嵌入加载面的小鼠腰椎单轴压缩测试

与年龄相关的骨骼变化被广泛认为是有问题的，因为与这些变化相关的骨折风险增加。人类骨折可导致慢性疼痛、行动不便、长期残疾、死亡风险增加和经济负担¹.为解决与年龄相关的骨骼变化症状而研究的常见疗法包括膳食补充剂、激素治疗和药物 2,3,4,5,6,7,8,9。对人类受试者的这种治疗的初步研究通常使用小动物模型（例如，实验室大鼠和小鼠）进行，这些模型具有在人类骨骼中发现的两种主要类型的骨骼¹⁰。附肢长骨，如肱骨、股骨和胫骨，富含皮质（即致密）骨，而椎骨富含松质骨（即编织骨、海绵骨或小梁骨）⁴。越来越多的人知道，皮质骨（例如，长骨中骨干）和松质骨（例如椎体^{中央）之间的}骨调节机制和信号通路不同2。正因为如此，治疗可能在同一块骨内具有骨特异性甚至位点特异性的差异效应 ^2,3,4。

对物体（例如骨骼）施加力会导致物体发生加速、变形或两者兼而有之，具体取决于物体的边界条件。当骨骼受到约束时，等量级的相反力会抵抗骨骼的加速度，并发生变形。当骨骼持续变形时，会产生称为应力的内阻，其中有两种基本类型:法向力（以拉伸或压缩形式）和剪切力¹⁰。通常，根据施加的力系统¹⁰，会产生基本类型的应力的组合。材料的强度是其承受应力而不失效的能力。随着对材料施加越来越大的力，它最终会发生永久性变形，此时据说它已经从弹性状态（即，如果力被移除，将恢复到其原始形状）转变为塑性状态（即，如果力被移除，将不会恢复到其原始形状）¹¹。从弹性状态到塑性状态的转变点称为屈服点。当对材料施加超过屈服点的更大力时，它越来越多地持续微裂缝（即损坏），直到发生完全裂缝;在这一点上，据说材料已经失败了^11,12。骨骼骨折代表结构水平和组织水平¹⁰ 的失败。例如，椎骨断裂的发生是因为不仅多个小梁在结构水平上失效，而且在组织水平上单个小梁中也存在细胞外基质元素（如胶原蛋白和羟基磷灰石晶体）的失效。

导致材料失效的机械事件可以使用各种测试方法来测量。三点弯曲是测试附肢骨骼长骨力学性能的常用方法。该方法简单且可重复，使其成为许多研究人员首选的生物力学测试方法¹³。通过将十字头梁降低到位于两个下支撑梁上的长骨的中骨干上，该方法专门测试中骨干区域的机械性能，该区域是密集组织的皮质骨。从载荷-位移曲线可以确定拉力对弹性、韧性、破坏力的影响，以及骨材料从弹性到塑性行为的转变，以及其他特性。

在第二种类型的骨骼中，称为小梁状、海绵状、编织状或松质状骨，骨元素形成一系列称为小梁的杆状和梁状，呈现出"海绵状"外观。主要椎体（即中央椎体）富含松质骨，通常是人类与年龄相关的压缩性骨折的部位¹⁴.腰椎（即下背部）椎骨是最大的椎骨，承担身体的大部分重量，是椎体骨折最常见的部位^15,16。椎体的机械性能最好使用单轴压缩测试方法直接评估，因为轴向压缩是体内施加在脊柱上的法向力载荷¹⁷。体内椎体的压缩是由于肌肉和韧带收缩、重力和地面反作用力¹⁸ 而发生的。

由于小动物椎骨体积小、形状不规则和易碎性，因此对小动物椎骨进行体外压缩测试可能很困难。椎体的形状可以估计为具有轻度腹侧倾斜和轻微颅骨凹陷的平行四边形¹⁷。这种形状为实现离体单轴压缩测试带来了挑战，因为如果没有对加载表面进行充分准备，压缩力将仅施加到加载表面的一部分，从而导致"局部接触"^17,19。这可能导致结果不一致和过早失效¹⁹.在体内并非如此，因为载荷表面被椎关节处的椎间盘包围，这使得载荷可以分布在整个颅终板上。椎间盘-颅终板复合体在整个椎体的力和椎体骨折的生物力学中起着重要作用^14,20。虽然压缩测试在生物学领域并不新鲜，但目前的骨骼机械测试方法存在局限性。这些局限性包括缺乏骨力学的预测模型和模拟、独特的几何空间结构，甚至是固有的基于样本的生物变异²¹。更重要的是，该领域面临的挑战是方法之间缺乏标准化，并且文献中总体上缺乏报告的方法²².

文献报道了两种制备啮齿动物腰椎实现单轴压缩试验的方法:切割法和包埋法17,19,23,24,25,26。切割方法要求从椎体上切下椎突、颅端板和尾端板。Pendleton等人¹⁹先前报道了在小鼠腰椎上使用该方法的详细方法。这种方法提出了在尾部和颅端板上实现完美平行切割的挑战，同时又避免了对样品的任何损坏。它还具有去除颅端板的局限性。颅终板包含致密的皮质骨壳，在体内分配椎间盘的负荷方面起着重要作用，并参与体内骨折的骨失效17,20,27。相比之下，包埋方法涉及去除椎突，同时保持椎体的颅端板完好无损。然后通过将少量骨水泥放在椎体的颅端上，使加载表面近似水平。该方法的优点是克服了与切割方法相关的技术挑战，并且由于保留了颅终板，可以更好地模拟体内施加载荷和骨衰竭的机制。这种方法以前在涉及大鼠骨骼单轴压缩测试的研究中已有记录。然而，据我们所知，它以前没有在较小的小鼠腰椎17,25,26的背景下被记录下来。Chachra等人²⁵之前曾详细介绍过该方法，最初使用夹在两块板之间的骨标本，每块板都有一个圆柱形空腔，然后用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）填充。同一研究小组后来改进了一端轻轻打磨（尾部），另一端添加一小块骨水泥（颅骨）^的方法26。这种方法是对以前方法的改进，因为它最大限度地减少了压板之间的材料，并且是本文的重点。尽管单轴椎体压迫试验存在挑战，但这种方法可以提供有关拟议疗法对骨骼影响的宝贵信息，尤其是在与三点弯曲配对时。

在这里，介绍了使用可转换的三点弯曲/压缩试验机，以便使用一台机器轻松测试长骨和椎体。此外，还介绍了使用嵌入方法实现小鼠腰椎单轴受压测试的方法。本研究是一项更大规模研究的一部分，该研究旨在调查膳食大麻籽补充剂对年轻、生长中的雌性 C57BL/6 小鼠骨骼骨特性的影响 ^5,6。三点弯曲测试仪最初由科罗拉多州立大学普韦布洛分校工程系的教职员工和学生建造，并由我们的研究小组用于长骨 [大鼠股骨和胫骨⁷ 和小鼠肱骨、股骨和胫骨^{5、6、8、9}].然而，尚未探索其在小鼠椎体压缩试验中的修改和应用。三点折弯机的设计和构造前面已经描述过⁷。本报告将重点介绍用于修改机器以进行压缩测试和校正系统位移的方法。其次，介绍了小鼠椎体负荷面准备的嵌入方法，以及单轴压缩试验方法和负荷位移数据分析;

所有实验和方案均按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得科罗拉多州立大学-普韦布洛机构动物护理和使用委员会的批准（协议编号:000-000A-021）。动物护理的详细程序先前已描述^5,6。这些小鼠是在三周大时获得的，这是一项更广泛的研究的一部分，该研究旨在研究补充大麻籽的饮食对年轻，生长中的雌性C57BL / 6小鼠的影响（见材料表）。从 5 到 29 周龄，小鼠以三种饮食之一饲养:对照（0% 大麻籽）、50 g/kg （5%） 大麻籽或 150 g/kg （15%） 大麻籽，每组 8 只小鼠 ^5,6。在整个研究过程中，小鼠可以随意获取各自的饮食和水，成对饲养在聚碳酸酯笼中，并保持12小时的光照:12小时黑暗循环（从06:00到18:00开灯）。每周评估小鼠的体重和健康状况，所有小鼠都成功完成了研究，没有出现任何不良健康状况。在29周龄时，使用异氟醚气体对小鼠进行深度麻醉，并通过宫颈脱位实施安乐死^5,6。在从胸骨到尾部的腹面做一个中线切口，并从尸体上取出所有胸内、腹膜和腹膜后器官。将内脏的尸体保存在-70°C的0.9%氯化钠溶液中，直到大约一年后进行骨解剖以进行椎骨测试。

1、三点折弯机改压试验机

1. 拧下连接到三点折弯机⁷上的负载传感器的十字头梁（见材料表）（图1A，B）。
2. 将自对准顶板拧到负载传感器上（参见 材料表），螺纹与十字头梁相同（图 1C）。
3. 在每个下部支架上钻两个水平孔，稍后将连接底部压板（图 1D）。
4. 将螺纹敲入不锈钢底板的两侧，以与下部支架上的钻孔对齐（图 1E）。
5. 使用螺纹六角螺钉将底板固定到两个下部支架上并拧紧直至固定（图 1F）。
   注意: 六角螺钉的螺纹必须与下支架和顶部/底部压板上的螺纹孔相匹配。使用自对准顶板可能有助于实现顶板和负载表面之间的均匀接触，但考虑到椎体颅端的凹陷，这还不够。需要使用装载面处理方法进行进一步制备。在为小动物骨骼制造压缩试验机时，小动物骨骼比许多工业/工程材料更小、更弱，必须考虑负载传感器的负载能力和负载框架的尺寸。此外，应定期清洁和润滑机器，以确保准确的结果和平稳运行。

2.压缩试验机位移校正

1. 在顶板和底板之间没有测试材料的情况下，将顶板降低到底板上，直到轻度接触（~0.3-0.5 N 预紧力）。
2. 以恒定的下降速度（~1 mm/min）打开机器以开始压缩测试。使用数字数据采集软件（见 材料表）收集载荷 （N） 和位移 （mm） 测量值，用于机械测试的数据收集。
   注意:由于顶部和底部压板之间没有材料，因此观察到的所有位移都将是由于机器（Δx_机器）（框架、称重传感器、压板、联轴器等）的位移造成的。
3. 继续以恒定（即单调）速度将顶部压板降低到底部压板上，直到达到高于从所有骨样本中获得的力。
4. 重复步骤 2.1 到 2.3，总共 3 次。
5. 绘制系统位移（Δx_机器，mm） 与施加的载荷（力，N）。
6. 拟合数据的最佳拟合回归线（图 2A-D）。
7. 在包含骨压迫测试数据的电子表格中，使用回归分析提供的方程来确定影响小鼠腰椎压迫测试数据点的记录位移（Δx_总记录）的机器位移量（Δx_机器）。
   注意:例如，考虑一个数据点，其中施加了 18 N 的力，并记录了 2.730 毫米的位移（_记录的总位移为 Δx）。根据示例三阶多项式回归方程（图 2D）[Δx_机器 = （4 × 10-7 x 施加的载荷³） - （8 × ^10-5 x 施加的载荷²） + （0.0044 x 施加的载荷）]，记录的 0.056 mm 位移是由于机器位移（Δx_机器）。
   _记录的 Δx 总量 ₌ Δx_机器 + Δx_试样
8. 更正数据点的记录位移。
   注意:例如，请考虑上面的示例。如果记录 2.730 mm 的位移（_记录的 Δx 总位移）和机器位移_（Δx_机器）占总位移的 0.056 mm，则感兴趣的标本（即骨骼）所经历的位移（Δx_试样）为 2.664 mm。 因此，2.664 mm 是椎骨经历的实际位移（Δx_试样），是用于载荷-位移曲线分析的值。
   Δx_试样 = Δx_{总记录 -} Δx_机器
9. 对每个标本（骨骼）收集的每个数据点重复步骤2.7-2.8。
   注意:此步骤很重要，因为在压缩测试过程中，观察到的位移不仅是由于试样的位移，而且观察到的位移是机器位移（Δx_机器）（例如，框架、称重传感器、压板、联轴器等的压缩/位移）和试样（Δx_试样).因此，对于发生相对少量位移的试样，例如小动物（例如小鼠）的试样，系统位移（Δx_机器）会导致较大的误差。Kalidindi^{和 Abusafieh 28} 之前报道了此处描述的校正系统位移的程序，除了此处描述的方法外，他们还详细介绍了另外两种方法。一些研究人员已经注意到使用不止一种方法来确定系统位移¹⁷。当对每台机器施加负载时，它可能会显示独特的模式和系统位移程度。因此，必须为每台机器确定系统位移校正系数，并且任何两台机器之间的系数都不相同。与椎骨的压缩测试相比，在测量系统位移时不会观察到较大的力减少，因为顶部和底部板之间没有材料。

3.从小鼠尸体中解剖^第 5腰椎（L5）

1. 在室温下解冻冷冻小鼠尸体，注意通过定期施用0.9%NaCl的等渗溶液来保持软组织和骨骼的水分。
2. 在靠近尾巴根部的背中线的皮肤上做一个小切口（<0.5厘米），然后将切口延伸到每个后肢上，轻轻拉动以将毛皮从尾巴底部去除到动物的头部。
3. 切掉腹壁肌肉组织，直到脊柱清晰可见。
4. 在解剖显微镜下，观察两个骶髂关节和骶骨的颅端。
5. 使用剃须刀片或手术刀进行细切，将最后一个腰椎 （L6） 与骶骨的颅端分开。
6. 再次，在椎间隙之间切割，从脊柱中取出 L6 和 L5，留出 L5 进行分析（图 3）。
7. 在解剖显微镜下检查椎骨，并从骨骼中取出所有软组织，包括椎间盘，主要使用纱布垫，必要时用镊子轻轻取出。
   注意:在本研究中，L5 被选为感兴趣的椎骨，但可以选择其他腰椎进行压缩测试。

4. 使用PMMA骨水泥包埋法制备L5椎体承压面进行单轴压缩试验

1. 使用连接到旋转工具的金刚石切割轮（参见 材料表），在每个椎弓根处进行切割以去除横突和棘突（图 4）。如果留在中心，椎突可能导致与突起本身的上/下压板局部接触，而不是在整个中心分布负荷。
2. 使用 120 粒度的细砂纸轻轻打磨椎骨的尾端（参见 材料表），以去除所有椎间盘、软组织和不规则处。
3. 用永久性记号笔标记打磨过的尾端，以便日后识别。
4. 根据制造商的说明混合PMMA骨水泥（见 材料表）。
5. 在PMMA骨水泥仍处于半软状态的情况下，将少量骨水泥朝上放在椎骨的颅骨（无标记）端，确保在椎骨位于盐水浴中时覆盖整个表面，以保持骨样本的水分和凉爽。
6. 在PMMA仍处于半软状态的情况下，将椎骨放在底板上，尾部（标记）面朝下（图5）。
7. 打开机器以啮合驱动齿轮，然后慢慢将顶部压板降低到椎骨 + PMMA 骨水泥复合物上，直到与骨水泥接触并施加最小的力 （<0.5 N） 以将 PMMA 均匀分布在骨表面上。处于中立位置的顶板可以估计为水平，当压在半软 PMMA 上时，将导致 PMMA 填充椎骨颅端的凹陷，并在顶板下方形成平坦的水平表面。
8. 将顶部压板轻轻按压PMMA骨水泥，让样品不受干扰地静置，直到PMMA骨水泥完全硬化（根据制造商对本研究中使用的PMMA骨水泥的说明~10分钟）。在此期间，将样品保存在盐水浴中或经常用生理盐水喷洒，以保持样品水分和凉爽。
9. 一旦PMMA骨水泥完全硬化，就可以开始压缩测试。使用专为机械测试数据收集而设计的数字软件，将传感器的载荷（即力）（N）和位移（即挠度）（mm）数据实时收集到电子表格中（参见 材料表）。
10. 在基线数据收集 5 秒后，以 <0.5 N 的最小预紧力施加，开始以单个（即单调）预定的下降速度将顶部压板降低到样品上，以开始压缩测试 （~1 mm/min）。
11. 一旦观察到载荷 （N） 大幅降低，表明材料失效，就停止收集数据。
    注意: 制造商说明将指定 PMMA 骨水泥的大致硬化时间。PMMA骨水泥的硬化时间可能因所使用的PMMA骨水泥类型而异。按照制造商的说明确定 PMMA 硬化的等待时间。然而，作为PMMA骨水泥已经完全硬化的指标，可以与将放置在椎骨上的样品同时混合额外的PMMA骨水泥样品，但放在一边并检查它是否仍然柔软或完全硬化。如果完全硬化，这可能表明骨骼上的PMMA也完全硬化，而不会干扰骨骼+PMMA复合物。在整个PMMA硬化和测试期间，骨骼样本必须保持良好的水分和冷却。短短几分钟暴露在干燥的空气中就会导致生物力学特性的变化。一些研究人员使用配备盐水浴¹⁹的压缩试验机。在本研究中，压缩试验机没有盐水浴。取而代之的是，在整个PMMA硬化期和测试期间定期使用细小的盐水雾。

5. L5椎单轴受压试验载荷位移曲线分析

1. 将电子表格中的载荷 （N） 和校正位移 （mm） 数据复制并粘贴到技术图形和数据分析软件中（参见 材料表）。
2. 生成一个图形，其中载荷 （N） 位于 y 轴上，校正试样位移（Δx_试样，mm）位于 x 轴上（图 6）。在软件中执行此操作，首先单击 Windows、 新建表，然后单击 Do it 以制作表。将原始数据电子表格中的校正位移 （mm） 和载荷 （N） 数据复制到新表中。
3. 接下来，通过单击 "数据"生成一个波形来表示原始数据，然后单击" XY 配对到波形" ，并为 X-Wave 选择校正的位移数据，并为 Y 波选择加载数据。确保"点数"框中的数据点数正确，命名波形，然后单击 "生成波形"。制作波形后，单击 "Windows"生成图形，然后单击" 新建图形"，然后将波形放在 Y 轴上，并在 X 轴上"计算"。
4. 使用光标工具在图形上标记感兴趣的点/区域进行分析。步骤 5.4-5.8（图 6）中提到了计算常见全骨机械性能的一些感兴趣的点/区域，包括 从工作到失效 （N x mm）、 最大载荷 （N）、 刚度 （N/mm）、 屈服载荷 （N） 和 屈服后位移 （mm）。
5. 为了计算 工作到失效 （N x mm），在测试开始时放置一个光标 （A），在材料失效之前放置一个光标 （B）（即，在观察到负载大幅降低之前在测试期间达到的最大负载处）。
   注意:因此，光标 A-B 将从材料开始承受力并发生位移到材料失效的点的整个测试中括起来。 从工作到失败 （N x mm） 可以测量为曲线下方的总面积（即光标 A 和 B 之间的曲线下方面积）。
6. 计算 最大载荷 （N） 作为在测试期间观察到的载荷的最高值（即光标 B 处的载荷）。
7. 将材料的 刚度 （N/mm） 计算为线弹性区域的斜率（即光标 C 和 D 之间的斜率）。
8. 屈服载荷 （N） 是载荷-位移曲线偏离线性并进入塑性区域的载荷，从而维持永久变形（即 D 点的载荷）。通过测量光标 D 处的载荷来计算。
9. 屈服后位移 （mm） 是材料延展性的指标。将其测量为屈服点和材料失效点之间的位移（即光标 D 和 B 之间的位移）。
   注意:上面列出的参数只是报告的一些常见的全骨机械性能。它不是可以从载荷-位移曲线中获得的所有全骨机械性能的完整列表。其他全骨力学性能参数包括总位移 （mm）、吸收的弹性能 （N x mm）、弹性位移 （mm）、吸收的塑性能量 （N x mm） 和塑性位移 （mm） 等。此外，未列出组织水平的骨骼力学特性;这些需要使用特定的解剖测量值（例如骨直径）进行数据转换。 补充文件 1 中列出了从软件中的载荷-位移曲线进行测量的示例代码。

通过这种使用嵌入 L5 负载表面和可转换三点弯曲机/压缩试验机的分步协议，可以对小鼠腰椎进行压缩测试以进行组间比较。采用包埋法制备了24块小鼠L5椎骨。然而，其中三个样品在使用旋转工具上的金刚石切割轮去除椎体过程时被损坏，因此没有进行测试。鉴于此，使用嵌入方法从24个样品中的21个样品中成功获得了列出的机械性能。每次测试后都对试样进行目视检查，PMMA盖在任何测试中均未损坏。如前所述，本研究中使用的小鼠是一项更大规模研究的一部分，该研究旨在确定膳食大麻籽对年轻和生长中的C57BL / 6雌性小鼠骨骼的影响。 表1提供了五种常见报道的全骨机械特性的描述性统计。 图7提供了所有21个样品的载荷-位移曲线。

图1:三点折弯机到压缩试验机的转换。 （A） 机器设备齐全，可作为三点折弯机运行，并标明位移传感器和负载传感器（白色箭头）。（二）机器拆下横梁后。（C） 将自对准顶板放置在先前放置十字头梁的位置后的机器。（D） 下部支撑梁上钻有孔。（E） 不锈钢底板，上面有四个螺纹孔，一个螺钉部分拧入其中一个孔中。照片中没有看到的另外两个洞在对面。（F） 下部支撑梁，底部压板由四个六角螺钉固定。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:采用线性 （A）、对数 （B）、二阶多项式 （C） 和三阶多项式 （D） 回归拟合的示例系统位移（Δx机器） 与荷载图。 在此示例中，三阶多项式提供了每个 R2 值的最佳拟合，其回归用作系统位移校正因子。图像代表用于演示回归拟合的示例数据，需要由研究人员获得单个机器的示例数据。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:小鼠腰椎柱。 在L6被移除之前（A）和L6被移除后，在L5被附着（B）之前，在解剖显微镜下的小鼠腰椎柱。随后将移除 L5 并准备进行压缩测试。白色条带是被解剖和切除的椎间盘。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:L5 椎骨的解剖结构。 在解剖显微镜下，颅、尾、背和腹侧视图的代表性小鼠 L5 椎骨。椎体的重要尺寸包括高度、背腹宽度和侧向宽度，如彩色线所示。黑色虚线大致显示了切除椎突的位置。 请点击这里查看此图的较大版本.

图5:PMMA骨水泥的硬化期。 一个示例L5椎骨，PMMA骨水泥（绿色）放置在颅骨终板上，顶部板降低到PMMA骨水泥+骨复合物上。一旦PMMA骨水泥完全硬化，压缩测试将开始。顶部压板将进一步降低，直到观察到材料失效。 请点击这里查看此图的较大版本.

图6:小鼠椎骨按压试验载荷位移曲线及数据分析。 光标 A 标记压缩测试的开始。光标 B 标记材料失效点。游标 C 标记线性弹性区域的起点，而游标 D 标记终点（即屈服点）。浅灰色阴影区域是线性弹性区域，如果移除载荷，材料将恢复到其原始形状。深灰色阴影区域是塑性区域，材料已发生永久性变形，如果移除负载，则不会恢复到其原始形状。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 7:所有 21 个骨样本的载荷-位移曲线。 骨头之间的图案各不相同。一般来说，最大的变异性是屈服后位移，少数（n = 5）骨骼的 屈服后位移 相对较小，而其他骨骼（n = 16）的 屈服后位移相对较大。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:使用加载表面处理嵌入方法获得的常见报告的全骨机械性能的代表性值。 使用本研究中详述的所有方案获得值。因此，这些值表示可以使用此处描述的方法获得的值。值是SEM±均值。 组代表C57BL / 6雌性小鼠，从5-29周龄喂食富含浓度为0%（CON），50g/kg（5%）（5HS）或150g/kg（15%）（15HS）的全大麻籽的饮食。对于其中一个参数（从工作到失败），饮食似乎影响了单因素方差分析的值（p < 0.05）。根据 Tukey-Kramer 事后分析，共享相同字母上标的值没有显著差异 （p > 0.05），而具有不同字母上标的值显着差异 （p < 0.05）。

补充文件 1:获得全骨力学性能的示例代码。请点击此处下载此文件。

作者声明没有利益冲突。