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基于Au@Carbon点纳米探针的无标记表面增强拉曼散射生物分析

DOI：

10.3791/65524

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2023年6月9日

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1MOE Key Laboratory of Laser Life Science & Guangdong Provincial Key Laboratory of Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University

本文内容

摘要

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在这项研究中，我们开发了一种低成本的基于表面增强拉曼散射（SERS）的指纹纳米探针，具有良好的生物相容性，以显示无标记活细胞生物成像并检测两种细菌菌株，详细展示了如何以无损方法获得活细胞的SERS光谱。

摘要

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表面增强拉曼散射（SERS）技术因其能够提供生物样品的分子指纹信息，以及在单细胞分析中的潜力，在生物医学领域受到越来越多的关注。这项工作旨在建立一种基于Au@carbon点纳米探针（Au@CDs）的无标记SERS生物分析的简单策略。在这里，多酚衍生的CD被用作还原剂，以快速合成核壳Au@CD纳米结构，由于协同拉曼增强机制，即使亚甲蓝（MB）的浓度低至10-9 M，也能提供强大的SERS性能。对于生物分析，Au@CDs可以作为独特的SERS纳米传感器来识别生物样品的细胞成分（例如癌细胞和细菌）。结合主成分分析，可以进一步区分不同物种的分子指纹图谱。此外，Au@CDs还可以进行无标记的SERS成像，以分析细胞内组成谱。该策略提供了一种可行的、无标记的SERS生物分析，为纳米诊断开辟了新的前景。

引言

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单细胞分析对于揭示细胞异质性和评估细胞的综合状态至关重要。细胞对微环境的即时反应也保证了单细胞分析1。但是，当前技术存在一些限制。荧光检测可以应用于单细胞分析，但受到灵敏度低的限制。其他挑战来自细胞复杂的荧光背景和长期照射下的荧光光漂白2。表面增强拉曼散射（SERS）由于其优点，在单细胞分析方面可能符合条件，包括（1）反映固有的分子指纹信息和瞬时情况，（2）超高的表面灵敏度，（3）方便的多重检测，（4）高光稳定性，（5）检测可以量化进行比较分析，（6）避免近红外波长激发的细胞自发荧光，（7）可以在细胞水中进行检测环境，以及（8）检测可以指向小区3、4、5内的特定区域。

有两种广泛认可的机制可以将SERS理解为一种基本现象:电磁增强（EM）作为主要原因和化学增强（CM）。EM是指在给定频率的激发场中，当入射光的频率与金属中振荡的自由电子的频率相匹配时，由电磁波驱动的集体电子的振荡，从而产生表面等离子体共振（SPR）。当局部SPR（LSPR）通过入射激光撞击金属纳米颗粒（NPs）发生时，它会导致入射光的共振吸收或散射。因此，金属NPs的表面电磁场强度可以提高2到5个数量级

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方案

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1. Au@CDs的制造

注: 图 1 显示了Au@CDs的制造过程。

  1. 通过典型的水热处理程序18，使用柠檬酸（CA）和没食子酸（GA）制备CD溶液。将 100 μL 3.0 mg mL-1 制备的 CD 溶液加入 200 μL 10 mM 氯金酸 （HAuCl4）（参见材料表）中，在室温下持续 10 秒，直到产生紫色悬浮液。
  2. 在室温下以4,000× g 离心紫色悬浮液10分钟，如果难以去除Au@CD胶体，则使用移液管轻轻除去上清液。
  3. 用 200 μL 去离子水（电阻率为 18.2 MΩcm）重悬Au@CDs以洗涤多余的 CD。
  4. 重复步骤1.2并获得核壳NP，重新分散在100μL去离子水中，并储存在4°C。 NP可以存储1个月。

2. Au@CDs的表征

  1. 透射电子显微镜
    1. 将CD和Au@CD样品在-80°C下过夜，从冷冻溶液中冻干，冻干成粉末后粉碎。
    2. 通过超声处理将获得的粉末样品充分分散到去离....

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结果

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Au@CDs的制造如图1所示。CD由CA和GA通过典型的水热工艺制备18。Au@CDs是在室温下通过CD在水性介质中还原HAuCl4来快速合成的。CD和Au@CDs的大小和形态可以通过TEM和高分辨率（HR）TEM23观察到。制备的CD是单分散的，尺寸接近2-6nm（图2A）。球形金核涂有一层约2.1nm的CD壳（图2B，C和补充图1）。

为了确认CD和Au@CDs的结构，记录了FT-IR光谱以分析有机官能团（图2D）。3,000-3,600/2,500-2,800 cm-1、1.......

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讨论

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综上所述，已经成功制造了具有2.1 nm超薄CD外壳的Au@CDs。纳米复合材料表现出比纯金NPs更高的SERS灵敏度。此外，Au@CDs在重现性和长期稳定性方面具有出色的性能。进一步的研究包括将Au@CDs作为底物，对A549细胞进行SERS成像31并检测两种细菌菌株32。已经证明，Au@CDs可以用作超灵敏的SERS探针，主要基于金NPs和CD之间的化学增强。

在以前的协议中，SERS测量过程中有几个关键点。首先，在将Au@CDs应用于细胞和细菌样品之前，必须确保卓越的SERS底物配方以及正确的浓度，这可以通过染料分子进行验证。随后，SERS光谱在每个细胞点都不一致，因为生物样品是复杂和动态的。

如果取更大的激光光斑，来自不同点的SERS光谱会更相似。值得注意的是，同一蜂窝点的SERS光谱可能不符合不同的激光功率。人们普遍认为，生物样品的平均SERS光谱是一致的;因此，尽可能多地获得相同蜂窝区域的SERS频谱，然后平均几个不同的.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了国家自然科学基金（32071399和62175071）、广州市科技计划（2019050001）、广东省基础与应用基础研究基金（2021A1515011988）和医学光电科学与技术教育部重点实验室（福建师范大学）开放基金（JYG2009）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBS 缓冲液（细胞培养）Langeco TechnologyBL316A
6 孔细胞培养板LABSELECT11110
细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）GLPBIOGK10001
柠檬酸阿拉丁生化科技C108869
CO2 培养箱Thermo Fisher Technologies3111
恒温磁力搅拌器赛多利斯科学仪器SQP
低温高速离心机上海博讯SW-CJ-2FD
DMEM 高糖细胞培养基ProcellPM150210
电子天平赛多利斯科学仪器SQP
酶标仪Thermo Fisher Technologies3111
胎牛血清浙江天航生物科技11011-8611
图 1图。
傅里叶红外光谱仪Thermo，美国Nicolet 380
冷冻干燥机TecanInfinite F50
没食子酸上海 阿拉丁生化科技G104228
手持式拉曼光谱仪OCEANHOOD，中国上海Uspectral-PLUS
HAuCl4广州制药公司（广州）
高分辨透射电子显微镜Thermo Fisher TechnologiesFEI Tecnai G2 Spirit T12
高温高压灭菌器上海博讯YXQ-LS-50S figure-materials-1
倒置显微镜南京江南永信光学XD-202
LB 肉汤 BR环开微生物028320
医用超低温冰箱赛默飞世尔科技ULTS1368
亚甲蓝Sigma-Aldrich
胰酶细胞消化液beyotimeC0207
青霉素链霉素双抗上海博讯YXQ-LS-50S figure-materials-2
Millipore水表Milli-Q 系统
拉曼光谱仪雷尼绍
蓝宝石芯片beyotime
恒温水浴常州诺基
超净台上海博讯SW-CJ-2FD
紫外-可见光吸收光谱仪MADAPA， 中国UV-6100S
Wire 3.4雷尼绍
上海美国 纯

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259(2013).
  2. Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imagin....

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