本文介绍了一种选择性改变脉络丛基因表达的方法，同时避免对大脑其他区域产生任何影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
脉络丛（ChP）在生理和病理条件下均作为免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）的关键门户。近期研究表明，调控脉络丛的活性可能对中枢神经系统疾病具有保护作用。然而，由于脉络丛结构精细，研究其生物学功能而不影响其他脑区仍具挑战性。本研究提出一种利用腺相关病毒（AAVs）或含TAT序列的环化重组酶（Cre）重组蛋白（CRE-TAT）在脉络丛组织中实现基因敲低的新方法。结果显示，将AAV或CRE-TAT注射至侧脑室后，荧光信号仅特异性地集中于脉络丛。利用该方法，研究通过RNA干扰（RNAi）或Cre/loxP位点特异性重组系统成功实现了脉络丛中腺苷A2A受体（A2AR）的基因敲低，并证实该敲低可缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的病理进程。该技术可能对未来研究脉络丛在中枢神经系统疾病中的作用具有重要意义。
引言
脉络丛（ChP）过去常被认为通过分泌脑脊液（CSF）和脑源性神经营养因子（BDNF）来帮助维持大脑功能稳态1,2。过去三十年间越来越多的研究表明，脉络丛是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）的一个独特通路。
脉络丛（ChP）的紧密连接（TJs）由单层脉络丛上皮细胞构成，通过阻止大分子和免疫细胞进入大脑来维持免疫稳态3。然而，在某些病理条件下，脉络丛组织可检测并响应脑脊液和血液中的危险相关分子模式（DAMPs），导致异常的免疫细胞浸润和脑功能障碍4,5。尽管脉络丛具有关键作用，但其体积小且位于脑内特殊位置，使得在不影响其他脑区的情况下研究其功能十分困难。因此，特异性调控脉络丛中的基因表达是理解其功能的理想方法。
最初，通常使用在脉络丛（ChP）特异性基因启动子调控下表达环化重组酶（Cre）的转基因小鼠品系，通过与目标基因两侧带有loxP位点（floxed）的候选基因小鼠杂交，实现对目标基因的删除6,7,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中描述的所有动物实验程序均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》中的规定进行，并经温州医科大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 动物
- 购买8至12周龄、体重20至22 g的雄性C57BL/6小鼠。
- 获取转基因Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato（Ai9）小鼠品系，以及雄性A2ARflox/flox小鼠。
- 将小鼠随机分为两组，每笼最多饲养五只，在标准的12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养1周。
- 为小鼠提供充足的食物和水，并在25 °C的恒定温度下维持饲养。
2. 使用 AAV2/5-shRNA 对 A2AR 进行 ChP 特异性敲低
- 称量每只小鼠并记录数值。
- 用1%戊巴比妥钠按6-8 mL/kg（相当于戊巴比妥60-80 mg/kg）剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉，并将小鼠置于加热垫上以维持体温。
注意：必须根据小鼠体重给予正确剂量的戊巴比妥钠，以确保手术成功。麻醉深度应适中，过深可能导致小鼠死亡，过浅则可能导致小鼠在操作过程....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过脑室内注射 AAV2/5-shRNA 或 CRE-TAT 实现脉络丛特异性 A2AR 基因敲低
A2AR 在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病过程中作为中枢神经系统信息的强大调节因子，其在脉络丛（ChP）中的作用尚不明确。特异性敲低脉络丛中 A2AR 的表达，有助于阐明 A2AR 在 EAE 及其他神经系统炎症中对中枢免疫系统的调节作用。本研究通过脑室内（ICV）注射 CRE-TAT，以降低 A2ARflox/flox 小鼠脉络丛中 A2AR 的表达水平。为验证靶向脉络丛的特异性，我们首先将 CRE-TAT 注射至 Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato（Ai9）小鼠的侧脑室。图像显示，自发性 tdTomato 荧光信号仅局限于脉络丛组织（图 2）。类似地，研究中将 AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-增强型绿色荧光.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该研究提出了两种针对脉络丛（ChP）基因的特异性敲低方法。第一种方法是将含有Cre重组酶的CRE-TAT通过脑室内（ICV）注射到A2ARflox/flox小鼠体内。第二种方法则是通过ICV注射携带A2AR短发夹RNA（shRNA）的AAV2/5病毒。通过采用这两种策略，研究成功实现了在脉络丛中选择性敲低A2AR，并证明了抑制脉络丛中A2AR信号通路对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）病理具有保护作用。值得注意的是，本方案包含两个关键步骤：首先，立体定位操作至关重要，若显著偏离建议坐标，可能导致实验随机失败；其次，注射病毒的体积极为关键，研究发现注射少于1 µL的病毒（约6 × 1012）也存在一定失败风险，这可能是由于需要足够数量的病毒颗粒才能实现充分感染。
使用Cre/LoxP系统无法观察到脑室内注射后CRE-TAT重组酶在脑内的精确定位分布。因此，研究采用Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato小鼠，通过tdTomato蛋白.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在需要披露的相互竞争的经济利益或其他信息。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（项目编号：31800903，授予 W. Zheng）和温州市科技项目（项目编号：Y2020426，授予 Y. Y. Weng）对本工作的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A2ARflox/flox 小鼠 | 眼视光学和视觉科学国家重点实验室，温州医科大学 | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA 病毒 | 上海贺源生物技术有限公司 | pt-4828 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | 碧云天生物技术 | 0100-01 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 北京美亚先科技有限公司 | B100-50-10 | |
| 脑立体定位仪 | RWD，深圳 | 69100 | |
| C57BL/6 小鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | ||
| CRE-TAT 重组酶 | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | 贝克顿·迪金森公司 | 231141 | |
| Hamilton 注射器 | Hamilton，美国 | P/N: 86259 | |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma | F5506 | |
| 激光共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | 苏州强耀生物科技有限公司 | 4010006243 | |
| OCT 包埋胶 | Epredia | 6502p | |
| 多聚甲醛 | 成都科龙化工试剂公司 | 30525-89-4 | |
| 戊巴比妥钠 | 博云生物 | PC13003 | |
| 移液枪 | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA 合成试剂盒 | Takara | 6110A | |
| 实时荧光定量 PCR 系统 | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato 小鼠 | Jackson 实验室 | ||
| 蔗糖 | 生工生物 | A502792-0500 | |
| 超高速匀浆器 | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| 二甲苯溶液 | 成都科龙化工试剂公司 | 1330-20-7 |
参考文献
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
