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方法文章

分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

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DOI：

10.3791/65506

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2024年4月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。

摘要

本研究的主要目的是建立一种可靠且高效的方法，从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。这一研究动机源于传统从外周血提取NETs方法的局限性，主要原因是可用于分离的中性粒细胞数量稀少。研究揭示了两种从大鼠骨髓获取中性粒细胞的不同方法：一种是简化的单步法，可达到满意的纯化水平；另一种是耗时较长的两步法，纯化效率更高。重要的是，这两种技术均可获得大量活细胞中性粒细胞，每只大鼠可获得5000万至1亿个。该效率与从人和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果相当。值得注意的是，源自大鼠骨髓的中性粒细胞在分泌NETs的能力方面，与来自外周血的中性粒细胞相当。然而，基于骨髓的方法始终能产生显著更多的中性粒细胞和NETs。该方法显示出获取更大量这些细胞成分以用于后续下游应用的潜力。特别地，这些分离得到的NETs和中性粒细胞在炎症、感染及自身免疫性疾病等领域具有广阔的应用前景。

引言

中性粒细胞是白细胞中一个关键的亚群，在先天免疫反应中发挥着至关重要的作用。其特征为具有多叶核以及含有多种蛋白酶和抗菌肽的颗粒1。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成来发挥功能。1996年，Takei 等人在用佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）刺激中性粒细胞的实验中首次观察到 NETs 的存在2。随后，Brinkmann 等人于2004年将这一形成过程命名为"NETosis"3，并进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NETs是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，在感染性和炎症性刺激下由活化的中性粒细胞释放。NETs可通过捕获病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶环境中，从而实现对入侵病原体的固定和杀灭1,3。此外，NETs还参与凋亡细胞的清除，并在炎症消退过程中发挥作用。近期研究表明，NETs的过度形成或降解障碍可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成以及血管再通障碍4,5,6,7,8,9,10。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在心肌梗死后失控性纤维化及心室动脉瘤形成中的致病作用已通过血管周围纤维化的扩展得到证实4,11。心肌梗死模型以及从小鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法均已建立。多形核（PMN）白细胞是人体血液中含量丰富的白细胞类型，是分离人中性粒细胞的理想来源。该方法无需采集骨髓，从而提高了安全性和效率。

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）在与心脏重构相关的心房颤动中也发挥着作用。然而，由于小鼠的心房尺寸过小，无法建立折返环路或心房颤动（AF）模型，因此通常需使用狗和猪等大型动物来模拟心房颤动，除非对特定的离子通道或信号通路进行基因敲低或敲除12。尽管可以诱导大鼠产生心房颤动，并如前所述从大鼠外周血中分离中性粒细胞，但研究人员面临一个限制：每只大鼠（10 mL 血液）仅能分离出约 2 × 105–5 × 105 个中性粒细胞。为在每个时间点提取足够量的 NETs，需要约 10–25 只大鼠（总计 5 × 106 个中性粒细胞），导致该过程耗时、昂贵且产量通常较低13。针对这一问题，Li He 及其同事提出了一种以骨髓为导向的策略，用于从大鼠中获取足量的 NETs14。在他们的文章中，详细描述了从大鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法，并比较了大鼠外周血与骨髓来源中性粒细胞释放 NET 的能力。所介绍的两种方法适用于不同的实验目标，均可获得足量的大鼠骨髓中性粒细胞，同时减少所需大鼠数量。其中，两步分离法在中性粒细胞纯度方面表现更优，而一步法则更为省时，且纯度可满足实验要求。此外，研究人员还比较了大鼠骨髓中性粒细胞与其外周血对应细胞在 NETosis 及 NET 形成方面的能力，发现两者在多形核中性粒细胞（PMN）活性上具有相当的效能。这些发现对与中性粒细胞相关的心房颤动研究具有重要意义，并强调了在不同实验动物中根据中性粒细胞分布特点灵活选择中性粒细胞来源的重要性。

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方案

本研究在四川大学华西医院动物伦理委员会批准的项目许可（编号：20211404A）下进行，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理与使用的指导原则。根据伦理指南，本研究所用大鼠饲养于环境受控的条件下，光照周期为12小时明/12小时暗，温度维持在22–24 °C，相对湿度为50%–60%。大鼠可自由摄食和饮水。本研究所用动物为6–8周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重约250 g，无特定病原体（SPF级）。动物来源于商业供应商（见材料表）。

1. 大鼠中性粒细胞的分离

  1. 骨髓采集
    1. 将大鼠放入合适的麻醉容器中（参见材料表）。向大鼠给予3%异氟烷，直至动物失去意识。通过脚趾或尾部夹捏测试确认无反应，以确保麻醉深度。
    2. 当大鼠深度麻醉后，将其仰卧放置，一手握住其尾部，另一手抓住头部，进行颈椎脱位。通过突然且有力地向上拉动尾部，同时向下拉头部，迅速而牢固地使颈部脱位，直至颈椎断裂。在进行组织采集或处理前，需等待确认死亡的体征，如呼吸停止和心跳消失。
    3. 将大鼠浸入75%乙醇中，静置数分钟以消毒毛发和皮肤。将大鼠仰卧放置，在髋关节处切断下肢，以保护股骨头。使用解剖剪剪断踝关节处的韧带，并将膝关节向后折叠，以暴露股骨和胫骨。
    4. 使用镊子和剪刀，小心去除附着在骨骼上的肌肉、肌腱及其他组织。用Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗骨骼，以去除残留的组织碎片和血液。重复冲洗两次，共洗涤三次。将清洁后的骨骼放入无菌容器中。
    5. 使用5或10 mL注射器配针头，从骨骼两端穿刺，以松动骨髓基质。用另一支注射器以10–15 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基冲洗骨髓，直至无法再冲出可见的骨髓组织。
    6. 将骨髓细胞在20 °C下以300 x g离心10分钟。加入5–10 mL红细胞裂解缓冲液（参见材料表）重悬细胞，并在室温下孵育3分钟。向混合液中加入4倍体积的HBSS。在室温下以600 x g离心5分钟，用移液器弃去上清液，所得细胞沉淀用于后续实验。
  2. 从骨髓中分离中性粒细胞
    1. 对于两步法，执行以下附加步骤：
      1. 按照生产商说明书，使用商业化的大鼠中性粒细胞分离试剂盒分离骨髓细胞（参见材料表）。
      2. 在新的15 mL离心管中，依次叠加2 mL 55% Percoll试剂（参见材料表）、2 mL 65%试剂、2 mL 70%试剂和2 mL 80%试剂，形成密度梯度。将离心管在20 °C下以800 x g离心40分钟，加速度设为5，减速度设为0或1。
      3. 使用无菌移液器收集70%梯度层，包括65%与70%梯度试剂交界处的细胞层。将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。向管中加入15 mL HBSS，并轻轻倒置数次以洗涤细胞。在室温下以300 x g离心10分钟，使细胞成团。
    2. 对于一步法，执行以下附加步骤：
      1. 对骨髓细胞进行梯度离心，但不使用大鼠中性粒细胞分离试剂盒。
      2. 使用无菌移液器收集70%梯度层，包括65%与70%梯度交界处的细胞层。将细胞悬液转移至新的50 mL离心管中，并用HBSS洗涤细胞。在室温下以400 x g离心5分钟，使细胞成团。
      3. 使用血细胞计数板计数分离得到的中性粒细胞，并通过台盼蓝染色评估细胞活力。
        ​注意：该方案可根据大鼠数量和所需分离的中性粒细胞数量进行调整。当该方法首次在新的实验条件下使用时，通常从三只大鼠获取的骨骼数量即可满足要求。所有操作均应在无菌条件下进行。为尽量减少细胞损伤和活力丧失，应尽快完成骨髓中性粒细胞的分离。

大鼠 NET 的获取

  1. 在无菌的10 cm培养皿中，将0.5 × 108–1 × 108个分离的中性粒细胞重悬于4 mL RPMI培养基（添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素）中。
  2. 向中性粒细胞悬液中加入500 nM PMA（见材料表）以诱导NETosis。在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
  3. 对于阴性对照，向中性粒细胞悬液中加入DNase I（10 U/mL），以降解分泌的NETs。
  4. 收集NETs时，移除培养基，并用HBSS轻轻洗涤附着在培养皿上的NETs。然后，每块培养皿用4 mL新鲜培养基剧烈冲洗，使NETs从培养皿表面脱离。
  5. 收集洗涤液，并反复吹打以充分重悬NETs。
  6. 将悬液在20 °C下以300 × g离心10分钟，去除漂浮的细胞。
  7. 将含有NETs的悬液转移至无菌管中，于−20 °C保存，并在2周内使用。
    ​注意：NETs易发生降解，建议使用新鲜制备的样品以获得最佳结果。

3. NETs 存在的验证

  1. 用 4% 多聚甲醛将步骤 2.4 中的细胞和步骤 2.7 中的 NETs 分别固定 15 分钟和 30 分钟至 1 小时。
  2. 将盖玻片倒置在覆盖于试管架上的石蜡膜中的 PBS/PBST 液滴上，重复洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 用 0.5% Triton-X-100 在室温下对细胞进行透化处理 10 分钟，然后在 PBS/PBST 中洗涤三次，每次 1 分钟。用 10% 正常驴血清（见材料表）在室温下封闭细胞 1 小时 。
  4. 在 4 °C 下用抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体和抗大鼠髓过氧化物酶抗体（见材料表）孵育细胞过夜。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。
  5. 在室温避光条件下，用二抗 A488 标记的驴抗兔 IgG (H + L)、A594 标记的驴抗小鼠 IgG (H + L) 以及 A594 标记的山羊抗小鼠 IgG1（见材料表）孵育细胞 1 小时。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。
  6. 用 10 mg/mL DAPI 对细胞核和 NET 骨架进行染色。随后，在 PBS/PBST 中洗涤盖玻片三次，每次 5 分钟。
  7. 在载玻片上滴加一滴封片剂，将带有细胞的盖玻片倒置其上。干燥 1 小时后即可使用浸油物镜进行显微分析；否则可直接用于观察。
    ​注意：即使在固定后，操作 NETs 时也必须格外小心，因为它们极为脆弱，容易在制备过程中丢失。

4. NETs 的定量分析

  1. 根据制造商说明配制 Tris-EDTA（TE）缓冲液和 PicoGreen（dsDNA 检测试剂）工作液（参见材料表）。
  2. 通过将储备 DNA 稀释至 1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 µg/mL 的浓度来制备标准品。
    注意：为定量 NETs 浓度，采用双链 DNA（dsDNA）检测试剂盒（参见材料表），并遵循制造商指南。Tris-EDTA（TE）缓冲液和 dsDNA 检测试剂分别使用 19 倍体积的双蒸水或 199 倍体积的 TE 缓冲液配制。随后制备标准溶液（1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 µg/mL），并将每份 50 µL 样品与 450 µL TE 缓冲液混合。
  3. 将每份样品 50 µL 加入 450 µL TE 缓冲液中。
  4. 向 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 标准品或样品，并加入等体积的检测试剂工作液，包括标准品孔和样品孔。
  5. 将板在室温下避光孵育 2–5 分钟。
  6. 使用荧光酶标仪读取样品，激发波长约 480 nm，发射波长约 530 nm。
  7. 利用标准品生成的标准曲线计算每个样品中 NETs 的浓度。

5. 通过细胞流式术分析 NETs 的分泌

  1. 向96孔板中孵育的细胞加入细胞核染料（参见材料表），使其终浓度为10 ng/mL，孵育30分钟。
  2. 向细胞中加入游离DNA（cfDNA，参见材料表）染料，使其终浓度为300 nM，孵育10分钟。
  3. 通过轻柔吹打混匀荧光染料。不要弃去上清液或洗涤沉淀。
  4. 将样品板放入流式细胞仪中。
  5. 设置不同通道的聚焦和曝光时间参数：蓝色通道（激发：377/50 nm，发射：470/22 nm），通常曝光时间为30,000 ms；绿色通道（激发：483/32 nm，发射：536/40 nm），通常曝光时间为5,000 ms。
  6. 在不同通道下采集整块板高度均一的图像。
  7. 分析不同组别的细胞核染料计数。若计数相近，则可通过cfDNA染料计数确定NETs的释放情况。

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结果

本文所述方案概述了两种不同的方法，每种方法分别具有更高的纯化效率或更简化的步骤。两种方法每只大鼠均可获得约 0.5 × 108–1 × 108 个中性粒细胞。采用 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒进行的流式细胞术分析显示，细胞活力高于 90%，与小鼠和人类样本相当（图 1）。尽管从骨髓中分离中性粒细胞时淋巴细胞污染似乎难以避免，但两步法的纯度达到 90%，优于一步法所获得的 50% 纯度（图 2）。

外周血与骨髓中性粒细胞在PMA刺激下NET分泌反应相当图3）。此外，大鼠NETs彼此之间的交联能力有限（图4）。为了深入探究大鼠 NETosis 的过程，采用 PMA 作为诱导剂。NETs 被检测到 通过 cfDNA 染色，并使用细胞成像分析仪采集全面图像。值得注意的是，...

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讨论

中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择合适的分离方法对于获得可靠结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是在分离过程中发生的淋巴细胞污染。在从大鼠骨髓中分离中性粒细胞时，解决这一问题尤为关键。尽管中性粒细胞的密度范围（1.0814–1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337–1.0765，峰值为1.0526）明显不同，但淋巴细胞污染仍然难以避免。这在一定程度上可归因于骨髓中淋巴细胞的丰富含量以及未成熟淋巴细胞密度的增加15。密度梯度分离技术（如使用Percoll和Ficoll）有助于减少淋巴细胞污染，但完全消除淋巴细胞可能仍具挑战性。通过配制特定密度梯度的专用Percoll溶液，可利用大鼠中性粒细胞与其他骨髓细胞之间的密度差异，最大限度地降低污染。因此，研究人员应审慎评估淋巴细胞污染对实验结果的潜在影响，并采取措施减轻其影响。

本研究强调了根据特定实验需求定制分离方法的重要性。在先前所述的方法中14，一步法在时间和操作强度上要求较低，因此被推荐用于中性粒细胞...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

基金支持：本工作受到国家自然科学基金（编号：82004154、81900311、82100336 和 81970345）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A488标记的驴抗兔IgG(H + L)Invitrogen, USAA32790
A594标记的驴抗小鼠IgG(H + L)Invitrogen, USAA32744
A594标记的山羊抗小鼠IgG1 Invitrogen, USAA21125
抗大鼠髓过氧化物酶抗体Abcam, Englandab134132
抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体Abcam, Englandab21595
Celigo成像细胞仪Nexelom, USA200-BFFL-5C
DNase ISigma, USA10104159001
胎牛血清（FBS）Gibco, USA10099141C
Hank’s平衡盐溶液（HBSS）Gibco, USAC14175500BT
HoechstThermofisher, USA33342
异氟烷RWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, USA81381
正常驴血清Solarbio, ChinaSL050
多聚甲醛biosharp, ChinaBL539A
青霉素-链霉素Hyclone, USASV30010
PercollGE, USAP8370-1L
佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）Sigma, USA P1585
Picogreen双链DNA检测试剂盒Invitrogen, USAP11496
大鼠中性粒细胞分离试剂盒Solarbio, ChinaP9200
红细胞裂解缓冲液Solarbio, ChinaR1010
罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）培养基Hyclone, USASH30809.01B
RWD通用动物麻醉机RWD, ChinaR500
Sprague Dawley（SD）大鼠Dashuo, China
Sytox GreenThermofisher, USAS7020
Tris-EDTA（TE）缓冲液Solarbio, ChinaT1120
Triton X-100Biofroxx, German1139ML100

参考文献

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