2型糖尿病小鼠的静态力量训练方法

摘要

本方案提供了一种制备小鼠静态训练设备的简单方法。该装置可维持小鼠肢体肌肉的等长收缩，用于验证传统运动干预对2型糖尿病（T2DM）的影响，并为T2DM的临床治疗提供新的运动疗法。

摘要

2型糖尿病（T2DM）的治疗是改善患者健康面临的主要难题之一。运动是T2DM的主要干预手段之一。静力性力量训练是中国传统体育运动的重要形式之一。研究表明，静力性力量训练是干预T2DM的有效临床方法，但目前尚无适用于小鼠静力性训练的实验装置。从临床研究转向基础研究的难点之一在于设计合适的实验设备。为了进一步研究静力性训练干预T2DM的作用机制，本文介绍了一种制作小鼠静力性训练装置的简便方法。该装置具有操作简便、材料廉价、可行性高的优点。依据本方案开展的前期研究已表明，静力性训练可有效降低T2DM小鼠的血糖水平，并改善其骨骼肌细胞的线粒体功能。引入该装置的目的在于推动关于传统运动干预T2DM机制的研究，为运动的量化干预奠定基础。

引言

2型糖尿病（T2DM）是一种以胰岛素抵抗和β细胞功能障碍为特征的慢性疾病，对全球健康构成重大威胁¹。运动是管理2型糖尿病的关键干预手段。大量研究表明，太极拳和八段锦等中国传统锻炼方式能显著改善T2DM患者的血糖水平和生活质量^2,3,4,5。在完成这些动作时，练习者必须在一段时间内保持身体和关节的稳定姿势。这种静态姿势依靠肌肉的静力性收缩来维持，通常被称为静力性力量⁶。

然而，静态力量训练干预在2型糖尿病（T2DM）中的作用机制尚未明确。要回答这一问题，动物实验至关重要。在等长运动过程中，肌肉被激活，长度保持不变，并能安全地达到最大张力⁷。在静态力量训练实验中，需要实验动物完成等长肌肉收缩，并维持这种肌肉收缩状态。如何在小鼠、大鼠及其他实验动物身上实施静态力量训练，已成为研究中的一个难题。首先，动物难以服从指令并按要求收缩肌肉；其次，动物在抵抗负荷时难以维持稳定的姿势，从而无法实现等长肌肉收缩的目的。在让动物按要求训练的同时，还需关注动物福利相关问题，例如减轻其应激与焦虑、最小化疼痛并改善整体状况。本方案涉及一种适用于大鼠的静态训练模型^8,9，本文介绍一种用于小鼠静态训练的简易装置。当小鼠后肢被抬起时，其腹肌会因翻正反射而收缩，前肢则抓住前方的横杆，随后前后肢共同对抗重力产生肌肉收缩。小鼠在抓住短杆后无法移动，使其肌肉处于等长收缩状态。

方案

所有动物实验均经南京中医药大学动物护理与使用委员会批准（许可号：202209A033）。选用8周龄、体重为20 ± 4 g的健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF级。小鼠饲养环境保持12 h光照/12 h黑暗循环，温度为20–22 °C，相对湿度维持在45%–50%。动物可自由进食和饮水。

1. 建立2型糖尿病小鼠模型

1. 先给予小鼠普通饮食喂养1周，使其适应动物中心的新环境。1周后，给予高脂饮食（饲料成分：20.0% 猪油、10.0% 蔗糖、2.5% 胆固醇、1.0% 胆酸、66.5% 常规饲料）喂养4周。
2. 从第1个^st 第5天^th 每周，连续3天每天以35 mg/kg的剂量腹腔注射小鼠链脲佐菌素溶液。用0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液作为溶剂，将10 mg链脲佐菌素粉末配制成1 mL链脲佐菌素溶液。
   注意：溶液配制后应在30分钟内完成注射，使用过程中应避光。
3. 在注射链脲佐菌素溶液后的第5天和第7天随机检测血糖。若动物两次随机血糖水平均高于16.7 mM/L，则判定为成功的2型糖尿病（T2DM）模型。
4. 在首次注射链脲佐菌素溶液后的第8天开始训练干预。

2. 小鼠的分组与处理

1. 采用随机数字表法将T2DM小鼠分为模型组、训练组和二甲双胍组，每组6只小鼠。
2. 对模型组不进行任何干预。
3. 将二甲双胍片研磨成粉末，溶于纯水中，以200 mg/kg的剂量对二甲双胍组小鼠进行每日一次、连续3周的灌胃给药。
4. 训练组小鼠每周一至周五下午进行训练，每天进行30分钟的静态力量训练，每周5天，持续3周。
5. 随机选取6只非T2DM小鼠作为对照组，该组小鼠不进行造模和干预。

3. 制造静态力量训练装置

1. 准备一块厚度为 5 mm、尺寸为 20 cm × 20 cm 的透明亚克力板。使用透明板材以便观察小鼠训练过程。
2. 准备直径为 3 mm 的木棒以及宽度为 1 cm 的胶带卷。使用纸张切割器裁剪出两根 4 cm 长的木棒和四根 1 cm 长的木棒。
3. 用胶带将两根 1 cm 长的短木棒固定在一根 4 cm 长的木棒两端（图 1A）。短木棒应固定在长木棒的同一侧。
4. 将透明板放置在平坦表面上，使用热熔胶枪将两组 1 cm 的短木棒固定在板上。确保 4 cm 长的木棒不与板面接触，在长木棒与板之间预留 2 cm 的间隙以固定小鼠位置（图 1B）。使两根长木棒保持对齐且相互平行，间距为 6 cm（图 1C）。

图1：将木棒组装并固定在透明板上。（A）将1 cm长的木棒用胶带固定在4 cm长木棒的两端。（B）使用热熔胶将1 cm长的木棒与透明板连接，间隙长度为2 cm。（C）两根4 cm长的木棒相距6 cm放置。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠的静态力量训练

1. 剪取两段长度为 15 cm 的毛线。使用活结将每段毛线分别系在小鼠的两个后踝上方（图 2A）。
   注意：弹性绳无法固定小鼠体位，而麻绳会磨损小鼠踝部，因此此处选用无弹性但质地柔软的毛线。
2. 将木板水平放置于桌面上，木棍朝上。小心地将小鼠压在两根长木棍之间，使其头部和尾部与木棍下方的空隙对齐。
3. 将毛线从尾部末端的空隙中穿过，然后调整毛线长度，使小鼠踝部紧贴木棍边缘。
4. 用胶带固定毛线（图 2B）。毛线末端必须牢固固定，否则小鼠可能攀爬松脱的毛线逃脱。应尽可能拉紧毛线，否则小鼠容易挣脱。
5. 将透明板倒置。在透明板两端各放置一个高度相同（15–20 cm）的盒子，使木板在一定高度保持水平。盒子分别位于小鼠头部和尾部的两端。若高度过高，实验者操作不便；若过低，小鼠可能触及桌面。
6. 当木板翻转后，小鼠呈倒挂状态。由于翻正反射，小鼠会蜷缩腹部并伸展前肢以抓握后肢或木棍。此时，在小鼠前方放置一根 20 cm 长的木棍，并小心引导其用前肢抓握该木棍。重复此过程，直至小鼠熟练掌握抓握移动木棍的动作。
7. 利用该木棍引导小鼠前肢移向透明板上另一根 4 cm 长的固定木棍。持续调整木棍角度，使小鼠能够主动抓握板上固定的 4 cm 木棍（图 2C）。
8. 重复前述步骤，直至小鼠因疲劳而无法继续抓握前爪。30 分钟后，大多数小鼠将无法抬起上身或用前肢抓握木棍。
   注意：在实施干预前，需对小鼠进行为期一周的适应性训练。初始训练时间为每天 10 分钟，之后每天增加 5 分钟，直至达到每天 30 分钟。
9. 训练 30 分钟后，立即释放小鼠并解开毛线，以防止因长时间束缚导致足部红肿。
   1. 若训练后小鼠踝部出现皮肤损伤，应立即停止训练，并寻求兽医专业处理，直至踝部恢复健康。
   2. 部分小鼠在训练过程中可能因剧烈挣扎而偶然挣脱。这种情况通常发生在后肢未被牢固固定时。为避免因挣扎造成伤害，训练期间应全程观察小鼠状态。一旦发现后肢固定不牢或小鼠开始挣扎，应立即松开并重新固定。
      注意：既往实验表明，每天倒挂小鼠 30 分钟，每周 5 天，只要及时释放，不会造成踝部磨损¹⁰。小鼠通常在 1–3 次训练中即可学会并适应该训练程序。

图 2：小鼠固定方法。（A）用活结绑住踝关节上方。（B）将绳子末端穿过缝隙并拉紧，然后用胶带固定。（C）小鼠的静态力量训练。请点击此处查看此图的放大版本。

结果

按照上述方案，小鼠的后肢被固定，前肢可自主抓握前方的横杆。较小的活动范围使小鼠保持在相对固定的位置。通过触碰小鼠腹部和腿部的肌肉，可确认其肌肉发生收缩，这与静态力量训练中等长肌收缩状态的要求一致。根据该方案对小鼠进行训练，随着训练次数的增加，有助于小鼠逐渐适应训练过程，并降低其挣扎意愿，从而避免出现逃避性挣扎行为。

对2型糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平的影响
将24只C57BL/6J小鼠随机分为对照组（n=6）和2型糖尿病（T2DM）模型组（n=18）。随后将T2DM小鼠随机分为模型组、训练组和二甲双胍组。对照组不进行造模或干预，模型组小鼠不给予任何干预。训练组小鼠每天进行一次、每次30分钟的静力性力量训练，每周5天，持续3周。二甲双胍组小鼠每天给予200 mg/kg的二甲双胍，连续给药3周。干预3周后的空腹血糖（FBG）结果如图3A所示。由图可知，T2DM模型小鼠的FBG水平显著高于对照组小鼠。接受静力性训练的小鼠FBG水平较模型组显著降低，表明静力性训练对降低T2DM小鼠的空腹血糖...

讨论

静态力量训练可减少脂肪堆积，有助于减轻体重并提高新陈代谢⁸。此外，它还能增强骨骼肌细胞中PGC-1α的表达及线粒体生物合成，从而改善2型糖尿病小鼠的葡萄糖代谢，进而降低血糖水平¹¹。为验证静态训练对2型糖尿病（T2DM）的影响及其作用机制，需开发适用于实验动物的静态训练装置。

本方案介绍了一种用于小鼠静态训练的装置。所需设备（如亚克力板、小木棒、毛线和热熔胶枪）易于获取，制作方法简单便捷，可有效降低实验成本，提高实验的可行性与可重复性。在设计静态训练装置时，如何在训练过程中保持小鼠体位固定是一大挑战。在本方案中，可通过收紧柔软的毛线将小鼠的足部固定在小木棒前端。由于翻正反射，小鼠会将上半身向上弯曲，从而使其前肢能够抓握前方的横杆。横杆较短，限制了前肢的活动范围。经过两到三次适应性训练后，小鼠即可维持稳定的姿势。由于前肢力量有限，小鼠常会松脱横杆，因此实验人员需全程密切观察，及时协助小鼠以前肢抓握横杆，防止其意外受伤。 通过训练，小鼠可每次维持固定姿势1-2分钟，重复多次，直至力...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亚克力板			厚度为5mm的透明亚克力板，尺寸应大于20cm×20cm
盒子			两个相同高度（15~20cm）的盒子
ELISA试剂盒		H203-1-2	南京建成生物工程研究所
热熔胶枪			避免触碰枪头以免烫伤
刀具			无特殊要求
二甲双胍片		1396309	Sigma
剪刀			无特殊要求
木棒			若干直径为3mm的木棒
链脲佐菌素		S0130	Sigma
胶带			无特殊要求
透射电子显微镜（TEM）		HT7700	HITACHI