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方法文章

行为成年斑马鱼前脑活动的双光子钙成像

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DOI：

10.3791/65526

⸱

2023年7月28日

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在成年斑马鱼前脑背侧进行双光子钙成像的实验方案。

摘要

成年斑马鱼（Danio rerio）表现出丰富的行为模式，可用于研究认知功能。它们还具有微型大脑，可通过光学成像方法测量全脑各区域的神经活动。然而，关于在行为状态下记录成年斑马鱼脑活动的研究报道仍较为稀少。本研究描述了在成年斑马鱼前脑背侧进行双光子钙成像的操作流程。我们重点关注如何固定成年斑马鱼的头部以防止其移动，从而提供足够的稳定性，实现对脑部活动的激光扫描成像。头部被固定的动物仍可自由活动身体其他部位，并能自主呼吸。该操作旨在缩短头部固定手术所需时间，最大限度减少脑组织运动，并提高可记录神经元的数量。本文还介绍了一套在钙成像过程中呈现沉浸式视觉环境的实验装置，可用于研究视觉诱发行为背后的神经相关机制。

引言

利用基因编码的指示剂或合成染料进行钙荧光成像，已成为在活体动物（包括非人灵长类、啮齿类、鸟类和昆虫）中测量神经元活动的有力方法1。通过双光子成像技术，可同时记录大脑表面以下深达约800 µm范围内数百个细胞的活动2,3。通过在基因定义的神经元群体中表达钙指示剂，还可特异性地测量特定细胞类型的活动。该成像方法在小型脊椎动物模型中的应用，为研究跨脑区神经计算机制开辟了新的可能性。

斑马鱼是神经科学研究中广泛使用的一种模型系统。受精后约6天的斑马鱼幼鱼因其脑部微小且身体透明，已被用于钙成像研究。4幼年斑马鱼（3-4周龄）也常用于研究感觉运动通路背后的神经机制5,6然而，对于包括关联学习和社会行为在内的复杂行为，其最佳表现水平在较晚的年龄才能达到7,8因此，需要一种可靠的方案，以利用成像方法研究成年斑马鱼大脑中的多种认知功能。尽管斑马鱼幼体和幼年斑马鱼可包埋于琼脂糖中 体内 成像时，2个月及以上成年斑马鱼在此类条件下会出现缺氧，且体型过于强壮，无法通过琼脂糖固定。因此，需要通过手术操作来稳定脑部，同时使动物能够通过鳃自由呼吸。

本文介绍了一种头部固定方案，该方案采用了一种新型的单头杆设计。手术时间缩短至25分钟，比之前的方法快两倍9。我们还描述了记录腔室（半六边形槽）、头端装置以及将这两部分快速连接的快锁机制的设计9。最后，本文还介绍了用于呈现沉浸式视觉刺激以研究视觉诱发脑活动和行为的实验装置。总体而言，本文所述方法可用于在头部固定的成年斑马鱼中对基因定义的细胞群体进行双光子钙成像，从而实现对多种行为范式下脑活动的研究。

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方案

所有动物实验程序均经中央研究院机构动物照护及使用委员会批准，并遵循其指南进行。研究工具的详细信息见材料表。

1. 记录室的准备

  1. 准备一个半六边形水箱、一个底板和一个头部固定装置（图1A；补充文件1-3）。头部固定装置由固定在圆形板上的两根金属杆组成。该圆形板上带有可与底板锁定的凹槽。锁定后，将头部固定装置和底板共同置于半六边形水箱底部。
  2. 将半六边形水箱放置在显微镜的实验平台上。平台应能够在X和Y方向上移动，且不会触碰到平移台的限位。
  3. 将810 nm的红外光（IR）和相机对准头部固定装置，用于行为记录。确保相机的视野足够大，能够容纳一条成年斑马鱼。
    1. 为防止双光子激光和视觉刺激干扰行为记录，在相机前分别安装875 nm短通滤光片和700 nm长通滤光片。
  4. 为呈现视觉刺激，将背投膜贴在半六边形水箱三个内壁的表面上（图1A）。
  5. 将三台投影仪分别对准水箱的三个表面。三个图像应拼接对齐，形成连续的视觉场景。为防止投影仪光线污染钙荧光信号，需在每台投影仪前放置中性密度滤光片和红色滤光片（600 nm，长通），并在光电倍增管（PMT）前放置带通滤光片（510/80 nm）。

使用半六边形水箱和头部固定装置进行鱼类定向研究的实验装置示意图和照片。
图1：头部固定手术所需的仪器。（A）头部固定装置的圆形板与半六边形水箱内底板之间的快速锁紧机构。定制部件的计算机辅助设计（CAD）文件见补充文件1–4。（B）用于头部固定的Ω形头杆。（C）用于将头杆定位至附着位置的三轴微操纵器。插图：头杆在黏土中的方向。（D）手术期间用于固定鱼类的固定筒。插图：鱼在固定筒内的方向。（E）用于将鱼装载到头部固定装置上的鱼类装载模块及所用的微操纵器。插图：鱼在模块内的方向。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 头部固定手术

  1. 为斑马鱼头部固定准备一个Ω形头杆（图1B；补充文件4）。具体操作为：将一块油性油泥固定在三轴显微操作器上，确保油泥足够坚固以固定头杆，但又足够柔软，以便在完成头部固定后能顺利取下头杆。
  2. 将头杆的一端插入油泥中，并使头杆保持水平方向（图1C），以确保后续将头杆固定在斑马鱼头部时处于水平状态。
    注意：头杆可由钛（24 mg）或不锈钢（43 mg）制成，可用于多次实验。在头部固定条件下，头杆材料不会影响成年斑马鱼（体重范围为300–1,000 mg）的行为。
  3. 准备用于手术期间固定鱼体的圆筒形装置（cannon，即中空管）（图1D）。
  4. 在鱼缸水中配制0.03%和0.01%的三卡因甲磺酸盐（TMS；见材料表），用于在手术期间麻醉并维持鱼类的镇静状态。
  5. 准备四个组织拭子，用于清除颅骨粘附部位多余的皮肤和水分。每个拭子的制备方法为：将纸巾裁剪成3 cm见方的正方形，沿对角线折叠成管状结构，并将管的两端拧成细尖。由于粘附区域非常小，细尖设计有助于更精确地控制拭子操作。
  6. 为显微操作器准备一个鱼类装载模块（图1E）。
    注意：该模块由两个钢柱组成，通过直角夹具固定在一起。其中一个钢柱连接至显微操作器，另一个钢柱则连接一个可旋转的夹具，用于承载鱼类。该模块用于精确地将鱼体定位至头部固定平台。可旋转夹具可作为俯仰调节器，用于调整鱼体的俯仰角度。
  7. 使用含0.03% TMS的鱼缸水对鱼类进行麻醉。在后续步骤中，每隔90秒使用注射器向鱼口部短脉冲式输送含0.01% TMS的鱼缸水。灌注产生的水流应能诱发鳃部运动，以确保鱼类在手术期间存活超过40分钟。
    注意：选用Tg[neuroD:GCaMP6f]品系，因其在幼体和成体阶段前脑中均广泛表达钙指示剂10。
    注意：可选方案为，在手术过程中双手不便操作时，使用重力灌注以持续向鱼口部供水。
  8. 将鱼体包裹成胶囊状（图2A），以便将其固定在圆筒装置（cannon）内。
    1. 从尾尖开始，用湿润的纸巾将麻醉后的鱼体包裹至鳃部后方约1 mm处，确保包裹紧密，防止鱼体在纸巾内滑动。
    2. 使用带有纵向切口的软质塑料管（例如剪开的中号热缩管）包裹纸巾外层，覆盖范围从尾端至鳃部后方约2 mm处。该塑料管可确保鱼体在整个手术过程中保持笔直。
    3. 在塑料管外再包裹一层纸巾，使其直径大致与圆筒装置（cannon）的内径相近。
    4. 用从塑料移液器吸头剪下的软质塑料管包裹纸巾外层，以确保胶囊能顺利装入圆筒装置中。
    5. 将鱼体装入圆筒装置（cannon）中。
  9. 使用手术刀去除覆盖在粘附部位的皮肤，这些部位为小脑腹外侧及鳃部上方颅骨上的两个三角区域（图2B），然后去除两个粘附部位之间的皮肤。使用组织拭子干燥粘附区域，并清除残留的皮肤组织。
    1. 在去除皮肤过程中，使用可调平台支撑鱼头，但平台不得接触眼睛，以防手术过程中损伤眼部。
      注意：彻底清除粘附部位的皮肤对于减少成像过程中的运动伪影至关重要。
  10. 使用10 µL移液枪头，在每个粘附部位的中心滴加一滴组织胶（见材料表）。
    注意：组织胶覆盖粘附区域并迅速干燥，可在颅骨与用于粘接头杆的牙科水泥之间形成结合界面，并防止鳃部水分渗入粘附区域。
  11. 将鱼体调整为直立位置，并将头杆置于粘附部位略上方及后方，为粘接头杆做好准备。
  12. 配制牙科水泥（见材料表），并立即用于将头杆粘接到颅骨上（图2C）。该步骤时间敏感，必须在45秒内完成。
    1. 取一小勺聚合物，加入四滴快速单体和一滴催化剂V，均匀搅拌15秒。
    2. 使用微量移液器和10 µL移液枪头将混合物涂布于两个粘附部位及其之间的区域，避免覆盖鳃部和眼睛。
    3. 使用显微操作器轻轻将头杆压入水泥中，并用剩余水泥覆盖头杆表面。
    4. 静置12分钟，使牙科水泥充分固化。避免水泥接触水分。
  13. 为改善钙成像时前脑的光学通路，需去除端脑上方的皮肤。使用手术刀进行五次切割，可在3分钟内完成皮肤去除（图2D）。确保清除附着在颅骨表面的脂滴。
  14. 待水泥完全固化后，从头杆上移除油泥。
  15. 将整个胶囊从圆筒装置（cannon）转移至显微操作器鱼类装载模块中的俯仰调节器上。
  16. 使用显微操作器调整鱼体位置，使头杆位于头部固定平台金属柱的上方。略微增加鱼体的俯仰角度，以便在双光子成像过程中使前脑表面更好地与光学平面平行。
  17. 使用紫外光（UV）固化胶将头杆粘接到金属柱上。照射15秒即可完成固化。
  18. 将鱼体从胶囊中拉出，并将头部固定平台锁定在半六边形水箱的底板上。
  19. 将动物浸入鱼缸水中。鱼类应在1–2分钟内开始呼吸并从麻醉状态恢复。
    注意：可选方案为，使用注射器灌注向鱼口部输送新鲜水体。

斑马鱼解剖图、神经肌肉分析装置设置及前脑检查示意图。

图 2：头部固定手术中的关键步骤。（A）炮管内胶囊的结构组成。（B）颅骨上的附着位点（红色）。红色箭头指示血管位置。（C）上图：头部固定杆连接至鱼颅骨；下图：鱼已装载至头部固定平台。（D）需进行的切口以去除前脑上方的皮肤。数字表示切割顺序。应避免在标记位置（箭头）处去除皮肤，以防动物出血。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 双光子成像

  1. 打开激光器，等待30分钟以使功率稳定。将波长设置为920 nm，样品处的激光功率设置为约50 mW。
    注意：由共振扫描器控制的激光束在扫描路径的转折点移动较慢。为防止组织损伤，使用Pockels盒在转折点处降低激光功率。
  2. 将装有头部固定斑马鱼的记录腔室放置在实验平台上（图3A）。平台应能够在X和Y方向移动，且不触碰到平移台的限位。
  3. 将物镜尽可能靠近前脑表面放置。物镜应瞄准瞳孔前缘（图3B）。
  4. 打开激光快门并启用光电倍增管（PMT）。逐渐抬升物镜（约1 mm），直至荧光图像中显示出端脑背侧区域（图3C）。
  5. 为增加记录的神经元数量，使用压电驱动器在多个深度获取图像（六个成像平面，间距15 µm）。这将提高数据产量，但会降低帧率。启用快速Z轴扫描以控制压电驱动器（均匀模式，切片数 = 6，步长 = 15 µm，波形 = 锯齿波，回扫时间 = 4 ms，驱动器延迟 = 8 ms）。
  6. 进行行为记录时，打开鱼缸两侧的810 nm红外（IR）光源。调整角度以照亮鱼体全身，确保在相机中清晰可见。
  7. 打开投影仪。
  8. 开始记录数据。

使用红外光、投影仪的静态平衡装置；鱼类组织的显微成像；图解分析。
图 3：用于钙成像、行为记录和视觉刺激呈现的实验装置。（A）三个投影仪将视觉刺激投射到半六边形水箱的侧壁上。侧面的红外光源用于照亮斑马鱼的身体。（B）物镜的位置。左图：前视图；右图：侧视图。16倍物镜与目标脑区之间的距离约为 2.5 mm。（C）双光子成像示例。左图：Tg[neuroD:GCaMP6f] 转基因鱼整个背侧前脑的最大强度投影。右图：放大图像，显示多个脑区中的神经元。插图：来自不同脑区的更高倍数放大图像。图像为在 5 Hz 采样频率下记录的 10 秒数据的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

该实验方案包含两个部分：头部固定手术和前脑神经元活动的双光子钙成像。手术成功以动物存活和头部固定稳定为标准。在手术过程中通过口腔频繁灌注0.01% TMS溶液，可显著提高动物存活率。将鱼浸入鱼缸水后，应在1–2分钟内从麻醉状态恢复并开始主动呼吸。双光子钙成像技术能够透过完整的颅骨（厚度约40 µm），在脑表面下深达200 µm的范围内，记录前脑背侧区域单个神经元的活动。该成像范围覆盖了端脑背侧（D）的多个区域，包括内侧区（Dm）、中央区的前部（rDc）、中央区的后部（cDc）以及外侧区（Dl）。这些区域共同构成了成年斑马鱼端脑的30%（图3C）。利用压电驱动器进行三维成像时，在Tg[neuroD:GCaMP6f]10转基因鱼中，通常可在Dl或cDc区域记录约150个神经元的活动，在Dm和rDc区域则可记录约300个神经元的活动。在脑成像的同时进行行为记录，可识别与运动输出相关的神经活动特征（图4）。

在双光子成像过程中，尾巴的运动不应在图像中...

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讨论

本文介绍了一种用于成年斑马鱼头部固定以进行双光子钙成像的详细实验方案。实现适用于激光扫描成像的稳定头部固定的两个关键步骤如下：首先，必须将头部固定杆粘接到颅骨的特定附着位点。颅骨的其他部分 通常过薄而无法提供足够的机械稳定性，甚至可能在剧烈身体运动时发生断裂。其次，必须彻底清除附着部位上方的皮肤，并将残留的水分完全干燥，以确保颅骨能够与组织胶紧密粘合。下表列出了可能遇到的问题、其成因及相应的解决方案（补充表1).

由于斑马鱼前脑具有弯曲的几何结构，激发光束和相应的发射光在成像平面内穿过脑组织的厚度各不相同。因此，在同一光学切片中成像的神经元荧光强度会因神经元与脑边界距离的不同而发生变化。这导致单次记录会话中的数据产出较低。该问题在对 Dl 和 cDc 区域成像时尤为严重（图3C）。为此，我们采用压电驱动器在多个轴向位置进行记录，虽然牺牲了帧率，但增加了可记录的神经元数量。重要的是，由于在单个行为会话中同时记录了多个轴向位置的神经元活动，所得数据相...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了中国台湾中央研究院分子生物学研究所和国家科学及技术委员会的支持。中央研究院物理研究所的机械加工车间协助制造了定制设计的部件。我们还要感谢瑞士巴塞尔弗里德里希·米歇尔生物医学研究所的 P. Argast 对头部固定装置快速锁紧机构的设计。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
采集卡MBF BioscienceVidrio vDAQ显微镜
背投膜KimotoDiland screen - GSK呈现视觉刺激
带通滤光片（510/80 nm）ChromaET510/80m显微镜
半六边形水槽底板定制参见补充文件记录腔室
相机滤光片（<875 nm）Edmund optics#86-106行为记录
相机滤光片（>700 nm）Edmund optics#43-949行为记录
相机镜头ThorlabsMVL50M23行为记录
Chameleon Vision-SCoherentVision-S激光器
头件用圆形板定制参见补充文件记录腔室
压电驱动器控制器Physik Instrumente E-665. CR显微镜
电流放大器ThorlabsTIA60显微镜
Elitedent Q-6Rolence EnterpriseQ-6手术：紫外灯
发射滤光片 510/80 nmChromaET510/80m显微镜
头夹定制参见补充文件记录腔室
红外光源ThorlabsM810L3行为记录
LED投影仪AAXAP2B LED Pico Projector呈现视觉刺激
湿纸巾（Kimwipe）Kimtech Science34155手术：湿润纸巾
电动XY样品台ZaberX-LRM050显微镜
中性密度滤光片（50%透光率）ThorlabsNE203B呈现视觉刺激
Ø1/2" 支杆夹持器ThorLabsPH1.5V手术：炮管用空心管
Ø1/2" 不锈钢光学支杆ThorLabsTR150/M手术：鱼类装载模块
物镜 16倍，0.8NANikonCF175显微镜
油性油泥Ly Hsin ClayC4086手术：头夹固定器
光学胶Norland ProductsNOA68手术：紫外固化胶
光电倍增管HamamatsuH11706P-40显微镜
压电驱动器Physik Instrumente P-725.4CA PIFOC显微镜
普克尔斯盒ConopticsM350-80-LA-BK-02显微镜
红色Wratten滤光片（> 600 nm）Edmund optics#53-699呈现视觉刺激
谐振-检流计扫描系统INSSRGE-02显微镜
用于Ø1/2" 支杆的直角夹ThorLabsRA90/M手术：鱼类装载模块
用于Ø1/2" 支杆的旋转夹ThorLabsSWC/M手术：鱼类装载模块
ScanImageMBF Bioscience基础版本显微镜
半六边形水槽定制参见补充文件记录腔室
Super-Bond C&B KitSun Medical Co.Super-Bond C&B手术：牙科水泥
三卡因甲磺酸盐Sigma AldrichE10521手术：麻醉剂
USB相机FLIRBFS-U3-13Y3M-C行为记录
Vetbond3M1469SB手术：组织胶水

参考文献

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  9. Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  10. Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
  11. Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
  12. Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712(2021).

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