推拿对背根神经节受压痛大鼠模型镇痛作用的研究

摘要

本文介绍了一种采用推拿疗法治疗大鼠背根神经节慢性受压的方法，并提供了一种基于疼痛行为和组织病理学结果评估其疗效的方案。

摘要

神经病理性疼痛是一种常见病症，影响着6.9%–10%的人群，由多种病因引起的神经损伤所致，例如腰椎间盘突出、椎管狭窄和椎间孔狭窄。尽管推拿作为中国传统手法治疗在临床实践中对治疗神经病理性疼痛显示出镇痛效果，但其潜在的神经生物学机制尚不明确。动物模型对于阐明推拿的基本原理至关重要。在本研究中，我们提出了一种针对背根神经节（DRG）受压大鼠的标准化推拿干预方案，该方案包括通过将不锈钢杆插入椎间孔以诱导DRG受压，在受控环境中按照特定的部位、强度和频率参数实施推拿操作，并评估推拿治疗的行为学和组织病理学结果。本文还讨论了该研究的潜在临床意义与局限性，并对未来推拿研究的方向提出了建议。

引言

在临床实践中，常可观察到由各种原因导致神经根受压而引起的神经系统病理性疼痛。这类神经病理性疼痛最典型的形式是腰椎间盘突出症（LDH），其病程常呈持续性、反复发作，且难以治愈。全球约有9%的人口受到LDH的影响，造成重大的社会和经济负担¹。由于人类生产和生活方式的改变，此类神经病理性疼痛的发病率逐年上升，且呈现年轻化趋势²。尽管使用非甾体类镇痛药物，患者的症状仍无法完全缓解。因此，推拿等治疗LDH所致疼痛的替代疗法正受到越来越多的关注。

推拿疗法作为一种腰椎间盘突出症（LDH）的保守治疗方法，被全球多种临床实践指南广泛推荐用于预防和治疗下腰痛^3,4。研究表明，推拿可显著降低LDH患者血清中白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子水平，同时改善患者的疼痛症状及腰椎功能障碍⁵。然而，推拿疗法发挥镇痛作用的具体机制尚不明确。

动物模型是研究由腰椎间盘突出症（LDH）引起的神经病理性疼痛的重要工具⁶。它们可用于行为学评估，以评价推拿疗法的效果，并提供LDH病理生理学的样本。例如，可采集大腿部位背根神经节的样本，以验证背根神经节细胞的变化。背根神经节慢性压迫（CCD）模型常用于评估LDH的病理生理学，因为它可导致背根神经节细胞形态学损伤，这种损伤与临床上椎间盘突出引起的神经压迫所观察到的病理变化一致⁷。

许多学者已针对穴位按压镇痛开展了多项动物实验^8,9,10。然而，在动物模型上实施穴位按压操作时，通常模仿人类的按压方式。穴位按压的治疗效果受施加力的大小、频率和方向等因素影响^11,12,13。若实验缺乏统一的按压标准，如操作的力度、频率和持续时间，可能导致实验结果出现一定偏差。本文介绍了一套基于CCD大鼠特征的穴位按压治疗方案，旨在推动动物模型中穴位按压操作的标准化发展。

方案

本研究在复旦大学神经生物学研究所疼痛实验室完成。所有手术操作和动物处理均经批准，并严格遵循国际疼痛研究协会（LASP）制定的实验动物保护指南。本研究采用清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠，共32只雄性，年龄40–50天，平均体重为220 ± 1.38 g。这些大鼠购自中国科学院上海生命科学研究院实验动物中心。动物饲养于具有独立通风系统的专用动物房内，环境温度控制在（22 ± 1）°C，相对湿度维持在40%–50%。大鼠在笼内可自由获取充足的食物和饮水。实验室动物房采用12小时光照-黑暗循环，以维持大鼠正常的昼夜节律，且由专人定期更换垫料。X射线检查在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院放射科完成。

1. 研究参与者与分组

1. 将32只大鼠随机分为四组：空白对照组（正常对照）、假手术组（sham）、CCD组（慢性背根神经节压迫）和CCD+推拿组（每组8只大鼠）。大鼠在动物饲养设施中自由进食和饮水。
   ​注：空白对照组大鼠不进行任何干预；假手术组大鼠接受与CCD组相同的操作手术，但在L4和L5椎间孔处不植入"L"形不锈钢棒。CCD组大鼠建立完整的慢性背根神经节压迫模型。CCD+推拿组大鼠在CCD手术后第4天开始接受推拿治疗。

2. 建立动物模型

1. 使用异氟烷 对大鼠进行麻醉。当大鼠失去意识（无尾部弹跳反射或后肢屈曲反射）后，用剃刀剃除手术区域的毛发。
   注意： 术前15分钟给予镇痛药物，并皮下注射曲马多20 mg/kg。
2. 将大鼠固定在泡沫板上（参见材料表），使用橡胶带固定其四肢和门齿。用无菌酒精和碘伏交替擦拭准备区域，至少重复3个循环。
3. 插入"L"形探针（参见材料表）。
   1. 使用剪刀逐层切开皮肤、浅筋膜和深筋膜，切口长度为2-3 cm。首先定位髂前上棘，其对应于第五腰椎。然后依次定位第三和第四棘突。
   2. 用有齿镊夹住棘突并提起，使剪刀贴近棘突右侧，剪断附着于棘突右侧的肌肉。
   3. 随后钝性分离附着于椎板外表面的肌肉，直至右侧遇到阻力。此处隆起为关节突关节。同样地，钝性分离关节突关节处的肌肉和筋膜。
      注意：在关节突关节的下外前方，首先触及的横突指向大鼠头部方向。横突下方为椎间孔，其中充满神经根及周围软组织，通常不易辨认。
   4. 首先使用"L"形探针确定椎间孔的位置，然后使用一根"L"形不锈钢针（需自制，直径0.4 mm，长度4 mm）插入椎间孔。
   5. 若背根神经节成功受压，大鼠将出现尾部弹跳和后肢屈曲反射。将不锈钢针插入第四和第五腰椎之间的椎间孔。随后逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤（3-0缝线，参见材料表）。
4. 将大鼠置于恒温箱中直至苏醒。苏醒后观察其右后肢功能是否正常。若出现拖行现象，表明手术损伤了运动神经，应弃用该大鼠。若右后肢功能正常，则可继续使用并放入笼中饲养。

3. 推拿疗法

1. 建立舒适的环境：在开始推拿治疗前，将大鼠置于固定装置中适应30分钟，使其适应环境（图1）。该装置可充分暴露大鼠大腿并固定其身体，便于进行推拿操作（参见材料表）。
   注意：治疗室温度应维持在22–26 °C，湿度应保持在40%–50%之间。
2. 推拿标准化：确保治疗师佩戴可监测推拿压力和频率的无线指套，并提供实时反馈数据。首先，根据指套的反馈数据练习推拿，将施加的力量调整至5 N，频率调整至2 Hz。随后在大鼠身上执行相同操作，全程保持力量和频率一致（图2）。
   注意：根据我们先前的研究，计算得出的最佳按压力量为5 N（详见讨论部分）。
3. 确定穴位：选择大鼠右后肢腓肠肌作为推拿区域，具体位置为腓肠肌两头交界处，大致对应于BL57穴¹⁴。
4. 实施推拿：治疗师应面向大鼠大腿后侧，用右上肢固定大鼠右后肢。将拇指垂直置于BL57穴位，前臂与手指协同发力，在施加5 N压力的同时进行有节律的小范围旋转运动（图3）。
5. 治疗过程中，需确保操作反馈的压力和频率与预设值相符。干预从术后第四天开始，每日进行一次推拿，每次15分钟，连续进行18天。

4. 疼痛的行为学检测

注意：行为学测试在建模前、建模后、干预第1天、干预第3天、干预第7天、干预第14天、干预第17天和干预第21天进行。

1. 按照以下步骤进行机械刺激反应阈值（足部回缩阈值，PWT）测定（图4）。
   1. 采用 von Frey 法检测大鼠足部对机械刺激的反应阈值。将大鼠置于一个尺寸为 20 cm × 10 cm × 20 cm 的透明钢化玻璃隔间内，该隔间放置在高度为 40 cm、孔径为 10 mm × 10 mm 的金属丝网架上。保持室温为 23 ± 2 °C，并确保周围环境安静。
   2. 使用电子 von Frey 纤维测定机械回缩阈值（见材料表）。刺激大鼠足底中心区域，直至其出现明显反应，例如抬腿或躲避动作。仪器将自动记录最大压力值（N）。
   3. 对同一大鼠再次刺激前需间隔 15 秒或更长时间。每次刺激持续时间应控制在 5 秒以内，以避免大鼠足部发生触觉敏感化。重复测试五次，直至连续三次测量结果之间的差异小于 10 N。
2. 进行热刺激诱发的足部回缩潜伏期（PWL）测定（图5）。
   1. 采用 Hargreaves 法评估足部回缩潜伏期（PWL）^15,16。将大鼠置于一个由透明钢化玻璃制成的小型测试室中，尺寸为 20 cm × 10 cm × 20 cm，顶部为带通风孔的透明玻璃盖。使用加热板将玻璃盖中央区域加热至 45 °C，并维持温度稳定。
   2. 在行为学测试阶段，每天至少让大鼠在行为学实验室适应 2 小时，以尽量减少环境因素对测试结果的影响。
   3. 正式测试前，先将大鼠置于行为学实验室中 30 分钟，使其适应环境，减少干扰。
   4. 将加热板预热至 45 °C，然后将大鼠的后肢置于加热板上。
   5. 足部回缩潜伏期（PWL）定义为从加热开始至出现足部回缩反射的时间。每次测试中，对同一后肢连续测试三次，取平均值作为该后肢的反应潜伏期。测试结束后，将大鼠放回笼中饲养。

5. 灌注

1. 准备：提前配制0.9%生理盐水溶液和4%多聚甲醛溶液。将生理盐水溶液置于37 °C恒温烘箱中预热，多聚甲醛溶液则储存于4 °C冰箱中备用。
2. 麻醉与通路建立。
   1. 首先向大鼠腹腔注射25%乌拉坦（0.6 mL/100 g，参见材料表），以诱导深度麻醉。待大鼠无趾反射、角膜反射及翻正反射时，将其固定于泡沫板上。
   2. 用剪刀剪开胸骨，逐层切开皮肤和筋膜。剪开膈肌，并剪除两侧肋骨以充分暴露心脏。小心分离心包膜，将肺与心脏分离。
   3. 用镊子牵拉心脏向操作者方向，以暴露主动脉。使针头、左心室与主动脉呈一条直线且处于同一水平面，然后从左心室插入针头进入主动脉，直至在主动脉内可见针头。
   4. 用镊子夹住主动脉及其中的针头，再用剪刀剪开左心耳。此时将有大量血液从左心耳喷出。打开生理盐水阀门并连接注射装置，开始灌注37 °C生理盐水，总量约为150–200 mL。
3. 生理盐水灌注完成后，切换为4%多聚甲醛溶液，在4 °C条件下继续灌注约400 mL。开始多聚甲醛灌注时，用一把镊子夹住大鼠门齿向前牵拉，同时一手握住尾巴向后牵拉，有助于充分伸展脊柱、扩大椎间孔，便于背根神经节（DRG）取材。
4. 灌注过程中，大鼠肝脏、肠系膜及大网膜逐渐变苍白，直至肝脏变硬。随后减慢流速，调节至约每秒2滴，直至完成全部多聚甲醛灌注。

6. 背根神经节采集

注意：灌注后，迅速剪下大鼠脊柱的腰段。通过将两侧髂嵴最高点与L5腰椎棘突相连的定位方法，确定L5和L4椎间孔，并从椎间孔中取出背根神经节。具体采集方法如下：

1. 从脊髓腔入口（胸段脊髓腔）将剪刀插入脊髓腔，剪除两侧椎板，直至完全移除所有椎板，暴露整个脊髓腔。
   注意：剪除椎板时需小心，避免损伤脊髓腔外的脊髓和神经根。
2. 仔细去除脊髓和后纵韧带。分离附着在椎间孔内口的硬脊膜。
3. 使用眼科镊夹住并轻柔拉出呈珍珠状、略带淡黄色的背根神经节。
   注意：由于神经组织脆弱且韧性差，在拉出背根神经节时需控制力度和牵拉方向，切勿使用蛮力。
4. 在拉出背根神经节前，应预先清理其周围软组织，包括硬脊膜和蛛网膜，以利于背根神经节顺利拉出。
5. 将背根神经节置于吸水纸上，用刀片切断轴突，并清除背根神经节表面的血管。
6. 修整后称量背根神经节，将其浸入浓度为4%、温度为4 °C的4%多聚甲醛溶液中固定足够时间，通常约为2–4小时，随后将背根神经节转移至预先配制的10%、20%和30%磷酸盐缓冲蔗糖溶液（4 °C）中进行梯度脱水。

7. 冷冻切片

1. 首先将背根神经节置于 0.01 M PBS 溶液中，振荡 10 分钟后洗去蔗糖溶液。仔细修剪背根神经节两端的轴突纤维。清洁冷冻切片机的冷冻头，并在其上加入最佳切割温度（OCT）包埋剂（参见材料表）。
2. 将冷冻头放置在装有液氮的金属容器表面，待组织完全冻结后取出并修平。随后将冷冻头固定于切片机底座上。背根神经节切片的厚度应为 15 mm。按顺序将切好的薄片排列于木盒中，并置于 -20 °C 冰箱内避光保存。

8. 苏木精和伊红染色

1. 将切片放入二甲苯中 2 分钟，然后依次在 100%、95%、80% 和 70% 的酒精中脱水，每级酒精中各放置 2 分钟。随后将切片放入蒸馏水中 2 分钟，苏木精染液中 1 分钟，自来水冲洗 5 分钟，再在 1% 盐酸酒精溶液中分化 30 秒，接着在饱和碳酸锂溶液中处理 30 秒。
2. 接下来，将切片依次放入蒸馏水和自来水中各 2 分钟，在 0.5% 伊红溶液中染色 5 分钟，用蒸馏水快速冲洗 1 分钟，再分别在 95% 和 100% 酒精中各浸泡两次，每次 2 分钟，随后在含碳酸氢钠的 100% 二甲苯中处理 30 秒，再在二甲苯中更换三次，每次 3 分钟，最后用中性树胶封片（见材料表）。

结果

推拿治疗可帮助降低因CCD造模引起的大鼠机械性和热刺激阈值
经过17天的推拿治疗后，接受推拿治疗的CCD大鼠与未治疗的CCD组在PWT阈值上表现出显著差异（P = 0.021，<0.05）（图6 和 表1）。

接受推拿治疗的CCD组大鼠从治疗开始时痛阈即有所改善，建模后第14天起，CCD组与接受推拿治疗组之间的热痛阈值差异具有统计学意义（P = 0.0047, 0.0056, 0.0049, < 0.01）（图7 和 表2）。

推拿治疗未能改善CCD模型引起的小细胞坏死
根据背根神经节的HE染色结果，接受“L”形不锈钢棒物理压迫处理的CCD组大鼠出现了细胞膜损伤和细胞凋亡（

讨论

本研究团队早期已对推拿手法的参数进行了相关研究。首先，确定推拿手法的作用力强度至关重要。在临床推拿中， practitioners 根据经验及患者的主观感受调整力度，通过沟通达到最佳推拿效果。然而，在动物实验中这种方法不可行。在动物实验中，采用"反应阈值"来定义推拿手法的强度，即根据动物的本能反应判断所施加的推拿力是否合适。Randall¹⁷曾采用该方法研究大鼠炎症模型中的疼痛行为，不同之处在于，Randall 的操作部位为局部炎症区域，而本实验的操作部位为无损伤区域。强力度的推拿手法会使大鼠产生尖叫和逃避反射。该强力度的设定意味着正式实验所用的推拿力强度应小于此强力度。基于150只大鼠在5–25 N范围内最大尖叫和逃避反射压值的分布，其均值和标准差分别为9.93和3.018（图11），我们前期研究计算得出最佳按压力值为5 N。其次，《推拿学》中描述推拿手法的操作频率为120–160次/分钟¹⁸，因此本实验的推拿频率设定为2 Hz。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
"L"型不锈钢棒（长4 mm，直径0.4 mm）	自制	/	用于CCD模型制备
ALMEMO 测量装置	ahlborn	2450-1	机械缩足反射阈值测试
恒温切片机 CM-1900	Leica	1491950C1US	用于样本制备
消毒剂（碘）100 mL/瓶	LIRCON/山东利康	/	用于消毒
一次性无菌注射器 5 mL	上海米沙瓦医疗器械有限公司	/	用于注射
电子显微镜 CX-31	Olympus，日本	BJ002318	用于样本观察
指压力记录仪	苏州长欣光电科技有限公司	CX1003w	用于推拿手法操作
泡沫板（35 cm × 20 cm）	自制	/	为本实验室自制固定大鼠装置
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	用于组织缝合
中性树胶	国药集团化学试剂有限公司	10004160	用于样本制备
多聚甲醛	中国医药集团化学试剂有限公司	/	用于样本制备
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	用于大鼠麻醉
足底测试仪（Hargreaves法），适用于小鼠和大鼠	IITC Life Science	/	缩足反射潜伏期检测
实验用精密电子天平 JY3002	上海精密科学仪器有限公司	/	大鼠称重
大鼠毛发剪刀	Philips	HP6341/00	用于剃除大鼠毛发
大鼠固定器	同济大学（自制）	/	由同济大学自制的装置，可有效固定大鼠并充分暴露其后肢
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	SAKURA	4583	用于样本制备
乌拉坦	中国医药集团化学试剂有限公司	/	用于大鼠麻醉
X射线探测器 XR-600	东莞凯硕电子科技有限公司	/	用于CCD模型检测
二甲苯	上海国药集团	100092	用于样本制备