0 s。
注意：预期获得一个 O2 斜率未校正（红线）在 ±2 pmol∙s 范围内−1·mL−1 极谱传感器信号稳定后。 - 按住鼠标左键和 Shift 键的同时拖动鼠标，选择氧浓度变化（Y1 O2 Concentration，蓝色线条）稳定的区域。
- 打开 O2 校准 窗口（单击 氧电极仪 > O₂ 校准）。在 空气校准，将选定的标记更改为步骤 2.2.3 中选择的区域。最后单击 校准并复制到剪贴板.
- 停止录制，然后单击以保存 氧电极仪 > 阴性对照 > 保存并断开连接.
注意：该数据集必须保存，以便用于当天的所有实验。每种培养基每天仅需校准一次。
- 去除 ddH₂O2O，并将用于细胞制备的相同培养基2 mL用移液器加入腔室中。插入塞子，留出一个用于气体交换的气泡。
- 皂苷-透化滴定
- 打开培养 chamber，吸出内部培养基。
- 至少将 24 x 10 装入腔室6 且不超过 70 x 106 2 mL MRM终体积中的精子细胞
注意：为了在实验结束时调整氧气消耗量，必须测量腔室中细胞的数量。若细胞数量少于推荐值，则无法进行测量。 - 通过将塞子完全推入来关闭腔室，并抽吸顶部残留的液体。使用与校准相同的设置开始实验：搅拌速度：750 rpm；温度： 37 °C传感器增益：2；极化电压：800 mV；数据记录间隔：2.0 s。
- 要加载校准文件，请双击 阳性校准 右下角的框。打开步骤 2.2 中执行的校准（点击） 氧电极 > O₂ 校准 > 从文件复制），然后点击 校准并复制到剪贴板.
注意： POS校准 盒子将从黄色变为绿色。数据以每单位体积校正后的氧流量形式显示（布局05 未校正每单位体积通量）。其他不同布局也可用 氧电极 > 布局. - 添加 5 µL 0.5 M 二磷酸腺苷（ADP） 10 µL 2 M 谷氨酸 2.5 µL 0.4 M 苹果酸（终浓度分别为 1.25 mM、10 mM 和 0.5 mM）。持续测定氧气消耗，直至信号稳定。
注意：使用精密 Hamilton 微量注射器通过塞子上的加样口进行注射。每种药物使用单独的注射器，以避免交叉污染。点击 F4 注册，并在添加治疗措施时标记于氧疗登记表中。
注意：底物在超纯水中制备，并于 −20 °C 3个月。 - 通过添加进行研磨 1 µL 用10 mM的皂苷分步处理，直至耗氧量达到最大水平。
注意：如果同一培养 chamber 在同一天用于两次实验，则必须用清水、70% 乙醇和 100% 乙醇彻底清洗。
注意：皂苷素用超纯水配制，并于 −20 °C 3个月。
- 完整及透化精子细胞（复合物I或复合物II）的常规呼吸功能评估方案
- 打开培养室，吸出内部培养基。
- 至少将 24 x 10 装入腔室6 且不超过 70 × 106 在2 mL BWW（完整细胞分析）或MRM（透化细胞分析）的终体积中处理精子细胞。
- 以与校准相同的设置开始实验（该步骤在2.3.3中已描述）。
- 按照步骤 2.3.4 中所述，加载在步骤 2.2 中完成的校准。
- 记录细胞呼吸至少5分钟，直至获得稳定信号。该测量值对应于完整细胞的基础呼吸。
- 如果实验使用完整细胞，则继续进行步骤 2.4.9。对于透化细胞，进行注射 4.5 µL 10 mM皂苷（终浓度： 22.5 µM）。将细胞透化处理 5 分钟。
- 加入底物： 10 µL 2 M 谷氨酸 2.5 µL 分别为复合体 I 提供 0.4 M 苹果酸（终浓度：10 mM 和 0.5 mM） 20 µL 加入1 M丁二酸盐（终浓度：10 mM）以检测复合体II。持续测定氧气消耗，直至信号上升并趋于稳定。此为状态4，即在无ADP存在条件下，由基础复合体I或基础复合体II支持的呼吸。
注意：底物使用超纯水配制，并在 −20 °C 3个月。 - 注射 5 µL 0.5 M ADP（终浓度：1.25 mM）。持续检测氧消耗，直至信号上升并稳定。加入ADP后，信号增强，对应于透化细胞中复合物I或复合物II介导的最大氧消耗速率（状态3）。
- 添加 1 µL 4 mg/mL 寡霉素（终浓度： 2 µg/mL），一种ATP合酶抑制剂。持续检测氧气消耗，直至信号下降并稳定。
注意：寡霉素用乙醇配制，于 −20 °C 3个月。 - 通过添加进行滴定 1 µL 以0.1 mM至1 mM的羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）逐级处理，直至达到最大非耦联呼吸速率。持续检测耗氧量，直至信号上升并稳定。
注意：FCCP 用乙醇配制，于 −20 °C 3个月。 - FCCP 的最终浓度取决于样品。当氧气消耗开始下降时，停止注射药物。
- 最后，注射 1 µL 5 mM 抗霉素A（2.5 µM 终浓度）。这是一种复合体III抑制剂，用于区分线粒体耗氧与残余耗氧（非线粒体呼吸）。在分析复合体I时，加入 1 µL 1 mM 鱼藤酮（0.5 µM 终浓度），该复合物的抑制剂，替代AA。持续检测氧消耗，直至信号下降并稳定。
注意：药物以乙醇配制，于 −20 °C 3个月。
3. 数据提取与分析
图 2：从高分辨率呼吸测定实验中获取呼吸参数。（A、B）分别为完整细胞和通透化细胞所获得图形的示意图，如图 1所述。这些参数此前已有描述15。请点击此处查看该图的放大版本。
- 按住鼠标左键和 Shift 键并拖动鼠标，选择在加入底物或抑制剂后每体积氧通量相关值（Y2 O2 斜率未校正，红线）保持稳定的区域。图 2 显示了从前述记录中获得的不同参数15。
注意：参数取决于实验；所有参数如下：完整细胞中的基础呼吸以及在谷氨酸/苹果酸或琥珀酸存在下的呼吸（状态 4）、ADP（状态 3）、寡霉素（质子漏）、FCCP（最大呼吸速率）、鱼藤酮/抗霉素 A（非线粒体呼吸）。在透化细胞中，基础呼吸对应于状态 3。 - 点击 标记 > 统计 窗口，并导出数据。
- 将获得的数据归一化为每 100 万精子细胞。斜率的单位为 pmolO2·s−1·mL−1·10−6 细胞。
- 在计算指数之前，从所有数值中减去非线粒体耗氧量。
- 使用前述各种方程15计算指数：
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结果
确定精子细胞中皂苷（digitonin）的最佳浓度
在本实验方案中，我们介绍了利用高分辨率呼吸测定法（HRR）实时监测人精子细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）变化的方法。由于该方法可用于分析完整或经皂苷透化的精子细胞，我们首先介绍了透化精子细胞所需皂苷浓度的标准化过程（图3）。
皂苷（Digitonin）可用于化学透化处理，使底物进入细胞，并用于检测线粒体活性。该化合物必须在完整细胞中进行滴定，以确定最佳浓度，确保细胞膜透化的同时不破坏线粒体膜的完整性。我们在ADP、谷氨酸和苹果酸存在的条件下进行了滴定实验。在基线状态及逐步添加皂苷后测量了呼吸速率（图3A）。随着去垢剂浓度的增加，耗氧量上升，直至达到一个临界点，此时线粒体外膜的完整性开始受到破坏（图3A中的红色箭头所示）。图3B展示了4次代表性实验的平均值...
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讨论
HRR 严重依赖于以下几个步骤：（a）仪器维护，（b）氧传感器的精确校准，（c）解偶联剂的滴定26，以及（d）合理使用反映线粒体功能的指标。仪器维护至关重要。建议定期更换极谱氧传感器的膜，并校正仪器本底信号。在从检测室收集精子后进行充分清洗，对于获得良好的重复性结果十分关键，尤其是在频繁使用仪器分析多种组织或细胞的实验室中。精子对微量的鱼藤酮、抗霉素A（AA）、寡霉素和FCCP均十分敏感，因此清洗步骤必须谨慎操作（至少用乙醇清洗三次，再用蒸馏水清洗三次）。校准是关键步骤，必须每天进行，并针对每种使用的培养基分别校准（参见实验方案第2.2步）。解偶联剂滴定必须小心进行，因为必须使用最佳浓度的解偶联剂以实现呼吸通量的最大化刺激，避免过度滴定，否则反而会抑制呼吸27。最佳解偶联剂浓度取决于细胞类型、细胞浓度和培养基，并且在透化细胞与完整细胞之间有所不同14。因此，对于精子样本，由于精子细胞可能存在异质性，解偶联剂的用量需根据每个样本进行调整28...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Fertilab男科诊所，特别是José María Montes和Andrea Torrents，允许我们使用其供体资源。经费支持：A.C. 获得乌拉圭共和国大学（CSIC_2018，Espacio Interdisciplinario_2021）的资助。额外经费来自乌拉圭基础科学开发计划（PEDECIBA, Uruguay）。P.I. 和 R.S. 获得乌拉圭共和国大学（I+D, CSIC 2014；I+D, CSIC 2016，科研入门项目 CSIC 2019 和 FMV_1_2017_1_136490 ANII-Uruguay）的资助。P.I. 还获得POS_FMV_2018_1_1007814和CAP-UDELAR 2020项目的资助。插图使用Biorender.com绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无酸牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A8806 | |
| 5'-二磷酸腺苷单钾盐二水合物 | Sigma Aldrich | A5285 | |
| 链霉菌来源的安尼霉素A | Sigma Aldrich | A8674 | |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| 羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙 | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab 软件版本 4.2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G7021 | |
| 皂苷 | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-谷氨酸 | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-苹果酸 | Sigma Aldrich | M1000 | |
| 硫酸镁 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 微升注射器 | Hamilton | 87900 或 80400 | |
| 显微镜相机 | Basler | acA780-75gc | |
| 带相差功能的 Eclipse E200 显微镜，10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| 寡霉素A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2K 氧气测定仪 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-呼吸计 | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| 鱼藤酮 | Sigma Aldrich | R8875 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| 乳酸钠 | Sigma Aldrich | L7022 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | P2256 | |
| 精子分类分析仪 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| 精子计数板 DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| 琥珀酸二钠盐 | Sigma Aldrich | W327700 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa
Posted by JoVE Editors on 9/26/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa. The Protocol and Representative Result sections were updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. Please click here to view a larger version of this figure.
