本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本研究的主要目的是建立一种可靠且高效的方法，从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。这一研究动机源于传统从外周血提取NETs方法的局限性，主要原因是可用于分离的中性粒细胞数量稀少。研究揭示了两种从大鼠骨髓获取中性粒细胞的不同方法：一种是简化的单步法，可达到满意的纯化水平；另一种是耗时较长的两步法，纯化效率更高。重要的是，这两种技术均可获得大量活细胞中性粒细胞，每只大鼠可获得5000万至1亿个。该效率与从人和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果相当。值得注意的是，源自大鼠骨髓的中性粒细胞在分泌NETs的能力方面，与来自外周血的中性粒细胞相当。然而，基于骨髓的方法始终能产生显著更多的中性粒细胞和NETs。该方法显示出获取更大量这些细胞成分以用于后续下游应用的潜力。特别地，这些分离得到的NETs和中性粒细胞在炎症、感染及自身免疫性疾病等领域具有广阔的应用前景。
引言
中性粒细胞是白细胞中一个关键的亚群，在先天免疫反应中发挥着至关重要的作用。其特征为具有多叶核以及含有多种蛋白酶和抗菌肽的颗粒1。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成来发挥功能。1996年，Takei 等人在用佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）刺激中性粒细胞的实验中首次观察到 NETs 的存在2。随后，Brinkmann 等人于2004年将这一形成过程命名为"NETosis"3，并进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NETs是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，在感染性和炎症性刺激下由活化的中性粒细胞释放。NETs可通过捕获病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶环境中，从而实现对入侵病原体的固定和杀灭1,3。此外，NETs还参与凋亡细胞的清除，并在炎症消退过程中发挥作用。近期研究表明，NETs的过度形成或降解障碍可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成以及血管再通障碍4,5,6
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究在四川大学华西医院动物伦理委员会批准的项目许可（编号：20211404A）下进行，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理与使用的指导原则。根据伦理指南，本研究所用大鼠饲养于环境受控的条件下，光照周期为12小时明/12小时暗，温度维持在22–24 °C，相对湿度为50%–60%。大鼠可自由摄食和饮水。本研究所用动物为6–8周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重约250 g，无特定病原体（SPF级）。动物来源于商业供应商（见材料表）。
1. 大鼠中性粒细胞的分离
- 骨髓采集
- 将大鼠放入合适的麻醉容器中（参见材料表）。向大鼠给予3%异氟烷，直至动物失去意识。通过脚趾或尾部夹捏测试确认无反应，以确保麻醉深度。
- 当大鼠深度麻醉后，将其仰卧放置，一手握住其尾部，另一手抓住头部，进行颈椎脱位。通过突然且有力地向上拉动尾部，同时向下拉头部，迅速而牢固地使颈部脱位，直至颈椎断裂。在进行组织采集或处理前，需等待确认死亡的体征，如呼吸停止和心跳消失。
- 将大鼠浸入75%乙醇中，静置数分钟以消毒毛发和皮肤。将大鼠仰卧放置，在髋关节处切断下肢，以保护股骨头。使用解剖剪剪断踝关节处的韧带，并将膝关节向后折叠，以暴露股骨和胫骨。
- 使用镊子和剪刀，小心去除附着在骨骼上....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文所述方案概述了两种不同的方法，每种方法分别具有更高的纯化效率或更简化的步骤。两种方法每只大鼠均可获得约 0.5 × 108–1 × 108 个中性粒细胞。采用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒进行的流式细胞术分析显示，细胞活力高于 90%，与小鼠和人类样本相当（图 1）。尽管从骨髓中分离中性粒细胞时淋巴细胞污染似乎难以避免，但两步法的纯度达到 90%，优于一步法所获得的 50% 纯度（图 2）。
外周血与骨髓中性粒细胞在PMA刺激下NET分泌反应相当图3）。此外，大鼠NETs彼此之间的交联能力有限（图4）。为了深入探究大鼠 NETosis 的过程，采用 PMA 作为诱导剂。NETs 被检测到 通过 cfDNA 染色，并使用细胞成像分析仪采集全面图像。值得注意的是，.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择合适的分离方法对于获得可靠结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是在分离过程中发生的淋巴细胞污染。在从大鼠骨髓中分离中性粒细胞时，解决这一问题尤为关键。尽管中性粒细胞的密度范围（1.0814–1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337–1.0765，峰值为1.0526）明显不同，但淋巴细胞污染仍然难以避免。这在一定程度上可归因于骨髓中淋巴细胞的丰富含量以及未成熟淋巴细胞密度的增加15。密度梯度分离技术（如使用Percoll和Ficoll）有助于减少淋巴细胞污染，但完全消除淋巴细胞可能仍具挑战性。通过配制特定密度梯度的专用Percoll溶液，可利用大鼠中性粒细胞与其他骨髓细胞之间的密度差异，最大限度地降低污染。因此，研究人员应审慎评估淋巴细胞污染对实验结果的潜在影响，并采取措施减轻其影响。
本研究强调了根据特定实验需求定制分离方法的重要性。在先前所述的方法中14，一步法在时间和操作强度上要求较低，因此被推荐用于中性粒细胞.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
基金支持：本工作受到国家自然科学基金（编号：82004154、81900311、82100336 和 81970345）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A488标记的驴抗兔IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594标记的驴抗小鼠IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594标记的山羊抗小鼠IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| 抗大鼠髓过氧化物酶抗体 | Abcam, England | ab134132 | |
| 抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo成像细胞仪 | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s平衡盐溶液（HBSS） | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| 异氟烷 | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| 正常驴血清 | Solarbio, China | SL050 | |
| 多聚甲醛 | biosharp, China | BL539A | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| 佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA） | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen双链DNA检测试剂盒 | Invitrogen, USA | P11496 | |
| 大鼠中性粒细胞分离试剂盒 | Solarbio, China | P9200 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Solarbio, China | R1010 | |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基 | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD通用动物麻醉机 | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley（SD）大鼠 | Dashuo, China | ||
| Sytox Green | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA（TE）缓冲液 | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
参考文献
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
