影响眼部视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。目前已开发出多种疾病模型及一种名为LipidUNet的软件应用，用于研究疾病的发病机制以及潜在的治疗干预手段。
方法文章
LipidUNet——基于机器学习的iPSC来源视网膜色素上皮细胞中脂质沉积物表征与定量分析方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
视网膜色素上皮（RPE）是位于眼球后部的一层六边形细胞单层结构。它为光感受器和脉络膜毛细血管提供营养和支持，吞噬光感受器外节（POS），并以极性方式分泌细胞因子，以维持外层视网膜的稳态。由基因突变、衰老和环境因素引起的RPE功能障碍会导致其他视网膜层退化，进而造成视力丧失。退化RPE的一个典型表型特征是细胞内和细胞下富含脂质的沉积物。这些沉积物是多种视网膜退行性疾病中共有的表型。为重现单基因视网膜退行性疾病中脂质沉积的表型 体外由患者成纤维细胞诱导生成的诱导性多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（iRPE），被用于建立疾病模型。来源于Stargardt病和晚发性视网膜变性（L-ORD）患者的细胞系在体外培养中与视外节（POS）共孵育7天，以模拟RPE的生理功能，该过程可引发上述疾病中由POS吞噬所诱导的病理变化。为建立与补体旁路激活相关的多基因疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的模型，iRPE细胞接受了补体旁路过敏毒素的刺激。细胞内及亚细胞水平的脂质沉积通过尼罗红（Nile Red）、硼-二吡咯甲烷（BODIPY）及载脂蛋白E（APOE）进行表征。为定量分析脂质沉积的密度，开发了一种基于机器学习的软件LipidUNet。该软件的训练基于iRPE细胞在培养表面的最大强度投影图像。未来，该软件将进一步训练以分析三维（3D）图像，并量化脂滴体积。LipidUNet软件将成为筛选可减少疾病模型中脂质积聚药物的重要工具。
引言
视网膜色素上皮（RPE）是位于眼球后部、紧邻视网膜感光细胞的一层单层细胞。RPE通过为感光细胞提供代谢和结构支持，在维持正常视力方面发挥着至关重要的作用。健康的RPE细胞具有明显的六边形形态，通过紧密连接相互连接，使RPE能够在基底侧的脉络膜毛细血管与顶端的感光细胞之间形成屏障。为了维持视网膜生态系统，RPE以一种最小化自身葡萄糖消耗的方式将关键代谢物（如葡萄糖）转运至感光细胞1。由于这一限制，RPE依赖其他代谢物来满足其代谢需求，包括脂肪酸；RPE通过β-氧化将脂肪酸转化为酮体2。鉴于RPE倾向于利用脂肪酸（可能来源于感光细胞外节段（POS）的消化再循环）作为能量来源，RPE中脂质代谢通路的有害改变通常导致或参与单基因和多基因退行性视网膜疾病的发生3。
年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种多基因遗传性退行性眼病，可导致视网膜色素上皮（RPE）退化，同时也与RPE单层细胞中自噬功能异常和脂质代谢紊乱相关。功能失调的RPE单层细胞无法正常处理感光细胞外节段（POS）并执行其他关键功能，从而在RPE与布鲁赫膜之间的细胞外区域（即RPE下方）形成称为基底线状沉积物（BLinD）的沉积物，这是AMD病理的典型特征。BLinD的主要成分包括脂蛋白，其中最丰富的是载脂蛋白E（APOE）4。BLinD薄层的积聚可导致软性玻璃膜疣的形成，后者被公认为AMD的临床症状之一5,6。
多个研究团队已证实，干细胞来源的 体外 导致视网膜色素上皮功能障碍的疾病模型具有视网膜色素上皮下脂质积聚的特征7,8,9Hallam 等（2017）利用因补体因子 H（CFH）基因多态性而具有较高年龄相关性黄斑变性（AMD）风险患者的细胞，生成了诱导性多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（iRPE） CFH 基因。诱导性视网膜色素上皮细胞（iRPE）显示出由APOE标记的玻璃膜疣样沉积物积累，而高风险个体来源的RPE积累的沉积物大于低风险患者来源的iRPE。10.
创建一个 体外 可重现年龄相关性黄斑变性（AMD）细胞特征（如脂滴和玻璃膜疣沉积）的模型，通过采用既往发表的发育导向方案，利用患者血液样本建立了诱导性视网膜色素上皮（iRPE）细胞系11将诱导性视网膜色素上皮细胞（iRPE）暴露于含补体活性的人血清（CC-HS）中，该溶液含有过敏毒素，可模拟年龄相关性黄斑变性（AMD）的一种可能病因：替代补体通路信号增强8通过常用的脂质和脂蛋白标志物 APOE、尼罗红（Nile Red）和 BODIPY 检测脂质沉积所导致的细胞及亚细胞水平变化。利用这些标志物发现，通过 CC-HS 激活的补体信号会加剧诱导型视网膜色素上皮细胞（iRPE 细胞）中的脂质积聚8.
为了建立单基因遗传性视网膜变性疾病的疾病模型，研究人员从Stargardt病患者中建立了诱导性视网膜色素上皮（iRPE）细胞系，该疾病由视网膜色素上皮细胞中ABCA4基因突变引起。先前研究表明，当ABCA4基因被敲除时，一种称为A2E脂褐素的细胞内沉积物会在RPE细胞内积聚，这种沉积物含有高水平的磷脂以及光依赖性脂质过氧化产物12。研究人员同时建立了ABCA4基因敲除细胞系和患者来源的细胞系，并对两者进行外节段（POS）喂养处理。Stargardt病iRPE细胞表现出由POS吞噬诱导的病理变化，通过BODIPY染色定量检测到脂质积聚显著增加。来源于ABCA4基因敲除iPSC的RPE细胞接受了CC-HS处理；BODIPY信号的定量分析也显示，该Stargardt病模型存在脂质代谢异常9。
鉴于这些疾病的普遍性以及对有效治疗手段的需求，结合上述相关疾病模型，有必要建立可靠的方法来量化潜在治疗方案的疗效。为了以客观、自动化和标准化的方式量化脂质沉积，开发了一种基于机器学习的软件LipidUNet，该软件结合掩膜分析工具，可快速有效地利用常见的标记物尼罗红（Nile Red）、BODIPY和APOE识别脂质沉积。通过该分析流程获得的汇总统计结果可进一步进行分析并以图形方式展示，便于对不同处理条件进行直观比较。本方案的示意图见图1。
图1：实验方案示意图： RPE细胞在96孔板中培养，并用活性人血清或纯化的牛视网膜外节段进行处理，以模拟不同类型的视网膜变性 体外RPE细胞经固定后，使用尼罗红、BODIPY和APOE对脂蛋白沉积物进行染色。采用共聚焦显微镜获取荧光标记脂质颗粒的Z轴层扫图像，并将其处理为二维最大强度投影图。通过机器学习算法训练模型以识别并准确分割脂蛋白颗粒。生成包含颗粒数量及多种形态学参数的汇总表格，可用于后续作图与统计分析。 请点击此处以查看此图的放大版本。
方案
所有实验方案步骤均遵循美国国立卫生研究院（NIH）人类研究伦理委员会制定的指南。干细胞研究及患者样本采集已获得NIH人类研究保护办公室（OHRP）下属的联合神经科学机构审查委员会（CNS IRB）批准，符合美国政府45 CFR 46号法规的要求。患者样本的采集依据经CNS IRB批准的知情同意书进行，遵循《赫尔辛基宣言》所规定标准，研究方案编号为NCT01432847（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1）。
1. iRPE 的生成
- 根据Sharma等（2022）发表的方案11，从患者血液来源的iPSC诱导生成iRPE（图2和图3）。
图2视网膜色素上皮细胞（iRPE）分化与成熟过程示意图 为获得诱导性视网膜色素上皮细胞（iRPE），采用既定的分化方案进行诱导，并让细胞成熟培养5周。所得细胞培养物可作为 体外 一种可通过多种处理方式进行调控的模型，用于模拟年龄相关性黄斑变性（AMD）和Stargardt病等疾病中的视网膜色素上皮（RPE）功能障碍。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：RPE分化与成熟的代表性图像（成功与不成功情况）。 两张TJP1 RPE在iRPE方案第42天时的明场图像，放大倍数为10倍。(A) 成功的分化与成熟表现为融合的、具有色素沉着和多边形形态的RPE细胞层。(B) 不成功的分化与成熟则表现为成簇的死亡细胞，如此处所示。请点击此处查看该图的高清版本。
2. 视网膜色素上皮维持培养基（RPE-MM）的制备
- 在4 °C条件下过夜解冻N2添加剂。其他所有试剂在室温（RT）下解冻。
- 在无菌条件下，按照Sharma等（2022）建立的方案11，根据表1中列出的稀释倍数加入所列试剂。
- 充分混匀培养基，并使用0.22 µm滤器过滤。
注意：若在4 °C保存，培养基可在2周内使用。
3. 96孔板接种
- 在室温下解冻一份玻璃粘连蛋白（vitronectin），持续3-5分钟，或直至冰完全融化。
- 用1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）按1:200的比例（玻璃粘连蛋白: DPBS）稀释，得到所需的工作液。对于96孔板，每孔加入200 µL工作液进行包被。
- 将解冻的ROCK抑制剂（Y-27632二盐酸盐）按1:1000比例加入RPE-MM中，使其终浓度为10 µM。此即RPE细胞的接种培养基。
- 使用自动细胞解冻系统解冻iRPE冻存管，并将iRPE细胞悬液转移至50 mL离心管中。
- 按1:10比例用接种培养基稀释细胞悬液，然后在400 ×g条件下离心5分钟。
- 小心吸除上清液，并将细胞重悬于10 mL接种培养基中。
- 取400 µL接种培养基与100 µL重悬的细胞溶液混合用于细胞计数。使用细胞活力计数仪测定该样本中细胞悬液的活细胞浓度。
- 用接种培养基将细胞悬液稀释至终浓度为60,000个细胞/mL。
- 彻底吸除96孔板中的玻璃粘连蛋白包被液，每孔加入200 µL细胞悬液。每孔约含12,000个细胞，即约200个细胞/mm2。
- 将接种后的细胞板在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。48小时后，更换为不含ROCK抑制剂的RPE-MM培养基，并在5周成熟期内每2-3天更换一次培养基。
4. 体外 疾病模型
- 补体活性人血清（CC-HS）处理
- 解冻人补体活性血清于 4°C 过夜。
- 制备CC-HS和补体非活性人血清（CI-HS）培养基。
- 制备5% CC-HS培养基时，将解冻的补体活性人血清与RPE-MM按1:20比例稀释混合。用滤膜过滤该溶液 0.22 µm 使用前对培养基进行过滤。
- 制备5%补体失活人血清（CI-HS）培养基时，首先将CC-HS置于水浴中热灭活 57 °C 30分钟水浴，然后以1:20的比例与培养基混合。通过滤膜过滤该溶液 0.22 µm 使用前请过滤培养基。
- 血清处理细胞 200 µL 分别使用含5% CC-HS或5% CI-HS的培养基培养，总培养时间为48 h，在24 h时更换培养基。
- 用1×DPBS洗涤细胞，随后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。再次用1×DPBS洗涤，并将样品置于 4 °C，浸入 200 µL DPBS的
- 可选：如需仅显示视网膜色素上皮下脂质沉积，可裂解培养板中的细胞。
- 为了裂解细胞并仅保留脂质沉积物，移除培养基并加入 200 µL 向每个孔中加入去离子水。
- 孵育10–15分钟，用移液器反复吹打直至细胞完全脱落。再用 200 µL 加入去离子水，并立即用4%多聚甲醛固定细胞。
- 使用Hoechst核染色确认细胞去除效果。将Hoechst以1:2000稀释比例加入含1%牛血清白蛋白（BSA）、0.5% Tween 20和0.5% Triton-X 100的1x DPBS溶液中，避光室温孵育1小时。随后用1x DPBS洗涤。
- iRPE的光感受器外节（POS）处理
- POS 制备
- 从 - 中取出 POS 离心管80 °C 储存并在4°C过夜解冻 4 °C 在带盖的冰桶中。
- 通过将10 g蔗糖溶解于40 mL双蒸水中配制POS洗涤缓冲液2O (ddH₂O)2O
- 将混合物在40-50 °C 在轻柔搅拌下反应15分钟。向混合物中加入840 mg碳酸氢钠，加热并持续搅拌10分钟。
- 用ddH₂O将POS洗涤缓冲液的总体积定容至100 mL2O，并根据需要使用 1 N HCl 或 1 N NaOH 将溶液 pH 调至 8.3。使用滤膜过滤洗涤液 0.22 µm 过滤器
注意：此处可暂停实验方案；POS 洗涤缓冲液可保存于 4 °C 过夜。 - 解冻后，将沉淀物悬浮于15 mL POS洗涤缓冲液中。悬浮沉淀时操作要轻柔，以确保POS完整性。将POS悬浮液在600 x g 在 4 °C 孵育20分钟，然后吸除上清液。
- 将POS沉淀重悬于10 mL POS洗涤缓冲液中。
- 移除 a 100 µL POS + POS 洗涤缓冲液（POS 溶液）的等分试样，并用其稀释 400 µL 1× DPBS。铺展 50 µL 在血琼脂平板和琼脂糖平板上分别涂布稀释后的POS溶液，以检测细菌和真菌污染。每组均设置阳性对照，所有平板于37°C孵育48 h 37 °C.
- 进行qPCR实验，通过添加 1 µL 向检测孔中加入POS溶液以检测支原体。为扩增DNA片段，进行40个循环的变性（95°C，15 秒），以及退火与延伸（60°C，1分钟）。用于检测POS样本中支原体的正向和反向引物如下：
上游引物：GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
反向引物：CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC - 使用细胞分析仪测定POS浓度，并根据需要进行分装。对于含RPE细胞的96孔板中的一个孔，使用3 x 106 POS 足够即可。所需比例为每 10 个 RPE 细胞对应 1 个 POS。将分装样品保存于 80 °C 以备将来使用。
- 向细胞中添加POS
- 在冰浴中解冻POS冻存管。
- 将计算好剂量的制备POS与RPE-MM混合，每天处理细胞一次，持续7天。
注意：POS 溶液需每日新鲜配制。 - 用 1× DPBS 洗涤细胞，然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。再用 DPBS 洗涤一次，将样品置于 4 °C，浸入 200 µL DPBS 的
- POS 制备
5. 视网膜色素上皮下沉积物染色
- 尼罗红染色方案
- 经PFA固定后，用1x DPBS洗涤样品3次。
注意：若不立即使用，可在本步骤暂停实验流程，但样品必须保存在含0.02%叠氮化钠的1x DPBS溶液中，于4 °C保存。 - 配制尼罗红储存液：将尼罗红粉末溶于丙酮中，配制成3 mg/mL浓度的溶液。室温下孵育15分钟，期间定期混匀。根据溶液中沉淀物的多少，使用0.22 µm滤膜过滤一次或两次。
注意：储存液需避光保存。 - 配制工作液：将储存液以1:500比例用1x DPBS稀释。向样品中加入200 µL工作液，在摇床上室温避光孵育30分钟。
- 用1x PBS洗涤3次，将样品置于200 µL DPBS中，于4 °C保存。
注意：若实验使用Transwell小室而非96孔板，可将样品用封片剂封固于载玻片上，加盖盖玻片，并用透明指甲油封边。封片时应注意使细胞面朝上。
- 经PFA固定后，用1x DPBS洗涤样品3次。
- BODIPY染色方案
- 配制储存液：将BODIPY溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制成3.8 mM的储存液。
- 对于PFA固定的样品，将BODIPY储存液以1:300比例用1x DPBS稀释，加入200 µL至细胞中，在摇床上室温孵育过夜。
- 用1x DPBS洗涤3次，将样品置于200 µL DPBS中，于4 °C保存。
注意：若实验使用Transwell小室而非96孔板，可将样品用封片剂封固于载玻片上，加盖盖玻片，并用透明指甲油封边。封片时应注意使细胞面朝上。
- APOE免疫染色方案
- 将1x DPBS与1%牛血清白蛋白（BSA）、0.5% Tween 20和0.5% Triton-X 100混合，配制成缓冲液。
- 对于PFA固定的样品，在200 µL缓冲液中于室温封闭并透化1小时。
- 将APOE一抗用缓冲液以1:100比例稀释，加入后于室温孵育过夜。
- 次日，用1x DPBS洗涤样品3次。
- 将二抗用缓冲液以1:1000比例稀释，加入200 µL至细胞中，室温孵育1小时。
- 用1x DPBS洗涤3次，将样品置于200 µL DPBS中，于4 °C保存。
注意：若实验使用Transwell小室而非96孔板，可将样品用封片剂（Fluoromount）封固于载玻片上，加盖盖玻片，并用透明指甲油封边。封片时应注意使细胞面朝上。
6. 图像自动化与处理
- 自动图像扫描
注意：本研究使用蔡司LSM 800倒置共聚焦扫描显微镜及ZEN 3.2（蓝色版）软件。成像前需将96孔板在室温下预温至少60分钟，以避免因温度变化导致培养基折射率改变，从而引起扫描过程中焦平面漂移。- 使用共聚焦显微镜和40倍物镜，针对所用的脂质标记物及任何其他抗体，设置相应的荧光通道扫描参数。
- 使用 瓷砖 复选框以设置图像自动化。校准96孔板时，确保输入并选择正确的样品载体尺寸，然后单击 校准 根据说明书使用10倍物镜校准板的按钮
- 选择 高级设置 选择合适的孔，并在孔中心附近添加3个不同的成像位点 职位 功能。这可以在手动模式下完成 位置 子标签或随机使用 体位设置 标签并选择 由 Carrier 设置对同一染色的所有孔重复上述步骤。
- 为在自动化过程中实现最佳聚焦和Z轴堆叠定位，请前往 聚焦策略 选择标签 使用图块设置定义的聚焦平面/Z值替代方法可采用其他对焦策略，但建议使用此设置以获得最一致的结果。
- 在……之下 瓷砖 标签，点击 验证位置 并为每个位置手动设置中央Z平面。设置在 选项 子选项卡将决定图像采集的顺序，因此在开始成像前请先检查此项设置。若要按照选定位置的顺序进行图像采集，请取消勾选该选项 瓷砖区域/位置 和 载体孔/容器 复选框。选择 将场景分割为单独的文件 便于图像处理。
- 确保 Z-层扫 标签设置为 中心，将一个范围输入到用户的偏好中，以及 最佳 选择按钮以设置切片间隔。
- 在优化后 采集模式，通道，聚焦策略，Z轴层扫，以及 瓷砖 标签，开始实验。
- 图像处理
- 使用批量图像处理方法，对每个Z轴层叠图像创建最大投影 扩展景深 方法
- 使用批量图像处理方法，将最大投影文件导出为16位TIFF图像。将压缩设置为 无 并确保 原始数据 检查图像。最终图像应为仅显示脂质标记物表达的荧光通道的最大投影灰度TIFF图像。
7. 分割与定量分析
注意：LipidUNet 程序是在来自 96 孔板的 40x 图像上进行训练的。强烈建议使用通过 40x 物镜获得的图像。
- 安装 LipidUNet 软件。LipidUNet 可从以下 GitHub 仓库下载：https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
- 识别代表尼罗红、Bodipy 或 APOE 的 TIFF 图像，并将其移至名为 图片 名为的目录内 尼罗红, Bodipy，或 APOE，具体取决于所使用的方法。
注意：必须使用精确的命名规范，以便LipidUNet程序能够识别目录。 - 打开 LipidUNet 软件（图4).
- 在 预测 软件的标签页中，选择相关目录（尼罗红，Bodipy 或 APOE) 单击省略号并导航至指定目录。通过检查“Class”条目，确认LipidUNet程序是否已正确识别图像。
- 在0.01至0.99之间为算法选择一个概率阈值。较高的值会减少更多的假阳性结果，但可能导致更多的假阴性结果；较低的值可能会引入更多的假阳性，同时减少更多的假阴性。默认推荐值为0.65。
- 点击 预测.
注意：软件将自动遍历所有图像，并在所选目录中创建一个名为 predicted_masks 的新文件夹。 - 使用一个 面具分析 用于遍历生成的掩膜图像，并对掩膜图像中经阈值处理的脂质沉积物进行定量计数的工具。
- 分析生成的计数数据以比较不同处理条件。
图4：LipidUNet用户界面。LipidUNet软件包含多个部分，用于选择训练数据目录（其中已正确标注脂质沉积物的图像）、模型权重目录（由训练数据生成）以及预测数据目录（用户在此输入待分割的图像）。请点击此处查看该图的放大版本。
结果
本方案提供了一种用于识别经尼罗红、BODIPY 和 APOE 染色的脂质沉积物的工作流程。所开发的软件可自动识别并定量脂质沉积物，在优化本方案所述条件时效果最佳。文中包含成功分化的视网膜色素上皮细胞（RPE）（图3A）和分化不良的视网膜色素上皮细胞（RPE）（图3B）的示例，因为细胞模型的质量会显著影响图像分割的准确性。
本方案中描述的三种标记物中的两种——尼罗红（Nile Red）和BODIPY，在荧光图像中表现为明显明亮的小圆形点（图5 和 图6）。正确的结果应能准确识别出这些明显的沉积物（图5A-D 和 图5E-H）。而“阴性”结果则表现为将背景荧光误识别为沉积物，导致图像分割错误，这可能是由于染色过弱（图6A-C 和 图6D-F）或背景荧光强度过高所致（图6G-I）。
APOE 沉积物具有多种大小和形状，通常呈椭圆形或不规则形，而非 Nile Red 和 BODIPY 所显示的圆形沉积。这些沉积物的点状特征也较不明显，且由于样本通透程度的差异，不同沉积物之间的信号强度可能有所不同。正确的识别能够检出每一个沉积物，包括那些饱和度较低的沉积物（图 5I-L）；而错误的分割则无法识别这些沉积物（图 6J-L）。因此，优化染色和成像方法以避免显著变异至关重要。其中一种方法是在免疫染色过程中仔细控制样本的通透步骤。为了优化荧光信号，可在固定和 APOE 免疫染色前对细胞进行裂解处理，这有助于实现均匀的信号饱和，并改善 APOE 沉积物的分割效果。
还提供了在96孔板以外的培养平台上成熟的细胞的分割图像。LipidUNet软件被应用于transwell培养的细胞图像，结果显示脂质沉积物虽被成功阈值化，但transwell膜上的孔洞也被同时阈值化。图 6M-O）。由于形状和大小相似，当前形式的 LipidUNet 软件将无差别地同时掩蔽脂质沉积物和 transwell 孔。
图5代表性结果。 (A,E,I96孔板中的RPE细胞经Hoechst核染色（蓝色）以及Nile Red（品红色）、BODIPY（绿色）或APOE（橙色）染色，图像为Z轴层扫的最大强度投影。B,F,J) 经图像处理后用于 LipidUNet 软件的灰度输入图像。C,G,K) 由 LipidUNet 生成的掩膜，其中所有沉积物均被正确识别。D,H,L) 每个被掩膜粒子的轮廓均进行编号。这些标签可将图像中的每个粒子与包含原始数据的电子表格中的对应条目关联起来。A-D显示尼罗红染色结果，尽管信号较弱，软件仍能准确识别背景中的沉积物。E-H) 显示BODIPY信号与背景之间具有强烈对比度，效果理想。LipidUNet准确识别出图像中的每一个脂质沉积物。I-L) 显示出强烈的 APOE 信号，并体现了使用该染色方法时常观察到的信号饱和度变异。尽管如此，图像分割仍能够识别出每个 APOE 沉积物的边界。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 6：次优结果。（A、D、G、J、M）96 孔板培养的视网膜色素上皮细胞（RPE）经 Hoechst 核染色（蓝色）以及尼罗红（品红色）、BODIPY（绿色）或 APOE（橙色）染色，图像为 Z 轴层扫的最大强度投影。（B、E、H、K、N）经图像处理后用于 LipidUNet 软件的灰度输入图像。（C、F、I、L、O）LipidUNet 生成的错误掩膜。红色圆圈标示软件错误识别为脂质沉积物的区域。（A–C）尼罗红图像处理错误，原因是软件将背景染色误判为沉积物。当图像中背景信号较强而脂质沉积物较少时，此类情况更易发生。展示了两个 BODIPY 染色的示例：一个是由于（D–F）BODIPY 染色较弱导致的低质量图像，另一个是（G–I）BODIPY 信号强但背景较高的图像。在这两种情况下，软件均无法区分围绕细胞核周围背景中的小圆形环状结构与真正的圆形脂质沉积物。尽管应优化染色与成像条件以避免此类错误，但 LipidUNet 的最新版本在处理此类图像方面已有显著改进。（J–L）APOE 分割错误。由于沉积物在大小和信号饱和度上更具变异性，软件难以识别部分沉积物。（M–O）将 RPE 接种于 Transwell 膜上并用尼罗红染色。此处显示的是 Z 轴层扫中的一个切片，包含尼罗红标记的脂质沉积物以及 Transwell 膜上的孔洞。软件无法区分二者，图中红圈内为 Transwell 膜孔洞，绿色箭头所指为尼罗红标记的脂质沉积物。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：掩码工具比较。 （A、B、C）通过尼罗红（红色）标记脂质沉积量不同的96孔板培养的RPE细胞。图像分别采用三种常见的掩码方法——“Find Maxima”、“Max Entropy”和“Renyi Entropy”进行掩码处理，并与LipidUNet生成的掩码进行比较。原始图像附有人工计数的脂质沉积数量，而各掩码图像则显示每种分割方法的预测计数结果。每种分割方法的平均误差率通过以下公式计算：mean[(|预测计数 - 人工计数| / 人工计数) × 100]。与其它掩码方法相比，LipidUNet生成的掩码在不同脂质沉积水平的图像中更准确地识别脂质沉积（平均误差率分别为：LipidUnet 23%，Find Maxima 1164%，Max Entropy 851%，Renyi Entropy 203%）。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 组分 | 货号 | 储存浓度 | 终浓度 | mL |
| MEM alpha | 12571-063 | NA | 500 | |
| N2 补充剂 | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
| 热灭活 FBS | SH30071.03 | NA | 5% | 25 |
| NMEM NEAA | 11140-050 | 10 mM | 0.01 mM | 5 |
| 丙酮酸钠 | 11360-070 | 100 mM | 1 mM | 5 |
| 青霉素-链霉素 | 15140-122 | 10000 U/mL | 100 U/mL | 5 |
| 牛磺酸 | T4571 | 50 mg/mL | 250 µg/mL | 2.5 |
| 氢化可的松 | H6909 | 18.1 mg/L | 20 µg/L | 0.553 |
| T3 | T5516 | 20 µg/L | 0.013 µg/L | 0.33 |
| 总体积，mL | 548.383 | |||
表1：RPE-MM试剂组成。 RPE-MM所用试剂及其最佳浓度列表。
讨论
本方案提供了一种高效标记、成像和定量单基因及多基因脂质沉积的方法 体外 用于退行性眼病的疾病模型。基于人工智能的软件LipidUNet可应用于三种常见的脂质标记物APOE、Nile Red和BODIPY，提供了一种快速、自动化的分析方法，使定量结果具有标准化和无偏性。
LipidUNet 的主要局限性在于，其人工智能训练所用数据集仅限于在96孔板中培养的细胞的40倍放大图像。由于训练图像集的限制，LipidUNet 目前仅适用于分析40倍放大的图像。该软件可用于分析在除96孔板以外的其他培养表面上培养的细胞的40倍放大图像，但应仔细检查软件生成的输出掩膜，以验证其阈值分割的准确性。未来需要更多不同放大倍数的图像数据集，以拓展该工具可分析的样本和图像范围。
该方案包含多个关键步骤。在脂质标记步骤中，操作者应确认所选用的标记化合物（BODIPY、APOE、尼罗红）已有效标记样本。成熟的视网膜色素上皮（RPE）细胞通常含有大量色素，可能干扰抗体免疫荧光染色的信号。当荧光信号较弱或背景染色过强时，LipidUNet 将无法准确识别脂滴。出于类似原因，必须正确选择方案中自动成像步骤的采集参数。若所获取的图像质量较差，LipidUNet 将难以准确分割图像，从而导致定量结果不准确（图6A-L）。最后，图像的后期处理是一个重要步骤，因为 LipidUNet 对软件运行具有特定的图像处理要求。
与采用手动阈值分割或使用Fiji等软件进行自动阈值分割的脂质分析流程相比，LipidUNet能够在脂质沉积程度不同的图像中实现无偏倚且可靠的分割，这体现在脂质颗粒识别中的误差率较小（图7）。该软件允许用户输入额外的训练图像，从而可分析超出本方案所述范围的图像数据集，例如使用40倍物镜以外的放大倍数或不同脂质标记物的图像，具体操作如本方案所述。未来，该软件将进一步训练以分析三维图像，从而实现对脂质沉积体积的定量。以脂质沉积为主要致病因素的退行性眼病较为常见，且随着老年人口的增加，预计病例数量将持续上升13。准确的疾病模型和高效的分析工具（如本方案所述）将有助于开发新型治疗干预手段。
致谢
感谢国家眼科研究所（NEI）组织学核心提供蔡司共聚焦系统的使用。本工作由NEI院内研究项目基金（资助号 ZIA EY000533-04）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm Steriflip 滤器系统 | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190-144 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | Sigma | T5516 | |
| 牛血清白蛋白，第 V 组分 | MP Biomedical | 160069 | |
| Alexa Fluor 555 兔抗山羊 IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE 二抗 |
| APOE 一抗 | Millipore Sigma | AB947 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | 避光保存 |
| 补体活性人血清 | Millipore Sigma | S1-LITER | |
| CTS N2 添加剂 | Life Technologies | A13707-01 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30071.03 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | 载玻片封片介质 |
| 玻璃盖玻片 #1 1/2，22 mm × 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| 玻璃载玻片 25 mm × 75 mm，厚度 1.2 mm | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H0396 | |
| MEM α 培养基 | Life Technologies | 12571-063 | |
| MEM 非必需氨基酸 | Life Technologies | 11140 | |
| 尼罗红 | Sigma | 72485-100MG | 避光保存 |
| 16% 电镜级多聚甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-148 | |
| 10× 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 70011-044 | |
| 视杆细胞外节段 (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360-070 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S1888 | |
| SYBR Green 主混合液 | Bio-Rad | 1725274 | |
| 牛磺酸 | Sigma | T0625 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tween 20 超纯 | Affymetrix | 9005-64-5 | |
| 玻璃粘连蛋白 | Life Technologies | A14701SA | |
| Y-27632 二盐酸盐 | R&D Systems | 1254 |
参考文献
- Kanow, M. A., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, e28899(2017).
- Adijanto, J., et al. The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).
- Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid. Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).
- Curcio, C. A., et al. Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy. Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).
- Sharma, R., et al. Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model. Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Hallam, D., et al. An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure. Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).
- Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).
- GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
重印与许可
