基于溶剂辅助风味蒸发富集的茶叶香气分析

摘要

本文介绍一种利用溶剂辅助风味蒸发和溶剂萃取结合气相色谱-质谱法富集和分析茶叶提取物中挥发性成分的方法，该方法可应用于所有类型的茶叶样品。

摘要

茶叶香气是决定茶叶品质的重要因素，但由于茶提取物中挥发性成分的复杂性、浓度低、种类多样且性质不稳定，对其进行分析具有较大挑战性。本研究介绍了一种利用溶剂辅助风味蒸发法（SAFE）结合溶剂萃取和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），在保留气味特征的前提下获取并分析茶提取物中挥发性成分的方法。SAFE是一种高真空蒸馏技术，能够在无非挥发性物质干扰的情况下，从复杂的食品基质中分离出挥发性化合物。本文提供了茶叶香气分析的完整逐步操作流程，包括茶汤制备、溶剂萃取、SAFE蒸馏、提取物浓缩以及GC-MS分析。该方法已应用于两种茶叶样品（绿茶和红茶），获得了样品中挥发性成分的定性与定量结果。该方法不仅可用于多种类型茶叶样品的香气分析，还可用于其分子感官研究。

引言

茶是全世界许多人的首选饮品^1,2。茶的香气既是茶叶的品质评价标准，也是决定其价格的重要因素^3,4。因此，对茶叶香气成分及其含量的分析，在分子感官研究和茶叶质量控制中具有重要意义。近年来，香气成分分析已成为茶叶研究中的一个重要课题^5,6,7。

茶叶中香气成分的含量极低，通常仅占茶叶干重的0.01%–0.05%⁸。此外，样品基质中大量非挥发性成分会严重干扰气相色谱分析^9,10。因此，必须通过样品前处理步骤来分离茶叶中的挥发性化合物。在分离与富集方法的选择上，关键在于尽可能减少基质干扰，同时最大程度地保留样品原有的气味特征。

溶剂辅助风味蒸发法（SAFE）最初由Engel、Bahr和Schieberle开发，是一种改进的高真空蒸馏技术，用于从复杂的食品基质中分离挥发性化合物^11,12。该方法使用一套紧凑的玻璃装置连接高真空泵（通常操作压力为5 × 10⁻³ Pa），可高效地从溶剂提取物、油性食品和水相样品中收集挥发性化合物。

本文介绍了一种将 SAFE 技术与溶剂萃取相结合的方法，用于从红茶浸液中分离挥发性物质，随后通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行分析。

方案

1. 内标物和茶汤的制备

1. 储备液：将 10.0 mg 的对二甲苯-d10（见材料表）溶解于 10.0 mL 无水乙醇中，配制成 1,000 ppm 的内标储备溶液。
2. 工作液：取 1 mL 储备液（步骤 1.1）用纯水稀释至 100 mL，配制成 10 ppm 的内标工作溶液。
   注意：工作液必须在分析当天配制。
3. 取 3 g 茶叶（绿茶和红茶均可，见材料表）放入锥形瓶中，加入 150 mL 沸水，用玻璃塞盖住瓶口。
4. 5 分钟后，迅速通过 300 目筛网过滤茶汤。
5. 用 30 mL 水将茶渣洗涤两次，并将洗涤液合并至茶汤中。
6. 将茶汤置于冰水浴中快速冷却至室温。
7. 向茶汤中加入 1.00 mL 工作液（步骤 1.2），充分混匀。

2. 茶汤的SAFE蒸馏及蒸馏液的液-液萃取

1. 按照以下步骤准备 SAFE 装置。
   1. 安装 SAFE 装置（图 1），并将蒸馏瓶连接至左下方（图 1[3]），收集瓶连接至右下方（图 1[4]）。将循环水管连接至 SAFE 玻璃装置后部。安装冷阱（图 1[5]），并将管路连接至玻璃装置右上方的真空泵（见材料表）。
      注意：检查循环水管的连接；确保进水口在上方，出水口在下方。使用去离子水进行循环，以防止水垢堵塞 SAFE 装置中的白色管道，否则会导致循环水流通不畅，最终引起 SAFE 装置爆炸。 蒸馏底瓶（图 1[3]）可通过搅拌子搅拌，以促进样品蒸发。
   2. 将循环水温度设定为 50 °C，样品瓶水浴温度设定为 40 °C。关闭真空阀（图 1[2]）。
2. 操作真空泵。
   1. 开启真空泵电源。
   2. 逐步将转速提高至最大速度 100%。
      注意：若转速无法达到 100%，请检查系统是否密封良好，以及系统内部是否有溶剂残留。
   3. 当达到高真空状态（理想情况下为 10^-3 Pa）时
      注意：向冷阱中加入液氮后，真空度会进一步提升。
3. 进行样品蒸馏。
   1. 启动水循环。
   2. 向冷阱中加入液氮，使其覆盖收集瓶外部。
   3. 将茶汤注入装置左上方的样品漏斗（图 1[1]），然后用玻璃塞盖住。
   4. 将样品逐滴引入蒸馏瓶中。控制样品滴加速度，使真空度维持在约 10⁻³ Pa 的合适范围内。
      注意：在过程中需持续添加液氮，确保右侧收集瓶始终浸没在液氮中。尽量避免冷阱内形成冷凝物。
4. 蒸馏完成后关闭真空泵。
   1. 按下电源开关。当"STOP"闪烁时，按下回车键确认。
   2. 当分子泵转速降至"0"时，拔掉电源线。
      注意：仅当转速降至"0"时方可重新启动。
5. 将系统恢复至常压。
   1. 取下样品瓶上方的磨口塞。
   2. 缓慢旋开真空阀旋钮，使系统恢复至大气压力。
6. 取下含有样品的收集瓶。
   1. 系统恢复至常压后，移除收集瓶外部的液氮。
   2. 缓慢旋下收集瓶。小心取下含有样品的收集瓶。
   3. 关闭循环水。
7. 对 SAFE 馏出液进行液-液萃取。
   1. 让瓶中的 SAFE 馏出液升温至室温。
   2. 用 50 mL 二氯甲烷（见材料表）对 SAFE 馏出液萃取三次。
   3. 合并二氯甲烷层。用无水硫酸钠干燥萃取液（见材料表）。
      注意：当溶剂中的无水硫酸钠不再结块且可自由流动时，即视为已充分干燥。
   4. 用温和的氮气流将萃取液浓缩至约 2 mL。
   5. 转移至 1–2 mL 样品瓶中，再用温和的氮气流进一步浓缩至 200 µL。

3. 气相色谱-质谱分析及数据处理

1. 使用配备熔融石英毛细管柱的气相色谱-质谱联用系统（GC-MS）（图2，参见材料表）分析第2部分实验方案中制备的香气浓缩物。
2. 以氦气为载气，线性流速为40 cm/s。
3. 以不分流进样模式注入3 µL浓缩液。
4. 设置气相色谱炉温程序：(1) 在40 °C保持5 min；(2) 以5 °C/min升温至200 °C；(3) 以10 °C/min升温至280 °C；(4) 在280 °C保持10 min。
5. 质谱选择性检测器在正电子轰击电离（EI）模式下运行¹³，质荷比扫描范围为30 m/z至350 m/z，电离能量为70 eV。
6. 使用自动质谱解卷积与鉴定系统（AMDIS，参见材料表）对GC-MS数据进行解卷积。
7. 解卷积后，使用NIST（美国国家标准与技术研究院）17质谱检索程序³进行数据匹配与定性。
8. 根据在相同GC条件下测定的一系列正构烷烃（C5-C25，参见材料表）的结果，计算各化合物的保留指数¹⁴。
9. 通过质谱图与保留指数的同步匹配，结合NIST质谱数据库和保留指数数据库对GC峰进行鉴定。
10. 利用总离子流色谱（TIC）峰面积，相对于内标物计算SAFE样品中各挥发性组分的浓度。
11. 从茶汤制备开始，重复分析三次。

结果

本节以红茶和绿茶样品的香气分析为例，说明上述分析流程。

代表性 GC-MS 色谱图如图所示 图3. 图 3A 显示一组正构烷烃，以及 图3B 显示内标物的谱图。绿茶和红茶样品提取物的评估结果如图所示。 图3C 和 图3D，分别。通过分析内标物，可检测到一个具有稳定基线的明确峰（图 3B）。气相色谱图显示了绿茶和红茶 infusion 提取物经总离子计数后获得的完整气相色谱图谱。

通过质谱匹配结合保留指数，在绿茶和红茶样品中共鉴定出104种香气化合物。相对定量通过各化合物峰面积相对于内标的比值计算得出。根据定性与定量结果绘制的热图展示了绿茶和红茶样品中香气化合物含量相对于内标...

讨论

本文介绍了一种利用SAFE和GC-MS分析茶叶浸出液中挥发性化合物的高效方法。

茶汤具有复杂的基质，含有大量非挥发性成分。文献中已报道了多种从茶汤中分离挥发性成分的方法。其中一种常用方法是同时蒸馏萃取（SDE）^15,16。然而，该方法不适用于茶叶香气的分析，因为在整个蒸馏/萃取过程中需将茶叶与水持续煮沸，导致茶汤成分发生化学反应，从而获得的气味特征与原始样品差异显著¹⁷。SAFE 在高真空条件下对茶汤进行低温蒸馏，最大限度地减少了待测成分的变化，能够有效保留原始香气组成。

固相微萃取（SPME）是另一种常用于茶叶香气分析的方法^18,19。该方法的优点在于操作简便且无需溶剂。然而，由于纤维对香气成分的吸附具有选择性，难以获得能够反映样品香气特征的定量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
烷烃混合物（C10-C25）	ANPEL	CDAA-M-690035
烷烃混合物（C5-C10）	ANPEL	CDAA-M-690037
AMDIS	美国国家标准与技术研究院	版本 2.72	马里兰州盖瑟斯堡
分析天平	OHAUS	EX125DH
无水乙醇	国药集团
无水硫酸钠	阿拉丁
红茶	千和茶叶		中国安徽省黄山市
浓缩仪	Biotage	TurboVap
数据处理器	Agilent	MassHunter
二氯甲烷	TEDIA
气相色谱仪	Agilent	7890B
气相色谱柱	Agilent	DB-5MS
绿茶	千和茶叶		中国安徽省黄山市
质谱仪	Agilent	5977B
对二甲苯-d10	Sigma-Aldrich
SAFE	Glasbläserei Bahr
超纯去离子水	Milipore	Milli-Q
真空泵	Edwards	T-Station 85H