本文介绍了一种用于制备、解剖、封片和成像活体离体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）三龄幼虫大脑的工作流程，以在生理条件下观察细胞及亚细胞水平的动态过程。
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本文内容
摘要
摘要
果蝇 神经干细胞（以下简称神经母细胞，NBs）进行不对称分裂，一方面自我更新以维持神经母细胞的持续存在，另一方面产生一个正在分化的成神经细胞（ganglion mother cell, GMC），该细胞将再经历一次分裂，生成两个神经元或胶质细胞。对神经母细胞的研究揭示了细胞极性、纺锤体定向、神经干细胞自我更新以及分化过程背后的分子机制。这些不对称细胞分裂易于观察 通过 活细胞成像，使幼虫神经母细胞成为研究活体组织中不对称细胞分裂时空动态的理想模型。当在添加营养成分的培养基中进行适当解剖和成像时，离体脑组织中的神经母细胞可稳定分裂12–20小时。既往报道的方法技术难度较高，对初学者而言可能具有挑战性。本文介绍了一种利用脂肪体补充物制备、解剖、封片及成像活体三龄幼虫脑离体组织的实验方案，并讨论了可能遇到的问题，同时提供了该技术应用的示例。
引言
不对称细胞分裂（ACD）是指RNA、蛋白质和细胞器等亚细胞组分在子细胞之间不均等分配的过程1,2。该过程常见于干细胞，干细胞通过ACD产生具有不同发育命运的子细胞。Drosophila神经母细胞（NBs）进行不对称分裂，产生一个保持干性的NB和一个神经节母细胞（GMC）。GMC进一步分裂，生成分化的神经元或胶质细胞3。在三龄幼虫发育中的大脑中，存在大量进行不对称分裂的NBs，可通过显微镜 readily 观察到。在三龄幼虫阶段，每个中央脑叶中约有100个NBs3,4,5,6。
不对称细胞分裂是一个高度动态的过程。活细胞成像方案已被用于测量和量化细胞极性7,8,9,10、纺锤体定向
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方案
注意：图1 显示了进行本研究所需要的材料。
1. 实验的注意事项与准备工作
- 避免幼虫过度拥挤。
注意：外植幼虫脑组织的质量直接取决于解剖前幼虫的健康状况和质量。因过度拥挤而导致营养不良的幼虫通常会获得质量较低的脑组织30。- 每餐帽皿中幼虫数量不应超过20–30只，以避免营养不良。示例见图2。
- 使用前过滤并分装Schneider培养基。
- 每次解剖前，通过向分装的Schneider昆虫培养基中添加1%牛生长血清（BGS）来配制新鲜的成像和解剖培养基。通常，5 mL的解剖和成像培养基足以满足一次成像实验的需求。
- 使用前将添加了补充成分的培养基恢复至室温（RT）。
- 考虑所需采集影片的时长，并据此调整成像培养基的添加成分、样品固定方式以及显微镜的采集参数。
注意：在仅添加BGS的最优条件下，脑组织中的神经母细胞（NBs）可稳定分裂超过3小时。- 若实验需要更长的成像时间（超过4小时），可在成像培养基中加入幼虫脂肪体组织以支持持续分裂。
注意：脂肪....
- 若实验需要更长的成像时间（超过4小时），可在成像培养基中加入幼虫脂肪体组织以支持持续分裂。
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结果
表达Pins::EGFP和Cherry::Jupiter的中央脑叶神经母细胞的解剖与成像
为展示本方案，对表达UAS驱动的Cherry::Jupiter13以及内源性标记的Pins::EGFP16（w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb）的幼虫，使用多孔成像载玻片并按照所述方案进行为期4小时的成像（图5C、D）。另外，对表达UAS驱动的Cherry::Jupiter13和内源性标记的Miranda::EGFP（w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B）的幼虫，使用膜结合型载玻片进行为期10小时的成像，获得补充数据（图5E、F）。.......
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讨论
本方案概述了一种对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫离体脑组织进行活体成像的方法。在适当的实验条件下，本方案可使离体脑组织保持可观测状态达12至20小时。在样品制备和实验设计过程中需特别注意。如上所述，决定解剖组织质量的最关键因素之一是幼虫的健康状况。为获得尽可能高的组织质量，必须确保在收集前幼虫已充分进食。幼虫健康状况不佳通常源于饲养密度过高。为解决这一问题，应尽量减少密度过高情况，可通过提高收获频率，或将新产卵的培养皿与空培养皿分开放置来实现。
该方案的另一个关键环节是解剖方法，用于分离脑组织。脑组织及其内部的神经母细胞（NBs）对外界因素极为敏感，例如解剖介质的温度以及解剖操作本身的侵入性。过冷的介质容易导致微管解聚。同样，若解剖过程中拉伸或破裂脑组织，将对神经母细胞的质量产生不利影响。为避免此类情况，应避免直接牵拉脑组织，而应将解剖工具固定在表皮或其他组织上进行操作。微型解剖剪在此方面具有显著优势，因其对脑组织的牵拉作用极小。若无解剖剪，可使用镊子小心去除腹神经索与表皮之间的连接组织。
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披露
作者无任何财务披露需要声明。
致谢
本研究由 R35GM148160（C. C.）及美国国立卫生研究院（NIH）培训基金 T32 GM007270（R. C. S）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 聚醚砜（PES）膜 | Genesee | 25-231 | 真空驱动滤器 |
| 琼脂 | Genesee | 20-248 | 颗粒状琼脂 |
| 分析用计算机 | Dell | NA | 配备两个 3.80 GHz 处理器的 Intel Xeon Gold 5222 CPU，运行 64 位操作系统的 Windows 10 |
| 牛生长血清 | HyClone | SH30541.02 | |
| 成像用腔室载玻片 | Ibidi | 80826 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | NA | |
| 定制加工金属载片 | NA | NA | 规格见 Cabernard 和 Doe 2013（参考文献 34） |
| 解剖培养皿 | Fisher Scientific | 5024343 | 三孔瓷质微量点板 |
| 解剖镊 | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| 解剖显微镜 | Leica | NA | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| 胚胎收集笼 | Genesee | 59-100 | |
| 带 CO2 接口的 Flypad，用于麻醉成虫果蝇 | Genesee | 59-172 | |
| 透气膜 | YSI | 98095 | 透气膜 |
| 玻璃盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | #1.5；22 mm × 40 mm 玻璃盖玻片 |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | 替代软件：Fiji、Volocity、Aivia |
| Imaris 文件转换器 | Oxford Instruments | NA | |
| 即发干酵母 | Saf-Instant | NA | |
| 糖蜜 | Genesee | 62-117 | |
| 培养皿 | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm × 15 mm 培养皿 |
| 凡士林 | Vaseline | NA | |
| 含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的 Schneider 昆虫培养基液体 | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook 采集软件 | 3i | NA | |
| 带 0.22 µµm PES 膜滤器的真空驱动过滤装置 | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
参考文献
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
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