基于脂质UNet-机器学习的脂质沉积物使用iPSC衍生的视网膜色素上皮表征和定量脂质沉积物的方法

Summary

影响眼睛视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。已经开发了几种疾病模型和软件应用程序LipidUNet来研究疾病的机制以及潜在的治疗干预措施。

Abstract

视网膜色素上皮（RPE）是位于眼睛后部的单层六角形细胞。它为光感受器和脉络膜毛细血管提供营养和支持，对感光器外段（POS）进行吞噬作用，并以极化方式分泌细胞因子以维持外视网膜的稳态。由突变、衰老和环境因素引起的功能失调的 RPE 会导致其他视网膜层退化并导致视力丧失。退化 RPE 的一个标志性表型特征是细胞内和亚细胞内富含脂质的沉积物。这些沉积物是不同视网膜退行性疾病的共同表型。为了在 体外重现单基因视网膜变性的脂质沉积表型，从患者的成纤维细胞中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE（iRPE）。Stargardt和迟发性视网膜变性（L-ORD）患者产生的细胞系用POS喂养7天以复制RPE生理功能，这在这些疾病中引起了POS吞噬诱导的病理。为了生成年龄相关性黄斑变性（AMD）的模型，这是一种与替代补体激活相关的多基因疾病，iRPE受到替代补体过敏毒素的挑战。使用尼罗河红、硼-二吡咯甲烷（BODIPY）和载脂蛋白E（APOE）对细胞内和亚细胞脂质沉积物进行了表征。为了量化脂质沉积物的密度，开发了一种基于机器学习的软件LipidUNet。该软件在培养表面上对iRPE的最大强度投影图像进行了训练。将来，它将被训练来分析三维（3D）图像并量化脂滴的体积。LipidUNet软件将成为发现减少疾病模型中脂质积累的药物的宝贵资源。

Introduction

视网膜色素上皮（RPE）是位于眼睛后部与视网膜感光器相邻的单层细胞。RPE通过为光感受器提供代谢和结构支持，在维持正常视力方面起着至关重要的作用。健康的RPE细胞具有独特的六边形形态。它们通过紧密的连接连接，这使得RPE能够充当位于其基底侧的绒毛细血管和位于顶端的光感受器之间的屏障。为了维持视网膜生态系统，RPE 将关键代谢物（例如葡萄糖）运送到光感受器，以最大限度地减少 RPE 中的葡萄糖消耗¹。由于这种限制，RPE依赖于其他代谢物来维持其代谢需求，包括脂肪酸，RPE通过β氧化将其转化为酮²。鉴于 RPE 倾向于利用脂肪酸（可能从感光器外段 （POS） 消化中回收）作为能量来源，RPE 中脂质加工途径的有害变化通常会导致或与单基因和多基因退行性视网膜疾病有关³。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致RPE变性的多基因退行性眼病，也与RPE单层中的异常自噬和脂质代谢有关。功能失调的RPE单层无法处理POS和执行其他关键功能，导致细胞外（亚RPE）沉积，称为基础线性沉积物（BLinD），位于RPE和Bruch膜之间 - 这是AMD病理学的标志。BLinD的主要成分包括脂蛋白，其中最丰富的是载脂蛋白E（APOE）⁴。BLinD薄层的积累会导致软玻璃膜疣，这被认为是AMD^5，6的临床症状。

一些小组已经表明，导致RPE功能障碍的干细胞衍生体外疾病模型具有亚RPE脂质积累⁷，^8，9。Hallam等人（2017）由于CFH基因的多态性，从AMD高风险患者中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE（iRPE）。iRPE显示玻璃膜疣积累，如APOE为标志，高风险RPE积累的沉积物大于低风险患者产生的iRPE10。

为了创建一个体 外 模型来概括AMD的细胞特征，如脂滴和玻璃膜疣沉积，使用先前发表的发育指导方案¹¹建立了从患者血液样本生成的iRPE系。iRPE接受补体感受能力人血清（CC-HS），这是一种含有过敏毒素的溶液，模仿AMD的一个可能原因:增加替代补体信号传导⁸。使用常用的脂质和脂蛋白标记物APOE，尼罗河红和BODIPY测量产生的脂质沉积物的细胞和亚细胞沉积。通过这些标记物，显示通过CC-HS激活的补体信号传导加剧了iRPE细胞中的脂质积累⁸。

为了开发单基因视网膜退行性疾病的疾病模型，从Stargardt病患者开发了iRPE系，Stargardt病是一种由RPE中 ABCA4 基因突变引起的疾病。先前已经表明，当 ABCA4 被敲除时，A2E脂褐素（一种已知含有高水平磷脂和光依赖性脂质过氧化产物的细胞内沉积物）积聚在RPE¹²内。 ABCA4 敲除线与患者线一起开发，并且两者都经过 POS 喂养。Stargardt iRPE显示出POS吞噬作用诱导的病理学，表现出通过BODIPY染色定量的脂质积累增加。来源于 ABCA4 KO iPSCs的RPE进行CC-HS处理;BODIPY信号的定量显示Stargardt病模型中脂质处理存在缺陷⁹。

鉴于这些疾病的流行和对有效疗法的需求，以及上述相关疾病模型，有必要建立强有力的方法来量化潜在治疗的疗效。为了以客观、自动化和标准化的方式量化脂质沉积，我们创建了一个基于机器学习的软件 LipidUNet，以便与掩模分析工具配合使用时，可以使用常见的标记尼罗河红、BODIPY 和 APOE 快速有效地识别脂质沉积。然后可以分析和以图形方式分析和显示使用该分析管道获得的汇总统计数据，从而可以轻松比较治疗条件。该协议的原理图如图 1所示。

图 1:方案示意图:RPE 细胞在 96 孔板上生长，并用活性人血清或纯化的牛外段攻击，以在体外模拟不同类型的视网膜变性。将RPE细胞固定并染色，以观察尼罗河红，BODIPY和APOE的脂蛋白沉积物。共聚焦显微镜用于获取荧光标记的脂质颗粒的Z堆栈，随后将其处理成2D最大强度投影。训练机器学习算法来识别和正确分割脂蛋白颗粒。生成包含颗粒计数和各种形状指标的汇总表，可用于后续绘图和统计分析。请点击此处查看此图的大图。

Protocol

所有方案步骤均遵循NIH人类研究伦理委员会制定的指导方针。根据美国政府的45 CFR 46指南，干细胞工作和患者样本采集已获得NIH人类研究保护办公室（OHRP）下属的联合神经科学机构审查委员会（CNS IRB）的批准。根据赫尔辛基宣言规定的标准，使用CNS IRB批准的同意书收集患者样本，协议号为NCT01432847（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1）。

1. iRPE 生成

1. 按照 Sharma 等人发表的方案从患者血液来源的 iPSC 中生成 iRPE，2022¹¹ （图 2 和 图 3）。

图 2:iRPE 分化和成熟的示意图。 为了产生iRPE，遵循既定的分化方案，并使细胞成熟5周。由此产生的细胞培养物充当体 外 模型，可以通过各种治疗方法进行操作，以模拟AMD和Stargardt病等疾病的RPE功能障碍。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:成功和不成功的 RPE 分化和成熟的代表性图像。 在 iRPE 方案的第 42 天显示了 TJP1 RPE 10 倍放大倍率下的两个明场图像。（A）成功的分化和成熟将显示出与色素沉着和多边形形态的融合RPE。（B）不成功的分化和成熟将显示死亡细胞的簇，如图所示。 请点击此处查看此图的大图。

2. RPE 维护培养基 （RPE-MM） 制备

1. 将N 2补充剂在4°C下解冻过夜。在室温（RT）下解冻所有其他试剂。
2. 在无菌条件下，按照Sharma等人制定的方案，按照Sharma等人制定的方案，以列出的稀释因子加入 表1 中列出的试剂¹¹¹。
3. 充分混合培养基并使用0.22μm过滤装置进行过滤。
   注意:如果储存在4°C，培养基适合在2周内使用。

3. 96孔板播种

1. 在室温下解冻等分试样玻连蛋白3-5分钟或直到冰完全融化。
2. 用1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）稀释玻连蛋白，以使用1:200稀释度（玻连蛋白:DPBS）获得所需的工作溶液。对于 96 孔板，在每个孔中涂上 200 μL 工作溶液。
3. 将解冻的ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）与RPE-MM以1:1000稀释度混合，以达到10μM的最终浓度。这是RPE细胞的电镀介质。
4. 使用自动细胞解冻系统解冻iRPE小瓶，并将iRPE细胞悬液转移到50 mL管中。
5. 用电镀介质以1:10稀释度稀释细胞悬液。将试管以400× g 离心5分钟。
6. 小心吸出上清液并将细胞重悬于10mL电镀介质中。
7. 将 400 μL 电镀介质与 100 μL 重悬细胞溶液混合以进行细胞计数。使用该等分试样使用细胞活力计数器确定细胞悬液的活细胞浓度。
8. 用电镀培养基稀释细胞悬液至终浓度为60，000个细胞/ mL。
9. 从 96 孔板中完全吸出玻连蛋白包衣溶液，并将 200 μL 细胞悬液分配到每个孔中。将有大约 12，000 个细胞/孔或 ~200 个细胞/mm²。
10. 将接种的细胞板在37°C和5%CO₂下孵育48小时。48小时后，将培养基更换为RPE-MM，无需补充ROCK抑制剂。在 5 周的成熟期内，每 2-3 天更换一次培养基。

4. 体外 疾病模型

1. 补体感受态人血清 （CC-HS） 治疗
   1. 将人补体感受态血清在 4°C 下解冻过夜。
   2. 制备 CC-HS 并补体无功能人血清 （CI-HS） 培养基。
      1. 要制备 5% CC-HS 培养基，将解冻的补体感受态人血清与 RPE-MM 以 1:20 稀释度混合。使用前通过0.22μm介质过滤器过滤溶液。
      2. 为了制备5%补体无功能人血清（CI-HS）培养基，首先在57°C水浴中加热灭活CC-HS30分钟，然后以1:20稀释度与培养基混合。使用前通过0.22μm介质过滤器过滤溶液。
2. 1. 4. 
         
      8. 
         
         
   2. 2. 
         

1. 1. 
      
   2. 
      
   4. 
      
2. 3. 
      
3. 6. 
      

1. 
   

2. 
   
6. 
   

Results

该协议提供了一种工作流程来鉴定尼罗河红，BODIPY和APOE染色的脂质沉积物。开发的软件可以自动识别和量化脂质沉积，并在优化概述的方案时表现最佳。其中包括成功分化的RPE（图3A）和低分化的RPE（图3B）的例子，因为细胞模型的质量极大地影响了正确图像分割的质量。

协议中描述的三个标记中的两个，尼罗红和BODIPY，被鉴定为小圆点，在荧光图像中明显明亮（图5和图6）。来自协议的"阳性"图像将是这些不同沉积物的适当识别（图5A-D和图5E-H）。由于染色弱（图6A-C和图6D-F）或由于高背景强度（图6G-I），"阴性"结果将显示不正确的图像分割，将背景荧光误认为沉积物。

APOE矿床具有各种大小和形状，看起来更椭圆形或不规则，而不是尼罗河红和BODIPY的圆形矿床。这些沉积物的点状性也较少，并且由于样品透化性的变化，沉积物之间的信号强度可能会有所不同。正确的识别将识别每个沉积物，包括那些饱和度较低的沉积物（图5I-L），而不正确的分割不会发现这些沉积物（图6J-L）。因此，优化染色和成像方法以避免剧烈变化非常重要。一种方法是在免疫染色时仔细注意样品透化步骤。为了优化荧光信号，可以在APOE固定和免疫染色之前裂解细胞，从而使APOE沉积物均匀饱和和更好地分割。

还提供了在96孔板以外的培养平台上成熟的细胞的分段图像。LipidUNet软件在跨孔培养的细胞图像上运行，虽然脂质沉积物被阈值化，但跨孔膜中的孔也被阈值化（图6M-O）。由于形状和大小的相似性，当前形式的LipidUNet软件将不分青红皂白地掩盖脂质沉积物和跨孔隙。

图5:代表性结果。 （A，E，I） 96孔电镀RPE用Hoechst核染色（蓝色）和尼罗河红（品红色），BODIPY（绿色）或APOE（橙色）染色，并且是Z堆栈的最大强度投影。（乙、女、日）图像处理后LipidUNet软件的灰度输入图像。（中，由LipidUNet生成的掩码，其中所有沉积物都被正确识别。（深，高，中）每个掩蔽粒子的轮廓都有编号。这些标签允许将图像中的每个粒子连接到带有原始数据的传播中的条目。（A-D）显示尼罗河红染色，尽管信号较弱，但软件仍能够准确识别背景中的沉积物。（E-H）在BODIPY信号和背景之间显示出强烈的对比度，这是理想的。LipidUNet可以正确识别图像中的每个沉积物。（I-L）显示强烈的APOE信号，并表示该染色通常看到的信号饱和度的变化。尽管如此，图像分割能够识别每个APOE矿床的边界。请点击此处查看此图的大图。

图 6:次优结果。 （A，D，G，J，M） 96 孔镀 RPE 用 Hoechst 核染色（蓝色）和尼罗红（品红色）、BODIPY（绿色）或 APOE（橙色）染色，是 Z 堆栈的最大强度投影。（B，E，H，K，N）图像处理后LipidUNet软件的灰度输入图像。（C，F，I，L，O）由 LipidUNet 生成的不正确的掩码。红色圆圈表示软件错误地识别了脂质沉积物的位置。（A-C） 尼罗河红处理不正确，因为软件已将背景染色识别为沉积物。当图像中背景较高但脂质沉积很少时，这种情况可能会更频繁地发生。显示了两个BODIPY染色的例子:由于（D-F）弱的BODIPY染色引起的图像质量差和（G - I）具有高背景的强BODIPY信号。在这两种情况下，软件都无法将小的圆形脂质沉积物与围绕细胞核的背景圆形环区分开来。虽然应优化染色和成像以避免这些错误，但最新版本的 LipidUNet 针对这些图像进行了很大改进。（J-L）不正确的 APOE 分段。由于沉积物的大小和信号饱和度变化更大，因此该软件难以识别某些沉积物。（周一至奥）将RPE播种到Transwell上并用尼罗河红染色。这里显示了Z堆栈的一部分，其中包含尼罗河红脂质沉积物和跨孔孔。该软件无法区分两者，如包含跨孔的红色圆圈和指向尼罗河红矿床的绿色箭头所示。请点击此处查看此图的大图。

图 7:遮罩工具比较 。 （A，B，C）具有可变脂质沉积量的96孔电镀RPE用尼罗红（红色）鉴定。使用三种不同的常见遮罩方法（查找最大值、最大熵和仁义熵）对图像进行遮罩，并与 LipidUNet 生成的掩码进行比较。原始图像伴随着脂质沉积物的手动计数，而掩模显示每种分割方法的预测计数。使用以下公式计算每种分割方法的平均错误率:mean[（|预测计数 - 手动计数|/手动计数） x 100]。与其他掩蔽方法相比，LipidUNet生成的掩模更准确地识别具有可变沉积的图像中的脂质沉积物（平均错误率:23%LipidUnet，1164%找到最大值，851%最大熵，203%仁义熵）。 请点击此处查看此图的大图。

元件	猫号	股票集合	最终会议	毫升
MEM 阿尔法	12571-063	那		500
N2补充剂	17502-048	那	1%	5
热灭活FBS	SH30071.03	那	5%	25
NMEM NEAA	11140-050	10毫米	0.01毫米	5
丙酮酸钠	11360-070	100毫米	1毫米	5
青霉素-链霉素	15140-122	10000u/毫升	100铌/毫升	5
牛磺酸	T4571	50毫克/毫升	250微克/毫升	2.5
氢化可的松	H6909	18.1毫克/升	20微克/升	0.553
T3	T5516	20微克/升	0.013微克/升	0.33
总体积，毫升				548.383

表1:RPE-MM试剂组成。 RPE-MM的试剂和最佳浓度列表。

Discussion

该协议提供了一种有效标记，成像和量化退行性眼病单基因和多基因 体外 疾病模型中脂质沉积的方法。基于人工智能的软件LipidUNet可应用于三种常见的脂质标志物，即APOE、Nile Red和BODIPY，并提供一种快速、自动的分析方法，使定量成为标准和无偏。

LipidUNet的主要局限性在于AI的训练数据集仅限于在96孔板中培养的细胞的40倍放大图像。作为训练图像集的结果，当前形式的LipidUNet仅限于分析40倍放大图像。该软件可用于分析除96孔板外在其他培养表面上培养的细胞的40倍图像，但应注意检查生成的输出掩模，以验证软件的准确阈值。需要更多的图像集（在不同的放大倍率下）来扩大它可以分析的样品/图像的范围。

该协议有几个关键步骤。在脂质标记步骤中，用户应确认他们选择的标记化合物（BODIPY，APOE，Nile Red）已有效标记其样品。成熟的RPE细胞通常色素沉着，这会损害抗体免疫染色的荧光信号。当荧光信号较弱或背景染色过多时，LipidUNet无法准确识别脂滴。出于类似的原因，必须使用正确选择协议自动成像步骤的采集设置。如果采集的图像质量较差，LipidUNet将难以正确屏蔽图像，因此定量将不准确（图6A-L）。最后，图像的后处理是一个重要的步骤，因为LipidUNet对软件的工作有特定的要求。

与使用手动阈值的脂质分析工作流程或斐济等软件中涉及自动阈值分析的技术相比，LipidUNet 在具有可变脂质沉积的图像中提供了无偏且可靠的分割，这反映在脂质颗粒鉴定中的小错误率（图 7）。该软件允许用户输入额外的训练图像，允许分析超出使用40倍放大镜的图像集，甚至是使用不同脂质标志物的图像集，如协议中所述。将来，该软件将被训练以分析3D图像，以便可以量化脂质沉积体积。将脂质沉积视为病理学主要因素的退行性眼病很普遍，随着老年人口的增加，预计病例还会增加¹³。正如我们在本协议中概述的那样，准确的疾病模型和有效的分析工具将允许开发新的治疗干预措施。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 和微量;m Steriflip 过滤系统	EMD Millipore	SCGP00525
1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水	Gibco	14190-144
3,3'，5-三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma	T5516
牛白蛋白，组分 V	MP 生物医学	160069
Alexa Fluor 555 兔抗山羊 IgG （H+L）	Invitrogen	A21431	APOE二抗
APOE 一抗	Millipore Sigma	AB947
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	避光
补体感受态人血清	Millipore Sigma	S1-LITER
CTS N2 补充剂	Life Technologies	A13707-01
胎牛血清	Hyclone	SH30071.03
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	载玻片安装介质
玻璃盖玻片 #1 1/2 22 mm x 22 mm	电子显微镜科学	72204-01
玻璃显微镜载玻片 25 mm x 75 mm- 1.2 mm 厚	电子显微镜科学	71870-01
氢化可的松	Sigma	H0396
MEM Alpha	Life Technologies	12571-063
MEM 非必需氨基酸	Life Technologies	11140
尼罗河红	西格玛	72485-100MG	避光多
甲醛 16% 溶液，EM 级	电子显微镜科学	15710
青霉素-链球菌	Life Technologies	15140-148
磷酸盐缓冲盐水 10x	Gibco	70011-044
杆外段 （OS）	InVision Bioresources	98740
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761
丙酮酸钠	Life Technologies	11360-070
蔗糖	Sigma Aldrich	S1888
SYBR Green 预混液	Bio-Rad	1725274
牛磺酸	Sigma	T0625
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
吐温 20 超纯	Affymetrix	9005-64-5
玻连蛋白	Life Technologies	A14701SA
Y-27632 二盐酸盐	R&D 系统	1254