本方案中介绍了两种使小鼠腰椎单轴压缩测试更易实现的方法。首先，描述了将三点弯曲试验机改装为压缩试验机的方法。其次，采用了一种使用骨水泥制备加载面的包埋方法，并将其适用于小鼠腰椎。
本文内容
摘要
摘要
人们日益认识到，皮质骨和松质骨在调节和响应针对年龄相关性骨丢失的药物治疗、激素治疗及其他治疗方法方面存在差异。三点弯曲法是一种常用方法，用于评估治疗对富含皮质骨的长骨骨干中段区域的影响。尽管单轴压缩测试可用于评估富含松质骨的骨骼，但由于技术上的挑战，小鼠椎体的压缩测试较少开展。而将三点弯曲测试与压缩测试结合使用，以确定某种治疗对长骨干骨中段区域和椎体中心影响的相似性或差异性，则更为罕见。本文中，我们介绍了两种操作步骤，旨在使小鼠腰椎椎体的压缩测试与三点弯曲测试并行实施时更具可行性：第一，将三点弯曲试验机改装为压缩测试机的操作流程；第二，制备小鼠腰椎加载面的包埋方法。
引言
与年龄相关的骨变化因其会增加骨折风险而被广泛认为是一个重要问题。人类骨折可导致慢性疼痛、活动能力下降、长期残疾、死亡风险升高以及经济负担1。目前研究较多的用于缓解年龄相关性骨变化症状的常见疗法包括膳食补充剂、激素治疗和药物治疗2,3,4,5,6,7,8,9。针对人类受试者的此类治疗方法的初步研究通常采用小型动物模型（例如实验室大鼠和小鼠），这些动物具有人类骨骼中存在的两种主要类型的骨组织10。四肢长骨（如肱骨、股骨和胫骨）富含皮质骨（即致密骨），而椎体则富含松质骨（即编织骨、海绵状骨或小梁骨）4。目前已有越来越多的研究表明，皮质骨（例如长骨骨干中段）与松质骨（例如椎体中心）在骨调控机制和信号通路方面存在差异2。因此，不同疗法可能对不同类型的骨组织产生特异性作用，甚至在同一块骨的不同部位也表现出位点特异性效应2,3,4。
对物体（例如骨骼）施加力会导致该物体产生加速度、形变或两者同时发生，具体取决于物体的边界条件。当骨骼受到约束时，会产生一个大小相等、方向相反的反作用力来抵抗其加速度，从而导致形变的发生。随着骨骼持续发生形变，内部会产生一种称为应力的抵抗作用，应力主要有两种基本类型：表现为拉伸或压缩的法向力，以及剪切力10。通常情况下，根据所施加的力系统的不同，会生成多种基本应力类型的组合10。材料的强度是指其在不发生失效的情况下承受应力的能力。当对材料施加的力逐渐增大时，材料最终会发生永久性形变，此时称其已从弹性状态（即若去除外力，材料可恢复原始形状）转变为塑性状态（即若去除外力，材料无法恢复原始形状）11。由弹性状态向塑性状态转变的临界点称为屈服点。当施加于材料的力超过屈服点并继续增大时，材料将逐渐产生微裂纹（即损伤），直至发生完全断裂；此时称该材料已发生失效11,12。骨的断裂在结构层面和组织层面均表现为一种失效10。例如，椎体骨的断裂不仅是因为多个骨小梁在结构层面上发生断裂，还因为在组织层面上，单个骨小梁内的细胞外基质成分（如胶原蛋白和羟基磷灰石晶体）也发生了破坏。
导致材料失效的力学事件可通过多种测试方法进行测量。三点弯曲法是测试附肢骨骼长骨力学性能的常用方法。该方法操作简便且可重复性高，因此成为许多研究人员首选的生物力学测试方法13。通过将横梁压头下移至放置在两个下方支撑梁上的长骨骨干中段，该方法可特异性地检测骨干中段区域的力学性能，该区域主要由致密排列的皮质骨构成。根据载荷-位移曲线，可测定骨材料的弹性、韧性、断裂载荷以及由弹性变形向塑性变形转变等特性，以及其他相关力学参数。
在第二种类型的骨组织中，即所谓的骨小梁、松质、编织或海绵状骨（cancellous bone），骨结构形成一系列称为骨小梁（trabeculae）的杆状和梁状排列，呈现出"海绵样"的外观。脊柱的主要椎体（即椎体中心，centra）富含海绵状骨，常成为人类与年龄相关的压缩性骨折的发生部位14。腰椎（即下背部椎骨）是体积最大的椎骨，承受身体大部分重量，也是椎体骨折最常见的部位15,16。由于轴向压缩是体内（in vivo）椎体所承受的主要力学负荷，因此采用单轴压缩测试方法可最直接地评估椎体的力学性能17。体内的椎体压缩主要由肌肉和韧带的收缩、重力作用以及地面反作用力引起18。
离体 由于小型动物椎体体积小、形状不规则且质地脆弱，对其进行压缩测试可能较为困难。椎体的形状可近似为一个具有轻度腹侧倾斜和轻微头端凹陷的平行四边形。17这种形状给实现单轴压缩测试带来了挑战 离体 因为如果没有对加载表面进行充分准备，压缩力将仅作用于加载表面的一部分，从而导致 "局部接触"17,19这可能导致结果不一致和过早失效19情况并非如此 体内 因为椎体关节处的加载面周围有椎间盘环绕，使得载荷能够分布至颅侧终板。椎间盘-颅侧终板复合体在力向整个椎体的传递以及椎体骨折的生物力学过程中发挥着重要作用14,20尽管压缩测试在生物学领域并非新技术，但目前骨骼力学测试方法仍存在一些局限性。这些局限性包括缺乏用于骨骼力学的预测模型和模拟手段、骨骼独特的几何空间结构，以及固有的基于样本的生物学差异。21更重要的是，该领域面临不同方法之间缺乏标准化，以及文献中普遍缺乏对所用方法的充分报告。22.
文献中报道了两种制备啮齿类动物腰椎以进行单轴压缩测试的方法：切割法和包埋法17,19,23,24,25,26切割方法要求将椎体的椎弓、颅侧终板和尾侧终板从椎体上切除。Pendleton 等19 我们此前已报道过该方法在小鼠腰椎椎体上的详细应用步骤。该方法在操作中存在挑战，需在尾侧和头侧终板处均实现完全平行的切割，同时避免对样本造成任何损伤。此外，该方法存在一个局限性，即头侧终板会被切除。头侧终板含有致密的皮质骨壳，对椎间盘载荷的传递与分布具有重要作用。 体内 并参与骨组织功能失常的发生过程 体内 骨折17,20,27相比之下，包埋法是在保留椎体颅端终板完整的前提下，去除椎体的椎弓结构。随后通过在椎体颅端表面添加少量骨水泥，使加载面接近水平。该方法的优势在于克服了切割法相关的技术难题，且能更真实地模拟载荷施加方式及骨组织失效的机制 体内 由于保留了颅侧终板，该方法此前已在涉及大鼠骨骼单轴压缩测试的研究中有所记载。然而，据我们所知，该方法此前尚未见于小鼠腰椎椎体等更小样本的相关研究报道。17,25,26该方法此前已由 Chachra 等人详细描述。25 最初使用一块骨标本，将其置于两块各带有一个圆柱形空腔的平板之间，然后用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）填充。同一研究团队随后改进了该方法，将一端（尾侧）轻轻打磨，另一端（头侧）则添加少量骨水泥。26该方法是对先前方法的改进，因其最大限度地减少了压板之间的材料，也是本文的重点。尽管单轴椎体压缩测试存在相关挑战，但该方法可能为评估所提出疗法对骨组织的影响提供有价值的信息，尤其是与三点弯曲测试结合使用时。
本文介绍了一种可转换的三点弯曲/压缩测试装置，该装置可使用同一台设备方便地对长骨和椎体进行测试。此外，还介绍了一种包埋方法，用于实现小鼠腰椎椎体的单轴压缩测试。本研究是更大规模研究的一部分，旨在探讨饮食中添加火麻仁对生长发育期雌性C57BL/6小鼠骨骼骨特性的影响5,6。三点弯曲测试仪最初由科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系的教师和学生设计制造，并已被本研究团队用于长骨的三点弯曲测试（包括大鼠股骨和胫骨7，以及小鼠肱骨、股骨和胫骨5,6,8,9）。然而，该设备的改造及其在小鼠椎体压缩测试中的应用此前 尚未被探索。三点弯曲测试机的设计与构建此前已有描述7。本报告将重点介绍对该设备进行压缩测试改造以及校正系统位移的方法。其次，描述了用于小鼠椎体加载面制备的包埋方法，以及单轴压缩测试和载荷-位移数据的分析方法。
方案
所有实验和方案均遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》，并获得科罗拉多州立大学普韦布洛分校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）的批准（方案编号：000-000A-021）。动物护理的详细操作流程此前已有描述。5,6小鼠在三周龄时获得，作为一项更广泛研究的一部分，旨在探究添加火麻仁饮食对年轻生长雌性C57BL/6小鼠的影响（参见 材料表从5周龄到29周龄，小鼠被分为三组饲喂不同饮食：对照组（0% 火麻仁）、50 g/kg（5% 火麻仁）或150 g/kg（15% 火麻仁），每组八只小鼠5,6在整个研究过程中，小鼠均 随意摄取 可自由获取各自饮食和水，在聚碳酸酯笼中成对饲养，并维持12小时光照：12小时黑暗循环（光照时间为06:00至18:00）。每周评估小鼠体重和健康状况，所有小鼠均顺利完成实验，未出现任何不良健康状况。在29周龄时，小鼠通过异氟烷气体深度麻醉后实施安乐死。 通过 颈椎脱位5,6从胸骨至尾部沿腹侧正中线做切口，取出所有胸腔内、腹腔内及腹膜后器官。去脏后的尸身保存于-70 °C的0.9%氯化钠溶液中，直至约一年后进行椎骨解剖以用于测试。
1. 将三点弯曲试验机改装为压缩试验机
- 卸下三点弯曲试验机上连接至载荷传感器的横梁7（参见材料表）（图1A、B）。
- 将一个自对准上压板通过与横梁相同螺纹的方式旋紧到载荷传感器上（参见材料表）（图1C）。
- 在每个下支撑件上钻两个水平孔，用于后续安装下压板（图1D）。
- 在不锈钢下压板的两侧攻丝，使其螺纹与下支撑件上的钻孔对齐（图1E）。
- 使用带螺纹的六角螺钉将下压板固定到两个下支撑件上，并拧紧至稳固（图1F）。
注意：六角螺钉的螺纹必须与下支撑件以及上下压板上的攻丝孔相匹配。使用自对准上压板可能有助于实现上压板与加载面之间的均匀接触，但由于椎体颅端具有凹面结构，仅此仍不足够，还需采用加载面制备方法进行进一步处理。在为小型动物骨骼构建压缩试验装置时，由于这些骨骼比许多工业/工程材料更小且更脆弱，必须考虑载荷传感器的承载能力和加载框架的尺寸。此外，应定期清洁和润滑设备，以确保测试结果的准确性和平稳运行。
2. 校正压缩试验机的位移
- 在上压板与下压板之间无测试材料的情况下，将上压板缓慢下移至下压板，直至两者轻微接触（预加载力约为0.3–0.5 N）。
- 以恒定下降速度（约 1 mm/min）启动机器，开始压缩测试。使用数字数据采集软件收集载荷（N）和位移（mm）数据（参见 材料表用于机械测试的数据采集。
注意：由于没有任何材料是 在上下压板之间，所观察到的所有位移均仅由机器本身的位移引起（Δx机器（框架、载荷传感器、压板、联轴器等）。 - 以恒定（即单调）速度继续将上压板下移至下压板，直至所受力超过所有骨样本所能达到的最大值。
- 重复步骤 2.1 至 2.3，共进行三次。
- 绘制系统位移数据（Δx机器，毫米） 与施加的载荷（力，N）
- 将最佳拟合回归线拟合到数据中（图2A- D).
- 在包含骨压缩试验数据的电子表格中，使用回归分析提供的方程来确定机器位移量（Δx机器）影响记录的位移（Δx总记录数用于小鼠腰椎压缩试验数据点。
注意：例如，考虑一个数据点，其中施加了 18 N 的力，并记录到 2.730 mm 的位移（Δx总记录数）。根据示例的三阶多项式回归方程（图 2D) [Δx机器 = (4 × 10-7 施加的载荷3) - (8 × 10-5 施加的载荷2) + (0.0044 × 施加载荷)]，记录位移中有 0.056 mm 源于机器位移Δx机器).
Δx总记录数= Δx机器 + Δx样本 - 校正该数据点的记录位移。
注意：例如，考虑上述示例。如果记录到 2.730 mm 的位移（Δx总记录数）和机器位移 (Δx机器）占总位移的0.056 mm，则所关注的试样（即骨组织）所经历的位移为Δx样本）为2.664 mm。因此，椎骨实际发生的位移为2.664 mm（Δx样本）并用于荷载-位移曲线分析。
Δx样本 = Δx总记录数 - Δx机器 - 对每一份样本（骨组织）获取的每一个数据点，重复步骤 2.7–2.8。
注意：此步骤非常重要，因为在压缩测试过程中，所观察到的位移不仅源于试样的形变，实际上，观测到的位移是机器位移（Δx机器）（例如框架、载荷传感器、压板、联轴器等的压缩/位移）以及试样（Δx样本）。因此，对于位移相对较小的样本，例如小型动物（如小鼠）的样本，系统位移（Δx机器）可能导致较大误差。本文所述用于校正系统位移的方法此前已由 Kalidindi 和 Abusafieh 报道。28，他们还详细介绍了除本文所述方法之外的另外两种方法。有研究者被发现会采用多种方法来确定系统位移。17每台机器在施加载荷时，其系统位移的表现形式和程度可能各不相同。因此，必须针对每台机器单独确定系统位移校正系数，且任意两台机器之间的该系数均不相同。与椎体骨压缩试验不同，在测量系统位移时，由于上下压板之间无任何材料存在，不会观察到显著的力值衰减。
3. 小鼠尸体中第5 胸腰椎（L5）的解剖
- 在室温下解冻小鼠尸体，注意通过定期施加0.9% NaCl等渗溶液，保持软组织和骨骼的湿润。
- 在尾部基部附近的背部中线皮肤上做一个小切口（<0.5 cm），然后将切口延伸至后肢两侧，并轻轻拉扯，将毛皮从尾部基部剥离至动物头部。
- 切除腹壁肌肉组织，直至脊柱清晰可见。
- 在解剖显微镜下观察两个骶髂关节及骶骨的颅端。
- 使用剃刀刀片或手术刀，在最后一节腰椎（L6）与骶骨颅端之间做精细切割，将其分离。
- 再次在椎间间隙处切割，将L6和L5从脊柱上移除，并将L5留出用于分析（图3）。
- 在解剖显微镜下检查椎骨，并使用纱布为主、必要时辅以镊子轻轻操作，彻底清除骨骼上的所有软组织，包括椎间盘。
注：本研究中选择L5作为目标椎骨，但也可选择其他腰椎进行压缩测试。
4. 采用PMMA骨水泥包埋法准备L5椎体用于单轴压缩测试的加载面
- 使用安装在旋转工具上的金刚石切割轮（参见材料表），在每个椎弓根处进行切割，以去除横突和棘突（图4）。如果椎体突起仍附着于椎体中心，则在压缩测试时，这些突起本身可能与上下压板发生局部接触，而非将载荷均匀分布于整个椎体中心。
- 使用细粒度120目的砂纸（参见材料表）轻轻打磨椎骨的尾端，以彻底去除所有椎间盘、软组织及表面不规则结构。
- 用永久性记号笔标记已打磨的尾端，以便后续快速识别。
- 按照制造商说明配制PMMA骨水泥（参见材料表）。
- 在PMMA骨水泥仍处于半软状态时，取少量涂抹于朝上的椎骨头端（未标记面），确保完全覆盖整个表面；同时将椎骨置于生理盐水浴中，以保持骨样本的湿润和冷却。
- 在PMMA仍处于半软状态时，将椎骨放置于底部压板上，尾端（已标记面）朝下（图5）。
- 启动机器以啮合驱动齿轮，并缓慢降低顶部压板，直至其接触PMMA骨水泥并施加极小的力（<0.5 N），从而使PMMA均匀分布在骨表面。顶部压板在中立位置可视为水平状态；当其压向半软的PMMA时，PMMA将填充椎骨头端的凹面，并在顶部压板下方形成一个平坦的水平表面。
- 在顶部压板轻压PMMA骨水泥的同时，让样本静置直至PMMA骨水泥完全硬化（根据本研究所用PMMA骨水泥的制造商说明，约需10分钟）。在此期间，将样本保持在生理盐水浴中或频繁喷洒生理盐水，以维持样本的湿润和冷却状态。
- 一旦PMMA骨水泥完全硬化，即可开始压缩测试。使用专用于力学测试数据采集的数字软件，实时将传感器采集的载荷（即力）（N）和位移（即挠度）（mm）数据记录至电子表格中（参见材料表）。
- 在施加约5秒的基线数据采集阶段，预加载力应保持极小（<0.5 N），随后以单一（即单调）、预设的下降速度开始降低顶部压板，启动压缩测试（约1 mm/min）。
- 当观察到载荷（N）显著下降时，停止数据采集，表明材料已发生破坏。
注：制造商说明书中会注明PMMA骨水泥的大致硬化时间。不同类型的PMMA骨水泥其硬化时间可能有所不同，应遵循制造商说明确定等待时间。作为判断PMMA骨水泥是否完全硬化的参考方法，可在处理椎骨样本的同时另取一份相同配比的PMMA骨水泥样品单独放置，并定期检查其是否仍柔软或已完全硬化。若该参考样品已完全硬化，则可推断椎骨上的PMMA也已完全硬化，且不会干扰椎骨+PMMA复合体的结构。在整个PMMA硬化和测试过程中，骨样本必须始终保持充分湿润和冷却状态。仅数分钟的干燥空气暴露即可导致生物力学性能发生变化。部分研究人员使用配备生理盐水浴的压缩测试设备19。本研究中所用压缩测试机未配备生理盐水浴，因此在PMMA硬化及测试期间定期喷洒细雾状生理盐水以维持湿度和温度。
L5 椎体单轴压缩试验的载荷-位移曲线分析
- 将电子表格中的载荷（N）和校正后的位移（mm）数据复制并粘贴到技术绘图与数据分析软件中（参见材料表）。
- 生成一幅以载荷（N）为纵轴、校正后的试样位移（Δx试样，mm）为横轴的图表（图6）。在软件中操作时，首先点击Windows，然后选择New Table，再点击Do it 以创建表格。将原始数据电子表格中的校正位移（mm）和载荷（N）数据复制到新表格中。
- 接下来，通过点击Data，然后选择XY Pair to Waveform ，将校正位移数据指定为X-Wave，载荷数据指定为Y-Wave，以生成表示原始数据的波形图。确保"Number of Points"框中包含正确的数据点数量，为波形命名后，点击Make Waveform。生成波形后，点击Windows，然后选择New Graph，将波形放置在Y轴上，X轴选择"calculated"。
- 使用光标工具在图表上标记用于分析的关键点或区域。步骤5.4–5.8中提到了一些用于计算常见整体骨力学性能的关键点/区域（图6），包括断裂功（N × mm）、最大载荷（N）、刚度（N/mm）、屈服载荷（N）和屈服后位移（mm）。
- 计算断裂功（N × mm）时，将光标（A）置于测试起始点，将另一光标（B）置于材料失效前的瞬间（即在观察到载荷显著下降之前测试过程中达到的最大载荷点）。
注：因此，光标A与B将涵盖从材料开始承受力并发生位移，直至材料失效的整个测试过程。断裂功（N × mm）可测量为曲线下的总面积（即光标A与B之间曲线下的面积）。 - 将测试过程中观测到的最高载荷值定义为最大载荷（N）（即光标B处的载荷）。
- 将材料的刚度（N/mm）计算为线弹性区域的斜率（即光标C与D之间的斜率）。
- 屈服载荷（N）是指载荷-位移曲线偏离线性并进入塑性区域时的载荷，此时材料产生永久形变（即D点处的载荷）。可通过测量光标D处的载荷来计算该值。
- 屈服后位移（mm）是材料延展性的一个指标。将其测量为屈服点与材料失效点之间的位移（即光标D与B之间的位移）。
注：上述参数仅为常报告的整体骨力学性能中的一部分，并非从载荷-位移曲线中可获得的所有整体骨力学性能的完整列表。其他整体骨力学性能参数还包括总位移（mm）、弹性吸收能量（N × mm）、弹性位移（mm）、塑性吸收能量（N × mm）和塑性位移（mm）等。此外，未列出组织水平的骨力学性能；这些性能需要利用特定解剖测量数据（如骨直径）进行数据转换。用于在软件中从载荷-位移曲线提取测量值的示例代码已列于补充文件1中。
结果
通过使用L5椎体加载面包埋法及可转换的三点弯曲/压缩试验机，本逐步操作方案可实现对小鼠腰椎进行压缩力学测试，用于组间比较。共制备了24个采用包埋法处理的小鼠L5椎体样本。然而，在使用旋转工具上的金刚石切割片去除椎体突起的过程中，其中3个样本受损，因此未进行测试。因此，最终通过包埋法成功获得了24个样本中21个样本的力学性能数据。每次测试后均对样本进行肉眼检查，结果表明在所有测试中PMMA帽均未受损。需要说明的是，本研究使用的小鼠属于一项更大规模研究的一部分，旨在确定膳食摄入火麻仁对生长发育期C57BL/6雌性小鼠骨骼的影响。五个常用的整体骨力学性能的描述性统计结果见表1。全部21个样本的载荷-位移曲线见图7。
图 1：将三点弯曲试验机改装为压缩试验机。（A）试验机完整装配，可作为三点弯曲试验机运行，图中显示了位移传感器和载荷传感器的位置（白色箭头所示）。（B）移除横梁后的试验机。（C）在原横梁位置安装了自对中上压板后的试验机。（D）下部支撑梁，其上钻有孔。（E）不锈钢下压板，其上加工有四个螺纹孔，其中一个孔中部分旋入了一颗螺钉；照片中未见的另外两个孔位于对侧。（F）通过四个六角螺钉将下压板固定在下部支撑梁上的装置。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：一个示例系统位移（Δx机器) 与. 分别采用线性（A）、对数（B）、二阶多项式（C）和三阶多项式（D）回归拟合的图谱。 在此示例中，三阶多项式根据 R 值提供了最佳拟合2 数值，其回归结果用作系统位移校正因子。图示为展示回归拟合的示例数据，研究人员需针对各自设备获取相应数据。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 3：小鼠腰椎椎体结构。 在去除 L6 之前的解剖显微镜下观察的小鼠腰椎椎体结构（A），以及去除 L6 后仅保留 L5 附着的状态（B）。随后将移除 L5 并进行压缩测试的准备工作。白色条带为已解剖并去除的椎间盘。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：L5 椎骨的解剖结构。在解剖显微镜下观察的小鼠 L5 椎骨代表性图像，显示颅侧、尾侧、背侧和腹侧视图。椎体的重要尺寸包括高度、前后径（背腹径）和横向宽度，如彩色线条所示。黑色虚线表示切除椎骨突起时大致的切割位置。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：PMMA 骨水泥的硬化过程。 以一个在颅侧终板上置入 PMMA 骨水泥（绿色）的 L5 椎体为例，上压板下降至 PMMA 骨水泥与骨复合体上。待 PMMA 骨水泥完全硬化后，开始进行压缩试验。继续降低上压板，直至观察到材料发生破坏。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：小鼠椎体骨压缩试验的载荷-位移曲线及数据分析。 光标 A 标记压缩试验的起始点。光标 B 标记材料失效点。光标 C 标记线弹性区域的起点，而光标 D 标记其终点（即屈服点）。浅灰色阴影区域为线弹性区域，此区域内若移除载荷，材料可恢复至原始形状。深灰色阴影区域为塑性区域，此区域内材料已发生永久形变，即使移除载荷也无法恢复至原始形状。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：全部21个骨样本的载荷-位移曲线。 骨样本之间的模式存在差异。总体而言，屈服后位移的变异程度最大，其中少数骨样本（n = 5）的屈服后位移相对较小，而其余样本（n = 16）的屈服后位移相对较大。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组别 | 失效功 (N*mm) | 最大载荷 (N) | 刚度 (N/mm) | 屈服载荷 (N) | 屈服后位移 (mm) |
| 对照组 (CON) (n = 7) | 13.43 ± 2.44 A,B | 37.93 ± 3.28 | 109.14 ± 11.86 | 22.68 ± 2.04 | 0.34 ± 0.06 |
| 5HS 组 (n = 8) | 12.12 ± 1.23 A | 33.62 ± 2.43 | 99.70 ± 16.62 | 20.88 ± 2.69 | 0.38 ± 0.08 |
| 15HS 组 (n = 6) | 19.55 ± 2.13 B | 41.82 ± 1.85 | 134.58 ± 19.73 | 28.07 ± 3.20 | 0.51 ± 0.07 |
| 合并组 (n = 21) | 14.68 ± 1.27 | 37.40 ± 1.63 | 121.82 ± 9.43 | 23.54 ± 1.60 | 0.40 ± 0.04 |
表1：使用加载表面制备包埋法获得的常见全骨力学性能指标的代表性数值。 这些数值是通过本研究中详述的所有实验方案获得的，因此代表了采用本文所述方法可得到的结果。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。分组为5-29周龄的C57BL/6雌性小鼠，饲喂含全大麻籽的饮食，浓度分别为0%（CON）、50 g/kg（5%）（5HS）或150 g/kg（15%）（15HS）。对于其中一个参数（断裂功），单因素方差分析显示饮食对其有显著影响（p < 0.05）。经Tukey-Kramer事后检验，具有相同上标字母的数值之间无显著差异（p > 0.05），而具有不同上标字母的数值之间差异显著（p < 0.05）。
补充文件1：获取全骨力学性能的示例代码。 请点击此处下载该文件。
讨论
本研究的目的是描述一种可转换的三点弯曲试验机/压缩试验机的构建方法，以及在进行单轴压缩测试前，采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥包埋法来制备小鼠腰椎椎体样本的步骤。本研究获取并报告了骨样本的描述性统计结果，这些数据将有助于未来研究中的比较分析。本研究分析了部分最常报道的整体骨力学性能指标。然而，值得注意的是，尚有其他一些整体骨及组织水平的力学性能指标未在本研究中进行探讨。
目前尚不清楚采用包埋法制备的小鼠腰椎样本与采用切割法制备的样本在力学性能上如何比较。Schumancher17此前评估了采用两种不同方法制备的大鼠椎体的力学性能，发现采用包埋法制备的椎体其刚度显著更低，屈服位移和屈服应变则高于采用切割法制备的样本。仍需进一步表征以明确在采用两种不同加载面制备方法测定时，小鼠或其他动物模型椎体的力学性能如何比较。考虑到包埋法向样本中添加了材料但保留了终板（终板是体内椎体骨折中的重要结构）in vivo17,27，因此不同方法制备的椎体之间某些参数存在差异是可预期的。向颅端加入骨水泥会增加样本高度，而切割终板则会减少高度，从而改变样本的长径比，进而影响刚度等力学性能。此外，尽管聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）比椎体松质骨更坚硬，但PMMA本身可能发生位移，这种位移的程度仍需进一步表征。另外，尚不清楚采用包埋法或切割法所得结果与基于有限元分析预测的小鼠椎体骨参数之间的符合程度，也不清楚在不同条件下（例如加载速度、不同椎体节段、PMMA成分）结果如何变化。然而，由于所有样本均以相似方式制备，该方法是合适的，并可在单个研究中，于相同制备与测试条件下，为不同处理组之间的比较提供一种简便且经济有效的方式。
关于压缩试验前的样本制备，必须以可重复的方式制备样品。本研究中所述方法的一个可能局限性在于使用旋转工具去除椎体突起。Pendleton 等人已描述了一种去除小鼠腰椎椎体突起的其他方法。19，这可能有助于实现更一致的样本制备。此外，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥的应用也可能导致不一致性。因此，在骨水泥的使用体积、放置位置和硬化时间方面保持操作的一致性至关重要。然而，与切割法相比，包埋法可能为实现样本制备的一致性提供一种更简便的方法，因为样本尺寸小且质地脆弱，难以在所有样本之间 consistently 地获得完全平整且相互平行的切面。未来还需进一步研究以评估采用包埋法所制备样本所得结果的精确性 与切割方法。
如前所述，在对小鼠腰椎进行单轴压缩测试之前，针对用于标本制备的包埋方法，仍需进一步的表征与研究。尽管如此，本研究证明了该方法的可行性，详细描述了所提出的方法，并提供了使用该方法制备的样本所测得参数的描述性统计结果。由于目前尚缺乏可用的方法学，本方案对该领域具有重要价值。此外，该方法可能更接近地模拟了以下机制： 体内 椎体骨折的发生率与其他方法相比17,27该方法还具有克服其他现有报道方法相关技术难题的优势，使单轴压缩测试在骨研究中更具可行性。这一点尤为重要，因为药物、饮食或其他干预措施可能对皮质骨丰富部位（如长骨骨干中段）和松质骨丰富部位（如椎体）产生不同的影响，而目前评估骨力学性能的主要方法仍是三点弯曲试验。13三点弯曲与单轴压缩测试的结合，可通过使用可转换的三点弯曲/压缩测试仪而变得更加简便易行。因此，本研究提出了两种可行方法，旨在使同一研究中对富含皮质骨和富含小梁骨的评估对研究人员更加可及，从而有助于更深入地理解特定处理措施在实验组间对不同类型骨组织的影响。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们衷心感谢科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系在构建三点弯曲试验机并将其改装为可转换的三点弯曲/压缩测试机过程中所付出的重要努力。我们特别感谢机械车间协调员Paul Wallace先生在该设备的设计与建造及改装过程中所做的贡献。科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系Bahaa Ansaf博士和生物系Franziska Sandmeier博士所提供的专业知识和反馈意见也对本项目作出了重要贡献。科罗拉多州立大学普韦布洛分校大麻研究所资助了本实验所属的大型项目，资助款项用于购买实验小鼠、试剂以及部分所用设备。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 120目砂纸 | N/A | N/A | 用于去除尾端椎体软组织及不规则结构 |
| 24位载荷传感器接口 | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | 用于将载荷和位移传感器连接至个人计算机 |
| 基础小鼠饲料 | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | 小鼠饲养所用饲料，不含添加的大麻籽 |
| 带旋转工具的金刚石切割轮 | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | 用于去除椎体突起结构 |
| 位移传感器 | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | 分辨率为0.001 mm、精度为0.00305 mm的位移传感器 |
| 外部可变电压电源 | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | 为压缩测试机提供电力 |
| 雌性C57BL/6小鼠 | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027（品系代码） | 本研究中使用的小鼠模型 |
| 大麻籽 | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | 添加至基础小鼠饲料中的大麻籽 |
| Igor Pro软件（版本8.04） | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | 用于载荷-位移曲线分析的软件 |
| iLoad Mini力传感器 | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | 精度为1.0%的载荷（力）传感器 |
| 等渗（0.9%）生理盐水溶液 | N/A | N/A | 用于保持骨样本的水合状态 |
| Leica EZ4 W体视显微镜 | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | 用于骨组织解剖和椎体突起去除 |
| Microsoft Excel软件 | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | 用于从SensorVue软件中传输数据 |
| PALACOS R骨水泥 | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | 用于包埋加载面的PMMA骨水泥 |
| 个人计算机 | N/A | N/A | 用于数据记录（参见24位载荷传感器接口、SensorVue软件、Microsoft Excel软件）和数据分析（参见Igor Pro软件） |
| SensorVue软件 | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | 用于压缩测试过程中实时数据采集的软件 |
| 小型动物解剖工具包 | N/A | N/A | 解剖剪、镊子、手术刀、刀片、固定针、纱布垫 |
| 不锈钢上压板（自对中）和下压板组件 | N/A | N/A | 由科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系制造 |
| 三点弯曲试验机 | N/A | N/A | 由科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系制造。有关构造细节，请参见Sarper等（2014）的研究 |
参考文献
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