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方法文章

脉络丛中基因的靶向敲低

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DOI：

10.3791/65555

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2023年6月16日

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1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Rehabilitation Medicine Center, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4Integrative & Optimized Medicine Research Center, China-USA Institute for Acupuncture and Rehabilitation, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种选择性改变脉络丛基因表达的方法，同时避免对大脑其他区域产生任何影响。

摘要

脉络丛（ChP）在生理和病理条件下均作为免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）的关键门户。近期研究表明，调控脉络丛的活性可能对中枢神经系统疾病具有保护作用。然而，由于脉络丛结构精细，研究其生物学功能而不影响其他脑区仍具挑战性。本研究提出一种利用腺相关病毒（AAVs）或含TAT序列的环化重组酶（Cre）重组蛋白（CRE-TAT）在脉络丛组织中实现基因敲低的新方法。结果显示，将AAV或CRE-TAT注射至侧脑室后，荧光信号仅特异性地集中于脉络丛。利用该方法，研究通过RNA干扰（RNAi）或Cre/loxP位点特异性重组系统成功实现了脉络丛中腺苷A2A受体（A2AR）的基因敲低，并证实该敲低可缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的病理进程。该技术可能对未来研究脉络丛在中枢神经系统疾病中的作用具有重要意义。

引言

脉络丛（ChP）过去常被认为通过分泌脑脊液（CSF）和脑源性神经营养因子（BDNF）来帮助维持大脑功能稳态1,2。过去三十年间越来越多的研究表明，脉络丛是免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）的一个独特通路。

脉络丛（ChP）的紧密连接（TJs）由单层脉络丛上皮细胞构成，通过阻止大分子和免疫细胞进入大脑来维持免疫稳态3。然而，在某些病理条件下，脉络丛组织可检测并响应脑脊液和血液中的危险相关分子模式（DAMPs），导致异常的免疫细胞浸润和脑功能障碍4,5。尽管脉络丛具有关键作用，但其体积小且位于脑内特殊位置，使得在不影响其他脑区的情况下研究其功能十分困难。因此，特异性调控脉络丛中的基因表达是理解其功能的理想方法。

最初，通常使用在脉络丛（ChP）特异性基因启动子调控下表达环化重组酶（Cre）的转基因小鼠品系，通过与目标基因两侧带有loxP位点（floxed）的候选基因小鼠杂交，实现对目标基因的删除6,7,8。例如，转录因子Forkhead box J1（FoxJ1）仅在小鼠胚胎脑的脉络丛上皮中表达7，因此FoxJ1-Cre品系常被用于删除位于脉络丛中的基因6,9。然而，该策略的成功高度依赖于启动子的特异性。随着研究深入发现，FoxJ1的表达模式并不足够特异，因其在脑部其他区域及外周系统的纤毛上皮细胞中也有表达7。为克服这一局限，研究人员采用向脑室（intra-cerebroventricular, ICV）注射Cre重组酶的方法，将重组酶递送至带有loxP位点的转基因小鼠脑室中。该策略显示出高度特异性，表现为tdTomato荧光信号仅出现在脉络丛组织中10,11。然而，该方法仍受限于loxP位点修饰转基因小鼠品系的可获得性。为解决这一问题，研究人员已采用脑室注射腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）的方法，实现对脉络丛特异性基因的敲低或过表达12,13。对多种AAV血清型感染脉络丛能力的系统评估表明，AAV2/5和AAV2/8在脉络丛中具有较强的感染能力，且不感染其他脑区。然而，AAV2/8可感染脑室周围室管膜，而AAV2/5组则未见感染现象14。该方法的优势在于可克服获取loxP位点修饰转基因动物的限制。

本文介绍了一种利用两种方法在脉络丛（ChP）中进行基因敲低的分步实验方案：一是通过脑室内注射（ICV）携带腺苷A2A受体（A2AR）shRNA的AAV2/5病毒，二是使用含有TAT序列的Cre重组酶蛋白（CRE-TAT）来实现脉络丛特异性的A2AR基因敲低。研究结果表明，在脉络丛中敲低A2AR可缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该详细实验方案为脉络丛功能研究及在脉络丛中特异性敲低基因提供了有价值的指导。

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方案

本研究中描述的所有动物实验程序均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》中的规定进行，并经温州医科大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 动物

  1. 购买8至12周龄、体重20至22 g的雄性C57BL/6小鼠。
  2. 获取转基因Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato（Ai9）小鼠品系，以及雄性A2ARflox/flox小鼠。
  3. 将小鼠随机分为两组，每笼最多饲养五只，在标准的12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养1周。
  4. 为小鼠提供充足的食物和水，并在25 °C的恒定温度下维持饲养。

2. 使用 AAV2/5-shRNA 对 A2AR 进行 ChP 特异性敲低

  1. 称量每只小鼠并记录数值。
  2. 用1%戊巴比妥钠按6-8 mL/kg（相当于戊巴比妥60-80 mg/kg）剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉，并将小鼠置于加热垫上以维持体温。
    注意：必须根据小鼠体重给予正确剂量的戊巴比妥钠，以确保手术成功。麻醉深度应适中，过深可能导致小鼠死亡，过浅则可能导致小鼠在操作过程中苏醒，进而影响病毒注射的效果。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度，确保小鼠无反应。
  3. 使用专用小鼠剃毛器修剪麻醉小鼠背部的毛发。
  4. 应用 双眼涂抹眼膏以防干燥，并将小鼠固定于立体定位仪上以固定脑部。用无菌手术巾覆盖动物。
  5. 用碘伏消毒剂和75%酒精对小鼠头颈部皮肤进行三轮彻底消毒，以减少术后感染。然后在小鼠头皮局部涂抹1%利多卡因，显微镜下做一小切口，充分暴露颅骨。
    注意：整个操作过程中均须使用无菌器械。
  6. 准备两支10 µL注射器：一支装有购买的AAV2/5-A2AR-shRNA（滴度：6.27 × 109 vg/µL) 以及另一种购自商业来源的 AAV2/5-Scramble（滴度：6.21 × 109 vg/µL
    注意：使用注射器时，前端需连接玻璃毛细管，通过控制玻璃毛细管的长度，可获得约10 µL的体积范围。
  7. 使用显微镜定位前囟和后囟，并在10 µL注射器上设定坐标点（AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20）图1）。坐标点基于小鼠脑立体定位图谱15.
  8. 在调整后的坐标点处颅骨上钻一个小孔。
    注意：在显微镜下，使用无菌微型钻头在颅骨表面进行钻孔。钻孔后，去除覆盖在脑表面的脑膜，暴露其下的脑实质，以避免损伤血管。此步骤可防止脑膜将玻璃毛细管尖端折断。钻孔的直径应足够大，以使针尖能够顺利进入脑组织。
  9. 注射 2 µL 的 AAV2/5-A2A将R-shRNA病毒注入脑室 通过 以每分钟100 nL的恒定速率进行侧向注射。注射完成后，将针头留置10分钟后再撤出。注意，病毒通过单侧注射给予。
  10. 使用医用生物纤维蛋白胶及时封闭受损皮肤，以防止病毒丢失；若未及时使用胶封闭，拔针后脑脊液可能将病毒冲洗出来。此外，切勿使用棉签擦拭脑脊液，以免造成病毒丢失。
  11. 为促进恢复，将小鼠置于加热垫上以维持其体温在 37.0 ± 0.5 °C，将1%利多卡因局部涂抹于小鼠头皮。在诱导EAE模型前，让小鼠恢复2周，因为此阶段对于AAV2/5-A2AR-shRNA 病毒表达及后续 A2AR 基因沉默

利用Cre/loxP系统对星形胶质细胞特异性敲低A2AR

注意：以下步骤可采用先前所述方法完成。有关详细的注射方法，请参见步骤 2.1-2.11。

  1. 向Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato小鼠的每侧脑室注射2 µL CRE-TAT重组酶作为实验组，对照组注射2 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。采用与上述相同的方法（第2节），向A2ARflox/flox小鼠的每侧脑室注射2 µL CRE-TAT重组酶，并以注射2 µL无菌PBS作为对照组。
  2. 在注射CRE-TAT重组酶2周后，制备冷冻组织切片并进行核染色。详见步骤4.1–4.3。

4. 小鼠经心脏灌注

  1. 以 60–80 mg/kg 剂量的戊巴比妥钠对小鼠进行深度麻醉。通过夹捏脚趾确认麻醉深度，随后进行经心脏灌注，先使用 40 mL 无菌 PBS 溶液，再使用 20 mL 4% 多聚甲醛（PFA）。
    注意：灌注成功的表现为肝脏呈白色；若灌注过程中出现肺部肿大或 PBS 从口腔流出，则提示操作失败。
  2. 迅速取出小鼠脑组织，尽量减少蛋白质降解。
  3. 将小鼠脑组织浸入 4% PFA/PBS 溶液中过夜以进行后固定，随后转移至 30% 蔗糖磷酸缓冲液中，浸泡 72 小时。
    ​注意：必须避免脑组织过度脱水，因此脑组织在蔗糖磷酸缓冲液中不宜放置过久。

5. 冷冻组织切片与染色

  1. 将先前脱水的小鼠脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）胶中，冷冻包埋后的脑组织，并使用滑动式切片机切割厚度为 20 µm 的冠状切片。
  2. 将脑切片置于载玻片上。待切片干燥后，存放于 -20 °C 冰箱中，以备后续实验使用。
  3. 将每张载玻片放入框架盒中，并将框架浸入盛有 PBS 的容器中，彻底清洗载玻片。用 PBS 溶液轻轻冲洗脑切片三次，每次 10 分钟。
    注意：操作时应小心，防止脑切片从载玻片上脱落。
  4. 用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液对脑切片染色 10 分钟。
  5. 用 PBS 溶液冲洗脑切片 5 分钟。
  6. 向脑切片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂。
  7. 在脑切片上加盖盖玻片，用指甲油封固盖玻片边缘，并使用常规荧光显微镜观察切片。

6. EAE 诱导

注意：在注射 shRNA 或 CRE-TAT 重组酶 2 周后进行 EAE 诱导11。

  1. 通过将 2.5 mg 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）与 2 mL PBS 混合，制备水相溶液。通过将结核分枝杆菌（M. tuberculosis，H37Ra）与不完全弗氏佐剂（IFA）混合，制备完全弗氏佐剂（CFA）油相溶液。
  2. 将水相和油相溶液按 1:1 体积比混合。使用三通管剧烈振荡混合物，使其形成油包水乳剂。
    注：三通管也称为三通连接管，是一种可控制液体流向的塑料管，用于充分混合 MOG35-55 与 CFA。
  3. 在冰浴条件下，使用高速匀浆器制备用于 EAE 模型的 MOG 抗原乳剂。
  4. 以相当于 60–80 mg/kg 的戊巴比妥钠剂量（1% 戊巴比妥钠，6–8 mL/kg）对小鼠进行腹腔麻醉。
  5. 将 MOG 抗原乳剂皮下注射至四个不同部位（颈部、背部、左右髋部），每点注射体积为 10 mL/kg，共进行四次注射。
    注：注射位点的选择至关重要，因为不同位点可能对小鼠的发病率和死亡率产生差异性影响。此外，重复注射 MOG 可能导致免疫耐受，因此研究团队选择单次注射方法以避免这一潜在问题。
  6. MOG 注射后立即腹腔注射百日咳毒素（PT），剂量为 5 mg/kg（浓度为 500 ng/mL）。
    注：PT 可增加血脑屏障（BBB）通透性，促进 T 细胞向脑组织浸润。
  7. 48 小时后，以相同剂量再次腹腔注射 PT 溶液。

7. 神经功能缺损评分

  1. 使用评分量表16每日对小鼠进行评估和分级，评分范围为0至15，根据以下神经功能缺损评估EAE的发病率和严重程度：
    尾部：0表示无异常，1表示尾部半瘫，2表示尾部完全瘫痪。
    四肢：0表示无异常，1表示步态虚弱或异常，2表示轻瘫，3表示肢体完全瘫痪。
  2. 对完全瘫痪的四肢瘫痪动物 评分为12分，死亡动物评分为15分。

8. 苏木精-伊红（H&E）染色

  1. 取脱水的小鼠脑组织，将其包埋于熔化的石蜡中。待石蜡块冷却并凝固后备用。
    注意：石蜡块应完全干燥并冷却，以避免组织损伤。
  2. 将小鼠脑石蜡块切成5 µm厚的切片。将石蜡包埋的小鼠脑组织切片置于载玻片上，并在60 °C烘箱中干燥3小时。
  3. 将切片依次浸入二甲苯溶液I中10分钟、二甲苯溶液II中10分钟、100%乙醇I中3分钟、100%乙醇II中3分钟、95%乙醇中3分钟、90%乙醇中3分钟、80%乙醇中3分钟、70%乙醇中3分钟，最后浸入蒸馏水中1分钟。

9. 定量聚合酶链式反应（qPCR）分析

  1. 用 PBS 灌注小鼠后，从脑室中取出脉络丛组织，并用 Trizol 提取 RNA。使用第一链 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。
  2. 使用 Ex Taq SYBR Green 预混液和实时 PCR 系统进行 qPCR 分析。A2AR 引物序列如下：上游引物 - GCCATCCCATTCGCCATCA；下游引物 - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA。

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结果

通过脑室内注射 AAV2/5-shRNA 或 CRE-TAT 实现脉络丛特异性 A2AR 基因敲低
A2AR 在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发病过程中作为中枢神经系统信息的强大调节因子，其在脉络丛（ChP）中的作用尚不明确。特异性敲低脉络丛中 A2AR 的表达，有助于阐明 A2AR 在 EAE 及其他神经系统炎症中对中枢免疫系统的调节作用。本研究通过脑室内（ICV）注射 CRE-TAT，以降低 A2ARflox/flox 小鼠脉络丛中 A2AR 的表达水平。为验证靶向脉络丛的特异性，我们首先将 CRE-TAT 注射至 Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato（Ai9）小鼠的侧脑室。图像显示，自发性 tdTomato 荧光信号仅局限于脉络丛组织（图 2）。类似地，研究中将 AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-增强型绿色荧光...

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讨论

该研究提出了两种针对脉络丛（ChP）基因的特异性敲低方法。第一种方法是将含有Cre重组酶的CRE-TAT通过脑室内（ICV）注射到A2ARflox/flox小鼠体内。第二种方法则是通过ICV注射携带A2AR短发夹RNA（shRNA）的AAV2/5病毒。通过采用这两种策略，研究成功实现了在脉络丛中选择性敲低A2AR，并证明了抑制脉络丛中A2AR信号通路对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）病理具有保护作用。值得注意的是，本方案包含两个关键步骤：首先，立体定位操作至关重要，若显著偏离建议坐标，可能导致实验随机失败；其次，注射病毒的体积极为关键，研究发现注射少于1 µL的病毒（约6 × 1012）也存在一定失败风险，这可能是由于需要足够数量的病毒颗粒才能实现充分感染。

使用Cre/LoxP系统无法观察到脑室内注射后CRE-TAT重组酶在脑内的精确定位分布。因此，研究采用Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato小鼠，通过tdTomato蛋白...

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披露

作者声明不存在需要披露的相互竞争的经济利益或其他信息。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（项目编号：31800903，授予 W. Zheng）和温州市科技项目（项目编号：Y2020426，授予 Y. Y. Weng）对本工作的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A2ARflox/flox 小鼠眼视光学和视觉科学国家重点实验室，温州医科大学
AAV2/5-A2AR-ShRNA 病毒上海贺源生物技术有限公司pt-4828
抗荧光淬灭封片剂碧云天生物技术0100-01
硼硅酸盐玻璃毛细管北京美亚先科技有限公司B100-50-10
脑立体定位仪RWD，深圳69100
C57BL/6 小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司
CRE-TAT 重组酶MilliporeSCR508
DAPIAbsinB25A031
冷冻切片机LeicaCM1950
H37Ra贝克顿·迪金森公司231141
Hamilton 注射器Hamilton，美国P/N: 86259
不完全弗氏佐剂SigmaF5506
激光共聚焦显微镜ZeissLSM900
MOG35-55苏州强耀生物科技有限公司4010006243
OCT 包埋胶Epredia6502p
多聚甲醛成都科龙化工试剂公司30525-89-4
戊巴比妥钠博云生物PC13003
移液枪EppendorfN45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA 合成试剂盒Takara 6110A
实时荧光定量 PCR 系统BioRadCFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato 小鼠Jackson 实验室
蔗糖生工生物A502792-0500
超高速匀浆器IKA3737025
TrizolInvitrogen15596026
二甲苯溶液成都科龙化工试剂公司1330-20-7

参考文献

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