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方法文章

骨髓来源巨噬细胞小细胞外囊泡肽段的鉴定

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DOI：

10.3791/65521

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2023年6月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

本文内容

摘要

本方案描述了通过差速超速离心法从巨噬细胞中分离小细胞外囊泡，并提取其肽组以进行质谱鉴定的实验流程。

摘要

小型细胞外囊泡（sEVs）通常通过多泡体（MVBs）的胞吐作用分泌。这些直径小于<200 nm的纳米级囊泡存在于多种体液中。sEVs通过其所携带的蛋白质、DNA、RNA和代谢物等 cargo，调控基因转录与翻译、细胞增殖与存活、免疫及炎症等多种生物学过程。目前已有多种技术用于sEVs的分离，其中基于超速离心的方法被认为是金标准，被广泛应用于sEVs的分离。肽类是天然存在的生物大分子，长度通常少于50个氨基酸，具有激素、神经递质和细胞生长因子等生物活性，参与多种生物学过程。肽组学旨在通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）系统性分析特定生物样本中的内源性肽。本文介绍了一种通过差速超速离心法分离sEVs，并提取其肽组以进行LC-MS/MS鉴定的实验方案。该方法从骨髓来源的巨噬细胞中鉴定出数百种来源于sEVs的肽。

引言

直径小于200 nm的小细胞外囊泡（sEVs）几乎存在于所有类型的体液中，并由各种细胞分泌，包括尿液、汗液、泪液、脑脊液和羊水1。最初，sEVs被认为仅是用于清除细胞废物的容器，因此在随后的十年中未受到广泛关注2。近年来，越来越多的证据表明，sEVs含有特定的蛋白质、脂质、核酸及其他代谢物。这些分子可被运输至靶细胞3，介导细胞间通讯，从而参与多种生物学过程，如组织修复、血管生成、免疫4和炎症反应5,6、肿瘤的发生与转移7,8,9等。

为了促进sEVs的研究，必须从复杂的样本中分离sEVs。根据sEVs的物理和化学特性（如密度、粒径和表面标志蛋白），已开发出多种sEVs分离方法。这些技术包括基于超速离心的方法、基于粒径的方法、基于免疫亲和捕获的方法、基于sEVs沉淀的方法以及基于微流控的方法10,11,12。在这些技术中，基于超速离心的方法被广泛认为是sEVs分离的金标准，也是最常用的技术13。

越来越多的证据表明，各种生物的肽组中存在大量尚未被发现的生物活性肽。这些肽通过调控生长、发育、应激反应14,15以及信号转导16，在多种生理过程中发挥重要作用。对小细胞外囊泡（sEVs）肽组的研究目标是揭示这些sEVs所携带的肽，并为其生物学功能提供线索。本文介绍了一种通过差速超速离心法分离sEVs，随后从中提取肽以进一步分析其肽组的实验方案。

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方案

1. 小细胞外囊泡的分离

注意：步骤 1.1-1.11 中的所有离心操作均需在 4 °C 下进行。

  1. 无小细胞外囊泡胎牛血清（FBS）的制备：将FBS在110,000 × g条件下离心过夜 g 在4 °C条件下通过超速离心机离心（参见 材料表) 以去除内源性小细胞外囊泡（sEVs）。收集上清液，使用0.2 µm超滤膜过滤除菌，并于-20 °C保存。
  2. 接种约 3 x 107 永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）接种于150 mm培养皿中，加入20 mL DMEM培养基（参见 材料表).
  3. 在收集sEVs之前，弃去培养基。用PBS（磷酸盐缓冲盐水； 材料表）并替换为含有10%无sEVs胎牛血清的培养基。
  4. 根据实验需要，收集细胞上清液并转移至50 mL离心管中。
  5. 离心细胞上清液，300 × g 10分钟以去除细胞，弃去沉淀，将上清液转移至新的50 mL离心管中。
  6. 将上清液在2000 × g 10 分钟以去除死细胞，弃去沉淀，将上清液转移至新的高速离心管中（参见 材料表).
  7. 将上清液在10,000 × g 30分钟高速离心以去除细胞碎片和微囊泡，弃去沉淀，将上清液转移至新的超速离心管中（参见 材料表）。超速离心管的容积为38.6 mL；每根管中加入35 mL细胞上清液。
  8. 将上清液在 110,000 × g 70 分钟，使用摆桶式转子离心机（参见 材料表以获得粗制sEV沉淀。
  9. 弃去上清液，用 1 mL PBS 重悬富含 sEVs 的沉淀。在 110,000 × g 在台式超速离心机上离心70分钟（参见 材料表弃去上清液，向超速离心管中加入1 mL PBS。
  10. 然后持续用移液器吹打沉淀，将1 mL PBS转移至另一超速离心管中，依此类推，直至所有超速离心管中的样品通过移液混合均匀。
  11. 弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL PBS中，即为sEVs。
  12. 使用BCA（二辛可宁酸）法测定sEVs的总蛋白含量，具体步骤如下（参见 材料表).
    1. 蛋白标准品的制备：向标准蛋白管（含30 mg BSA）中加入1.2 mL蛋白制备液，充分溶解，配制浓度为25 mg/mL的蛋白标准溶液。随后用PBS稀释至终浓度为0.5 mg/mL。
    2. 向96孔板中分别加入0 µL、1 µL、2 µL、4 µL、8 µL、12 µL、16 µL和20 µL蛋白标准品，并用PBS补足至20 µL。同时，在待测样品孔中加入18 µL HEPES裂解缓冲液（20 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM NaF、0.5% Triton X-100）和2 µL sEVs样品。
    3. 根据制造商说明书配制所需的BCA工作液，每孔加入200 µL，室温（RT）放置20–30分钟。
    4. 使用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线和稀释倍数计算sEVs的总蛋白浓度。
      注意：本方案从40 mL上清液中提取的sEVs可用于后续蛋白标志物鉴定（如Western blot）。然而，从200 mL细胞上清液中提取的sEVs则可用于形态学观察（透射电子显微镜，TEM）和粒径分析（纳米颗粒追踪分析，NTA）。具体而言，对于步骤1.11中收获的sEVs，用100 µL PBS重悬，取20–30 µL用于形态学观察（TEM），将剩余样品重悬于1 mL PBS中用于粒径分析（NTA）。所有离心步骤均需预先将离心机预冷。在步骤1.8中，超速离心管必须严格配平，且液体体积至少达到管容量的四分之三；若不足，需添加培养基补足。在步骤1.11中，sEVs可在4 °C短期保存（12 h）；若需长期保存，必须置于-20 °C或-80 °C，以避免蛋白降解影响肽段提取。然而，对于用于形态学观察和粒径测定的样品，仅建议在4 °C短期保存（12 h）。

2. 通过透射电子显微镜观察小细胞外囊泡（sEVs）的形态

  1. 在 Parafilm 上滴加一滴新鲜的 sEVs 样品（约 20–30 µL），将铜网有编号的一面朝下接触 sEVs 液滴，静置吸附 3 分钟。
  2. 用滤纸吸去多余液体，然后将铜网置于一滴蒸馏水中，清洗两次。
  3. 用滤纸吸去多余液体，再将铜网置于 0.5% 醋酸铀酰液滴上进行负染色，染色时间为 5 秒。
  4. 重复步骤 2.2。
  5. 将制备好的铜网放置在样品杆上，并插入样品台。
    1. 调节放大倍数至 20,000x–25,000x 以找到待检测样品，随后将放大倍数调节至 100,000x，并调整合适的位置和灰度，在透射电子显微镜（TEM；材料表）下进行观察。图像采集时的加速电压设定为 80 kV。
      注意：在步骤 2.1 中，若 sEVs 样品浓度较低（<50 µg/µL），可将吸附时间延长至 5 分钟或更久。或者，在步骤 1.10 中，可用较小体积的 PBS（50 µL）进行重悬。在步骤 2.3 中，负染色时间不宜过长，否则难以观察到 sEVs 的三维（3D）结构。

通过纳米颗粒追踪分析测量sEVs的粒径分布和浓度

  1. 对于步骤 1.11 中收获的 sEVs，将溶液稀释至 1 mL 用于纳米颗粒跟踪分析（NTA）。首先，用蒸馏水清洗仪器，直至视野中无杂质。然后使用 1 mL 无菌注射器缓慢推入样品（进样体积：0.5–1 mL）。
  2. 通过配套软件（见材料表）分析样品。具体操作为：点击启动相机，调节相机水平至合适大小（通常强度为 14–16 单位），然后选择测量方法标准测量（3 或 5 次），点击运行以收集颗粒数据。
  3. 收集颗粒后，计算机可观察到运动的 sEVs 颗粒。同时，设置检测阈值（通常为 5），以分析颗粒大小分布，确保最终计数的颗粒均为运动的 sEVs 而非背景信号。分析完成后，保存并导出分析结果。
  4. 使用后，用蒸馏水清洗仪器，直至视野中无明显颗粒，并关闭激光器。
    注意：与用于透射电子显微镜（TEM）的 sEVs 样品不同，用于 NTA 的 sEVs 样品浓度不宜过高，且需要较大的样品体积（至少 1 mL）。此外，也可采用其他方法分析 sEVs 的粒径分布，例如流式细胞术和可调电阻脉冲传感技术（TRPS）等。推荐的 NTA 测量（NanoSight LM10）颗粒数/帧为 40。

4. 通过蛋白质印迹法检测sEVs的蛋白质标志物

注意：根据《细胞外囊泡研究的最低信息标准》（MISEV）2018 年指南17,18，建议采用 5 类蛋白质对小细胞外囊泡（sEVs）进行表征。在 sEVs 制备过程中，应至少评估第 1 至第 4 类中的每一类一种蛋白质标志物。

  1. 对于步骤1.9中收获的小细胞外囊泡（sEVs），小心吸取上清液，加入15 µL HEPES裂解缓冲液，孵育5分钟。然后加入等体积的上样缓冲液，并在沸水中加热15分钟。
  2. 本实验中，sEVs蛋白的上样量为8–10 µg。在10%凝胶中以80 V恒定电压进行电泳（约30分钟）。
    1. 当样品进入分离胶后，将电压调整为120 V（约45分钟）。当样品距离玻璃板底部2–3 cm时，关闭电源，切下样品条带用于转膜。电泳液的组成见子步骤4.2.1.1。
      1. 配制5×电泳液：分别称取Tris 15.1 g、SDS 5 g、甘氨酸94 g，用去离子水定容至1 L。使用时需用水稀释5倍。
  3. 组装转膜装置，加入足量转膜液（约1 L），将蛋白在冰上以90 mA恒定电流转至硝酸纤维素（NC）膜上，持续3.5小时。
    注：配制10×转膜液时，分别称取Tris 30.25 g、甘氨酸144.1 g，用去离子水定容至1 L。使用时按去离子水:甲醇:10×转膜液 = 7:2:1的比例配制。
  4. 转膜完成后，将NC膜置于封闭液中（50 mL TBST中含2.5 g脱脂奶粉，TBST含0.1% Tween 20），室温封闭1–2小时或4 °C过夜。TBST的组成见子步骤4.4.1。
    1. 配制10×TBST：分别称取Tris 60.56 g、NaCl 175.32 g，加入Tween-20 10 mL和浓盐酸34 mL，用浓盐酸调节pH至7.6，用去离子水定容至2 L。使用时需用水稀释10倍。
  5. 使用三种sEVs标志物（分化簇9 [CD9]；β-肌动蛋白；肿瘤易感基因 [TSG101]）和一种非sEVs标志物（葡萄糖调节蛋白94 [GRP94]）鉴定蛋白条带。
    1. 取上述抗体各2 µL，按1:500比例稀释，用步骤4.4中的封闭液作为稀释液，将NC膜在室温孵育3小时或4 °C过夜。
    2. 与一抗孵育后，在摇床上用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。
  6. 将NC膜放入按1:500稀释的二抗溶液中，在室温摇床上缓慢振荡孵育45–50分钟，随后在摇床上用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。
  7. 将化学发光底物A液和B液（见 材料表）按1:1比例混合，将混合试剂加入NC膜，室温孵育5分钟。
  8. 使用印迹成像仪对NC膜进行成像（见材料表）
    1. 打开Image Lab软件，选择新建实验方案。
    2. 选择应用模式Blotting-colorimetric，取消勾选Highlight，点击运行实验方案，获取标记图像并保存。
    3. 然后重新选择应用程序Blotting-chemi，将总图像数量和曝光时间分别设置为30秒和300秒。
    4. 点击运行实验方案，获取图像并保存。最后取出NC膜，关闭计算机。
      注：步骤4.6中，二抗孵育时间不应超过50分钟，否则背景过深。

sEVs 肽段的提取

  1. 通过超速离心以 110,000 × g 在 4 °C 下离心 70 分钟，将 sEVs 洗涤两次，加入 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）（见材料表）重悬，并加入 5 µL 100 倍蛋白酶抑制剂（见材料表）。
  2. 将样品进行超声破碎（见材料表）。超声均质设置如下：功率：40 W，总时间：10 分钟，超声时间：3 秒，间隔时间：5 秒。
  3. 将破碎后的混合物在 4 °C 下以 13,700 × g 离心 15 分钟。
  4. 离心后，向上清液中加入二硫苏糖醇（DTT；材料表），使其终浓度为 50 mmol/L，并在 56 °C 水浴中孵育 30 分钟。
  5. 随后，向上清液中加入 50 µL 碘乙酰胺（IAA；材料表），终浓度为 1 mol/L，在室温避光条件下反应 20 分钟。
  6. 将混合物在 4 °C 下以 13,700 × g 离心 15 分钟，收集上清液，即粗肽提取物。将其在 -20 °C 保存以备后续使用。
  7. 使用 10 kDa 超滤管19 （见材料表）对获得的粗肽提取物进行超滤，以去除蛋白质，并在 4 °C 下以 13,700 × g 离心 1 小时。收集滤出液，并在 45 °C 下使用真空离心浓缩仪（见材料表）干燥。
  8. 按照步骤 5.8.1–5.8.8 对干燥样品进行脱盐。使用质谱级纯水作为试剂的溶剂。
    1. 向每个样品中加入 100 µL 0.1% 三氟乙酸（TFA），充分溶解干燥的肽段。
    2. 向每个脱盐柱中加入 100 µL 100% 乙腈（ACN），在室温下以 400 × g 离心 3 分钟，弃去流出液。然后向每个脱盐柱中加入 100 µL 50% 乙腈，以 400 × g 离心 3 分钟，弃去流出液。
    3. 向每个脱盐柱中加入 100 µL 0.1% TFA，以 400 × g 在室温下离心 3 分钟，弃去流出液。
    4. 重复步骤 5.8.3。
    5. 将步骤 5.8.1 中溶解的肽段溶液用移液器加入脱盐柱中，以 400 × g 离心 3 分钟，收集流出液。重复上样步骤，使肽段样品充分吸附至脱盐柱中。
    6. 重复步骤 5.8.3 两次。
    7. 向脱盐柱中加入 50 µL 含 0.1% TFA 的 50% 乙腈溶液，以 400 × g 离心 3 分钟，将流出液（肽段）收集至新的质谱级离心管中。

6. 干燥脱盐后的肽段

  1. 使用真空离心浓缩仪干燥脱盐后的肽段（设置：V-AQ 模式，温度：45 °C，时间：50 分钟），随后用于质谱分析。
    注意：sEVs 肽段的提取过程应尽可能在冰上操作，以避免蛋白质降解。所有试剂均使用质谱级水配制，以避免塑料污染。在步骤 5.8 中，脱盐会导致肽段样品不可避免的损失。可通过重复步骤 5.8.5 和 5.8.7 来减少该损失。

7. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析

注意：通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析肽段样品，具体使用Orbitrap Q Exactive HF-X质谱仪与EASY-nLC 1000纳米高效液相色谱系统联用（参见材料表）。

  1. 使用C18分析柱（粒径1.9 µm，柱长15 cm，内径150 µm）分离样品，流速为60 nL/min，采用65分钟梯度洗脱：4%-15%持续4分钟，15%-28%持续28分钟，28%-40%持续10分钟，40%-69%持续10分钟，95%保持7分钟，95%降至6%用时1分钟，随后保持6%持续5分钟（溶剂A为含0.1%甲酸[FA]的水溶液；溶剂B为含0.1% FA的80%乙腈溶液，v/v）。
  2. 在纳米电喷雾电离（nano-ESI）喷雾器中电离洗脱的肽段，毛细管温度设为320 °C，喷雾电压为2.2 kV。
  3. 采用数据依赖性采集模式收集质谱数据，全扫描模式分辨率为120,000，MS/MS模式分辨率为15,000。
    1. 在Orbitrap中进行全扫描，扫描范围为250 m/z至1800 m/z，隔离窗口为1.6 m/z。
    2. 选择前20个最强离子进行高能碰撞解离（HCD）碎裂，归一化碰撞能量设为29%，并在离子分离器中检测。
      注：典型的质谱条件如下：全扫描的自动增益控制（AGC）目标值为3 × 106离子，MS/MS扫描为2 × 105离子；最大注入时间全扫描为80 ms，MS/MS扫描为19 ms；动态排除时间为13 s。

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结果

对于通过差速超速离心法分离的sEVs（图1），我们根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的标准17对其形态、粒径分布和蛋白质标志物进行了评估。

首先，通过透射电子显微镜（TEM）观察sEVs的形态，结果显示其具有典型的杯状结构（图2A）。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，分离得到的sEVs粒径主要集中于136 nm（图2B），与文献报道的sEVs大小范围（30–150 nm）一致1。最后，通过蛋白质印迹法（western blot）检测sEVs的蛋白标志物。结果表明，分离得到的sEVs中显著富集了sEVs标志蛋白，包括CD9、β-actin和TSG101；而内质网标志物GRP94仅在全细胞裂解液中被检测到（图2C）。上述结果表明，所采用的分离方法获得了高纯度...

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讨论

在研究sEVs功能时，必须从复杂的生物样本中获得高纯度的sEVs，以避免任何潜在的污染。目前已开发出多种sEVs分离方法13，其中基于差速超速离心的方法显示出相对较高的sEVs纯度。本研究中，收集了细胞上清液200 mL，持续6小时，通过差速超速离心获得了约200–300 µg的sEVs。然而需要注意的是，在超速离心过程中（步骤1.8），sEVs沉淀可能不可见。因此，建议尽可能吸取离心管底部的液体。此步骤至关重要，将直接影响sEVs的得率。此外，还需进一步优化实验方案以提高得率，例如在sEVs于110,000 × g 条件下沉淀时，延长离心时间或细胞上清液的收集周期（步骤1.8和1.9）。尽管通过差速超速离心法分离的sEVs具有较高纯度，但该方法耗时较长。

随着现代质谱技术和遗传数据库的进步，已在各种生物的组织和体液中鉴定出数以万计的肽，这些肽在来源、丰度和生物学功能上存在显著差异20。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的肽组学为研究小细胞外囊泡（sEVs）肽组...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由国家自然科学基金（3157270）资助。感谢中国北京生命科学研究所邵峰博士提供iBMDM细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BCA 蛋白检测试剂盒Beyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
离心过滤管MilliporeUFC5010BK
聚丙烯离心瓶Beckman Coulter357003高速离心机
化学发光底物Thermo Fisher Scientific34580
二硫苏糖醇SolarbioD8220100 g
DMEM 培养基Cell WorldN?A
GRP94Cell Signaling Technology20292
高速离心机Beckman CoulterAvanti JXN-26离心转子（JA-25.50）
永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDM）中国国家生物科学研究所由邵峰博士（中国国家生物科学研究所）提供
碘乙酰胺Sigmal11495 g
聚丙烯微量离心管Beckman Coulter3574481.5 mL，台式超速离心机 
纳米高效液相色谱系统Thermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
纳米颗粒追踪分析 Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X 质谱仪Thermo Fisher ScientificN/A
磷酸盐缓冲液SolarbioP1020
聚丙烯离心管Beckman Coulter326823超速离心机
蛋白酶抑制剂BimakeB14002
SpeedVac 真空浓缩仪EppendorfConcentrator plus
台式超速离心机Beckman CoulterOptima MAX-XP超速离心转子（TLA 55）
透射电子显微镜HITACHIH-7650B
TSG101SigmaAF8258
超速离心机Beckman CoulterOptima XPN-100超速离心转子（SW32 Ti）
超声细胞破碎仪ScientzSCIENTZ-IID
Western Blot 成像系统Bio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
β-actinSigmaA3853

参考文献

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