不动杆菌生物膜的定量、活性评估及可视化策略

摘要

本方案描述了接种物的制备、利用结晶紫染色在微孔板上对生物膜进行定量、生物膜中的活菌计数，以及对不动杆菌属（Acinetobacter）生物膜的可视化观察。

摘要

不动杆菌 引起医院内感染，其生物膜的形成有助于该菌在干燥表面（如医院环境）中存活。因此，生物膜的定量与可视化是评估其潜在风险的重要方法 不动杆菌 菌株引起医院感染的能力。可在微量滴定板表面形成的生物膜，通过体积和细胞数量进行定量。生物膜体积可通过结晶紫染色、洗涤、乙醇脱色后，使用微量滴定板读数仪测定溶解的染料量来定量。为定量嵌入生物膜中的细胞数量，可使用细胞刮刀将生物膜刮下，收集至生理盐水中，在玻璃珠存在下剧烈振荡，随后涂布于不动杆菌属琼脂培养基上。然后将平板在30 °C下孵育24–42小时。孵育结束后，计数红色菌落以估算生物膜中的细胞数量。该活菌计数法也可用于计数 不动杆菌 混合物种生物膜中的细胞。 不动杆菌 生物膜可通过荧光染料进行可视化。采用一种市售的专为显微分析设计的微孔板来形成生物膜。随后，对附着于孔板底部表面的生物膜使用SYTO9和碘化丙啶染料染色，经洗涤后，利用共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

引言

Acinetobacter 已知可引起医院内感染，其在医疗机构中导致的人类感染病例日益增多¹。该菌广泛存在于医院、医疗机构以及与食品相关的环境中^2,3,4。它可在包括病床护栏、床头柜、呼吸机表面以及洗手池等多种医院环境表面长期存活⁴。这种在环境表面的持续存在可能是导致Acinetobacter医院内感染的重要因素之一⁴。

生物膜是一种微生物生命形式，是由活的微生物细胞及其细胞分泌的胞外聚合物（EPS）组成的微生物基质⁵。微生物细胞被包裹在该基质中，通常对热、盐、干燥、抗生素、消毒剂和剪切力等环境胁迫具有高度抗性^6,7。

Acinetobacter 可在表面形成生物膜，表明其可能有助于在环境表面（包括医院环境表面）长期存活，并增强对抗生素治疗的耐药性^8,9。此外，Acinetobacter 的生物膜形成能力可能与人类临床结局密切相关⁸。因此，Acinetobacter 菌株的生物膜形成能力可能是预测其环境存活能力和人类感染风险的指标之一^8,10。

可通过定量和可视化表面附着的生物膜来评估其成膜能力。为了定量表面附着的生物膜，通常使用生物膜染色染料（如结晶紫）对生物膜进行染色，随后将染料从生物膜中洗脱至溶液中，并测定其光密度值¹¹。对生物膜进行可视化观察是评估其成膜能力的另一种有效方法¹¹。与扫描电镜（SEM）等其他技术相比，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合特异性荧光染料的可视化方法在表征生物膜形态结构方面更具优势^12,13。

可以通过计数生物膜中的活细胞来估算生物膜中活细胞的数量¹¹。将嵌入生物膜中的活细胞分离后进行稀释，涂布于琼脂平板，经培养后进行计数。由于较高数量的细胞更有可能达到感染剂量，因此该方法可提供有关生物膜的更详细信息，例如与细胞数量相关的感染潜力^13,14。

本文提供了逐步操作方案，用于（1）定量表面附着的生物膜，（2）计数生物膜中的活菌细胞，以及（3）利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对Acinetobacter的生物膜进行可视化观察。所介绍的实验方案描述了评估Acinetobacter分离株形成生物膜能力的方法，并对其生物膜特性进行表征。

方案

1. 细菌接种物的制备

1. 从-80 °C冰箱中取出甘油保存管。
2. 使用无菌移液器吸头从保存管中取出细菌菌株（2-10 µL）。
   注意：Acinetobacter 属的菌株，包括 A. bouvetii（13-1-1）、A. junii（13-1-2）、A. pittii（13-2-5）、A. baumannii（13-2-9）、A. radioresistens（20-1）和 A. ursingii（24-1），均适用于本实验方案。
3. 将细菌接种至市售的血琼脂平板（含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂，参见材料表）上。
   注意：也可使用其他培养基，如营养琼脂或麦康凯琼脂。
4. 使用无菌接种环在琼脂表面划线，并在划线过程中间断灼烧接种环以稀释菌液。
5. 将琼脂平板倒置放入培养箱中，在30 °C条件下培养过夜，时间为20-24小时。
6. 用无菌接种针挑取单个菌落，接种至5 mL无菌脑心浸出液肉汤（BHI，参见材料表）中。
7. 将接种后的肉汤置于摇床培养箱中，在30 °C、约150 rpm条件下振荡培养过夜，时间为20-24小时。
8. 取1 mL过夜培养物转移至无菌微量离心管中，在室温（RT）下以6,000 × g 离心10分钟。
9. 用移液器吸除上清液。
10. 使用涡旋振荡器将沉淀物重悬于1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
11. 在室温下以6,000 × g 离心10分钟，弃去上清液。
12. 使用涡旋振荡器将沉淀物重悬于无菌十倍稀释的BHI中，调节菌液在600 nm处的光密度值至约0.1。
    注意：光密度值约0.1相当于菌浓度约为10⁷ CFU/mL。

2. 使用结晶紫进行生物膜定量

1. 向无菌聚苯乙烯96孔板（见材料表）的每个孔中加入200 µL接种液，并向最外层的每个孔中加入200 µL去离子水，以防止内侧孔中的液体干燥¹⁵。
2. 在同一块板的每个孔中加入200 µL十倍稀释的BHI作为阴性对照。
3. 将板在25 °C下孵育24小时。
4. 用移液器吸除上清液。
   注：对于多个样品，多通道移液器通常更为方便。
5. 小心地向每个孔中加入300 µL PBS，并用移液器吸除上清液。
   ​注：对于多个样品，多通道移液器通常更为方便。
6. 重复步骤2.5两次。
7. 向每个孔中加入200 µL结晶紫溶液（1%）（见材料表），并在室温下孵育30分钟。
8. 重复步骤2.4–2.6。
9. 向每个孔中加入200 µL无水乙醇，在室温下孵育15分钟。通过反复吹吸数次充分混匀。
10. 将每个孔中的100 µL洗脱液转移至新的96孔板中。
11. 使用酶标仪在595 nm处测定吸光度（见材料表）。
12. 当吸光度超过2.0时，用无水乙醇将样品适当稀释至吸光度低于2.0，然后按照步骤2.11进行测定。随后，将测得的吸光度值乘以稀释倍数，计算出样品的吸光度（最终值）。
13. 通过从同一块板上各检测样品孔的吸光度值中减去阴性对照孔的平均值，计算样品的真实吸光度。

3. 生物膜活性计数

1. 取1 mL接种物（步骤1）加入无菌聚苯乙烯12孔板的每个孔中¹⁵。在25 °C下孵育24 h，用移液器吸除上清液。
2. 向每个孔中小心加入1.5 mL无菌PBS，再用移液器吸除上清液。随后向每个孔中加入1 mL无菌PBS。
3. 使用匹配的细胞刮刀刮取孔的底部和侧壁表面。
4. 将收集的细胞悬液转移至含有9 mL生理盐水（0.85% NaCl）和10–20颗玻璃珠的无菌塑料管（10^-1）中（见材料表）。
   注意：为收集孔底部表面残留的生物膜碎片，可使用10^-1管中的生理盐水进行重悬，并用移液器转移。
5. 将10^-1管在最大转速下涡旋振荡60 s。
6. 通过将1 mL样品转移至下一个含有9 mL生理盐水（0.85% NaCl）的无菌试管（10^-2）中，依次进行10倍系列稀释，直至10^-7。
7. 从每个稀释度中取100 µL涂布于不动杆菌琼脂平板（见材料表），在30 °C下孵育24–42 h。
8. 人工计数每个平板上典型红色菌落数量，有效计数范围为10–250个。
9. 利用以下公式计算每个孔中生物膜内可存活细胞的数量：
   可存活细胞数 = 菌落数 × 稀释倍数 × 10

4. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行生物膜可视化

1. 向无菌96孔板的每个孔中加入200 µL接种物，该96孔板用于显微镜分析。
2. 将96孔板在25 °C下孵育24小时。
3. 用移液器移除上清液。
4. 小心地向每个孔中加入300 µL经滤膜除菌的去离子水，然后用移液器移除上清液。
5. 重复步骤4.4。
6. 配制SYTO 9和碘化丙啶（见材料表）的混合液，用经滤膜除菌的去离子水稀释，使其终浓度分别为10 µM和60 µM。
7. 向每个孔中加入200 µL染色混合液，在室温下避光孵育20-30分钟。
8. 重复步骤4.3-4.4。
9. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），激发波长分别为488 nm和561 nm，发射波长范围分别为499-535 nm和568-712 nm，观察底部表面附着的生物膜。

结果

根据实验方案，最初从厨房表面分离的Acinetobacter菌株在聚苯乙烯96孔板上形成生物膜，经结晶紫染色后，用乙醇溶解染料并测定生物膜量（图1）。不同菌株形成的生物膜数量差异显著，OD值范围为0.04至1.69（图1）。依据Stepanović等人建立的标准¹⁶，除A. bouvetii外，所有分离株均能形成生物膜。A. radioresistens形成弱生物膜，A. junii和A. baumannii形成中等强度生物膜，而A. pittii和A. ursingii则形成强生物膜。

为了计数生物膜中的活细胞，使用细胞刮刀将生物膜刮下，高速涡旋振荡，稀释后涂布于Acinetobacter选择性平板上。培养后，通过计数菌落数量来估算生物膜中的细胞数量（

讨论

采用所述方案，对不同程度的不动杆菌（Acinetobacter）分离株的生物膜形成能力进行了测定和可视化，并估算了生物膜中的活菌数量（图1、图2 和 图3）。

在本实验方案中，使用了两种不同的温度，即 30 °C 用于 Acinetobacter 的生长，25 °C 用于其生物膜的形成。选择 30 °C 是因为许多研究采用高于 30 °C 的温度以实现 Acinetobacter 的最佳生长，该温度适用于获得足够的接种物^12,13,14,17。然而，这一温度通常高于生物膜实际形成环境的温度，例如医院...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板	SPL	30096	聚苯乙烯96孔板
脑心浸液（BHI）肉汤	Merck KGaA	1.10493.0500
血琼脂基础平板	KisanBio	MB-B1005-P50	不动杆菌的生长培养基
CHROMagar 不动杆菌选择性平板	CHROMagar	AC092	不动杆菌的选择性平板
结晶紫溶液	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD 生物膜活力检测试剂盒	Invitrogen	L10316	SYTO9 和碘化丙啶
酶标仪	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	用于生物膜检测
RBC 玻璃涂布珠	RBC	RG001	玻璃珠
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	适用于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的微孔板