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利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构

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DOI：

10.3791/65561

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2023年6月30日

 ,  ,  , 
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

通讯作者： Nathan N. Alder <nathan.alder@uconn.edu>

本文内容

摘要

本方案介绍了一种用于培养SH-SY5Y细胞和原代大鼠海马神经元的增殖、分化与染色的工作流程，旨在通过受激发射损耗（STED）显微镜对线粒体超微结构进行可视化与分析。

摘要

线粒体在细胞中发挥多种重要功能，包括能量生成、钙离子调节、细胞凋亡调控以及活性氧的产生。2+ 稳态、脂质生物合成以及活性氧（ROS）的产生。这些线粒体介导的过程在神经元中具有特殊功能，通过协调有氧代谢以满足这些细胞的高能量需求，并调控钙离子（Ca2+ 信号传导、为轴突生长和再生提供脂质，以及调节活性氧（ROS）的产生以支持神经元的发育与功能。因此，线粒体功能障碍是神经退行性疾病的核心驱动因素。线粒体的结构与功能密切相关。其内膜形态复杂，具有称为嵴的结构折叠，容纳多种执行线粒体特征性功能的分子系统。内膜的结构特征属于超微结构，尺寸过小，无法通过传统的衍射极限分辨率显微镜观察。因此，目前关于线粒体超微结构的大多数认识均来源于对固定样品进行的电子显微镜研究。然而，新兴的超分辨率荧光显微技术现已实现低至数十纳米的分辨率，使得在活细胞中可视化超微结构特征成为可能。因此，超分辨率成像技术以前所未有的能力直接呈现线粒体结构的精细细节、纳米尺度的蛋白质分布以及嵴的动态变化，为揭示线粒体与人类健康和疾病之间的联系提供了重要的新见解。本实验方案介绍了利用受激发射损耗（STED）超分辨率显微镜对活体人神经母细胞瘤细胞及原代大鼠神经元中的线粒体超微结构进行成像的方法。该流程分为五个部分：（1）SH-SY5Y细胞系的培养与分化，（2）原代大鼠海马神经元的分离、接种与培养，（3）用于活细胞STED成像的染色步骤，（4）使用STED显微镜进行活细胞STED实验的操作流程 作为参考，以及（5）利用示例提供内膜形态特征测量与定量的分割及图像处理指导。

引言

线粒体是一类起源于内共生的真核细胞器，负责调控多种关键的细胞过程，包括中间代谢和ATP生成、离子稳态、脂质生物合成以及程序性细胞死亡（凋亡）。这些细胞器具有复杂的拓扑结构，包含双层膜系统，从而形成多个亚区室1（图1A）。外线粒体膜（OMM）与细胞质接触，并建立直接的细胞器间连接2,3。内线粒体膜（IMM）是一种能量保存膜，通过维持离子梯度（主要以电膜电位（ΔΨm）形式储存），驱动ATP合成及其他需能过程4,5。IMM进一步分为内边界膜（IBM），其紧贴于OMM，以及由嵴膜（CM）包被的突出结构——线粒体嵴。该膜将最内层的基质区室与嵴内空间（ICS）和膜间隙（IMS）分隔开来。

线粒体具有动态的形态，其形态依赖于由动力蛋白超家族的机械酶所调控的持续且平衡的分裂与融合过程6。融合可增强线粒体之间的连接性并形成网状结构，而分裂则导致线粒体碎片化，并通过线粒体自噬（mitophagy）促进受损线粒体的清除7。线粒体的形态因组织类型8和发育阶段9而异，并受到调控以使细胞能够适应各种因素，包括能量需求10,11和应激刺激12。由于线粒体的标准形态学特征（如网络形成程度（相互连接或碎片化）、周长、面积、体积、长度（长宽比）、圆形度以及分支程度）的尺寸大于光的衍射极限（约200 nm），因此可通过标准光学显微镜进行测量和定量分析13。

嵴的结构决定了线粒体的内部构造（图1B）。嵴形态的多样性大致可分为扁平状（层状或盘状）和管泡状14。所有嵴均通过称为嵴连接（cristae junctions, CJs）的管状或狭缝样结构与内膜（IBM）相连，这些连接可将膜间隙（IMS）与嵴内腔（ICS）以及内膜（IBM）与嵴膜（CM）分隔开来，实现区室化15。嵴形态受内膜（IMM）上关键蛋白复合物的调控，包括：（1）定位于嵴连接处、稳定内膜-外膜（IMM-OMM）接触的线粒体接触位点与嵴组织系统（mitochondrial contact site and cristae organizing system, MICOS）16；（2）调控嵴重塑的视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1, OPA1）GTP酶17,18,19；以及（3）在嵴尖端（cristae tips, CTs）形成稳定寡聚结构的F1FO ATP合酶20,21。此外，内膜富含非双层磷脂，如磷脂酰乙醇胺和心磷脂，有助于稳定高度弯曲的内膜结构22。嵴还具有动态性，在不同代谢状态23,24、不同呼吸底物条件下25、饥饿和氧化应激状态下26,27、细胞凋亡过程中28,29以及衰老过程中30，均可观察到其形态的变化。最近研究表明，嵴可在数秒的时间尺度内发生显著的重塑事件，进一步凸显其动态特性31。嵴的多种特征可被量化，包括单个嵴内部结构的尺寸（如嵴连接宽度、嵴长度和宽度），以及描述单个嵴与其他结构关系的参数（如嵴间间距、嵴相对于外膜的入射角）32。这些可量化的嵴参数与功能呈直接相关性。例如，线粒体ATP的生成水平与嵴的丰度呈正相关，后者可通过嵴密度或归一化于某一结构特征的嵴数量（如单位外膜面积内的嵴数量）来量化33,34,35。由于内膜形态由纳米级结构特征决定，属于线粒体超微结构范畴，因此需要采用分辨率高于光衍射极限的成像技术。如下所述，此类技术包括电子显微镜和超分辨率显微镜（纳米显微技术）。

中枢神经系统（CNS）中的神经元和胶质细胞特别依赖线粒体功能。大脑平均仅占人体总重量的2%，却消耗了全身25%的葡萄糖，并占人体氧气消耗量的20%，因此极易受到能量代谢障碍的影响36。进行性神经退行性疾病（NDs），包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿病（HD）、多发性硬化症（MS）和帕金森病（PD），是迄今为止研究最为广泛的病理类型之一，相关研究涵盖从解析这些疾病的分子基础到探索潜在的治疗性预防和干预手段。NDs与氧化应激增加相关，部分原因来自线粒体电子传递链（ETC）产生的活性氧（ROS）37，同时也与线粒体钙离子调控异常38以及线粒体脂质代谢改变39有关。这些生理变化常伴随明显的线粒体形态缺陷，已在AD40,41,42,43,44、ALS45,46、HD47,48,49、MS50和PD51,52,53中被广泛报道。这些结构与功能缺陷之间可能存在复杂的因果关系。例如，由于嵴的形态有助于稳定氧化磷酸化（OXPHOS）酶复合体54，线粒体ROS不仅由ETC产生，还会进一步破坏ETC所处的结构基础，从而形成正反馈的ROS循环，增强对氧化损伤的易感性。此外，嵴的紊乱已被证实可触发线粒体DNA（mtDNA）释放以及与自身免疫性疾病、代谢性疾病和年龄相关疾病相关的炎症通路55。因此， 对 线粒体结构的分析对于全面理解NDs及其分子机制至关重要。

观察嵴的常用方法包括透射电子显微镜、电子断层扫描、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）以及X射线断层扫描，尤其是冷冻软X射线断层扫描，这些技术已揭示了重要发现，并适用于多种类型的样本56,57,58,59,60。尽管近年来在细胞器超微结构的观测方面取得了进展，但这些方法仍存在局限性，即需要对样本进行固定，因此无法直接捕捉嵴的实时动态。超分辨率荧光显微镜，特别是结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）、光激活定位显微镜（PALM）、膨胀显微镜（ExM）以及受激发射损耗（STED）显微镜，已成为观察需突破传统光学显微镜衍射极限分辨率结构的常用手段。当ExM与其他超分辨率技术联合使用时，结果令人印象深刻，但样本必须固定并染色于凝胶中61。相比之下，SIM、PALM/STORM和STED均已成功应用于活体样本，且近年来新出现的、通常靶向内膜（IMM）的染料为线粒体嵴动态的活体成像提供了新颖而简便的方法62,63,64,65,66。近期用于STED成像的活体染料在亮度和光稳定性方面有所提升，且相较于早期染料，其对内膜（IMM）的特异性靶向能力更高。这些进展使得长期时间序列和z轴层析的超分辨率成像实验成为可能，为线粒体超微结构与动态过程的活细胞分析开辟了新的前景。

本文介绍了利用STED显微技术对经PKmito Orange（PKMO）染料染色的未分化与分化SH-SY5Y细胞进行活细胞成像的实验方案63 提供的SH-SY5Y细胞系是亲本细胞系SK-N-SH经过三次亚克隆得到的衍生细胞系，该亲本细胞系源自转移性神经母细胞瘤的骨髓活检样本67,68,69,70该细胞系是常用的 体外 在神经退行性疾病（ND）研究中，特别是在阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）和帕金森病（PD）中，线粒体功能障碍被广泛认为具有重要作用的模型10,43,71,72,73通过调控培养基使SH-SY5Y细胞分化为具有神经元样表型的细胞，已被证实是一种适用于神经科学研究的模型，且无需依赖原代神经元细胞。10,74在本实验方案中，将视黄酸（RA）添加至细胞培养基中，以诱导 SH-SY5Y 细胞的分化。RA 是维生素 A 的衍生物，已被证实可调控细胞周期，并促进调控神经元分化的转录因子的表达。75还提供了一种培养分离自大鼠海马体的神经元并进行活细胞成像的实验方案。研究表明，海马体易受线粒体退化的影响，并与大脑皮层共同在衰老及神经退行性疾病中发挥重要作用。76,77,78,79,80.

方案

1. SH-SY5Y 细胞的传代与分化

  1. 细胞生长与维持用培养基的制备
    1. 配制完全高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L D-葡萄糖，4 mM L-谷氨酰胺，110 mg/L 丙酮酸钠），添加终浓度为1%（v/v）的抗生素-抗真菌素（10,000 单位/mL 青霉素，10,000 µg/mL 链霉素和 25 µg/mL 两性霉素B），以及不同含量的胎牛血清（FBS）（见 材料表）。分化培养基中的FBS终浓度分别为10%、5%或2%（v/v）。
  2. 细胞培养与维持
    1. 将细胞培养于添加了10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2，然后接种于含5% (v/v) 胎牛血清（FBS）的DMEM中以诱导分化。冻存细胞株保存于含10% (v/v) 二甲基亚砜（DMSO）的FBS中，储存密度为1-2 x 107 cells/mL
  3. 视黄酸（RA）的制备
    1. 溶解 7.51 mg 全反式-转-RA（参见 材料表) 溶于 5 mL 新配制的 95% 乙醇中，得到 5 mM 储存液。通过在 350 nm 处测定吸光度（ɛ = 44,300 M⁻¹cm⁻¹）验证浓度。-1 厘米-1），来自制造商说明书中的产品信息表81，使用乙醇中稀释至5 µM的工作液。将5 mM的储备液避光保存于4 °C，可稳定存放长达6周。
  4. 多聚-D-赖氨酸盖玻片包被的制备
    注意：聚-D-赖氨酸（PDL）产品的使用说明可在“文档”部分找到 & 供应商网站的下载部分82，为多种培养容器的包被提供信息。
    1. 本方案中的体积基于面积为 4 cm² 的 2 孔培养皿2 每孔使用带无菌 #1.5 硼硅酸盐盖玻片底的培养板（参见 材料表）。用不含钙、镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将PDL储备液稀释两倍至50 µg/mL。
      注意：#1.5 或 #1.5H 盖玻片的厚度均可接受，这对成像质量至关重要。其他厚度会导致球面像差，应避免使用。
  5. 使用PDL包被盖玻片
    注意：盖玻片可在生物安全柜中暴露于紫外光（UV）下10-15分钟以进一步灭菌。
    1. 在细胞培养柜中，向无菌的腔室盖玻片的每个孔中加入 1.2 mL 浓度为 50 µg/mL 的 PDL 溶液，在室温下孵育 1 小时。移除 PDL 溶液，用 3.6 mL 蒸馏水冲洗三次。最后一次洗涤完成后，将包被好的腔室在空气中晾干 2 小时，随后立即使用，或密封保存于 4 °C 环境中，最多可保存 2 周。
      注意：充分冲洗盖玻片，过量的PDL可能对细胞具有毒性。
  6. 使用RA诱导SH-SY5Y细胞分化
    注意： 不要使用传代次数超过15代的细胞。细胞在达到80%–90%融合度时进行传代。不同诱导分化程序存在差异，但步骤相似。通过进一步使用脑源性神经营养因子（BDNF）处理，可实现从神经母细胞瘤细胞向成熟神经元的额外分化。68,83,84,85，但本方案中未执行此步骤。
    ​可选：在将细胞接种到盖玻片前，至少培养 24 小时。从冻存细胞开始准备时，快速解冻 1 mL 冻存管中的细胞，加入 9 mL 预先温育并补充 10% FBS 的培养基，然后以 350 x g 室温孵育10分钟，弃去上清液以去除DMSO。将细胞沉淀重悬于5 mL预热培养基中，接种至T-25培养瓶。待细胞融合度达到80%–90%时，根据需要进行传代、计数并接种细胞以诱导分化。
    1. 第0天： 种子细胞
      1. 将细胞从冻存管或工作培养瓶接种至腔室盖玻片中，接种密度为 1.5 x 104 细胞/厘米²2.
        ​注意：标准双孔玻底培养皿中的单个孔，直径为4 cm2 培养面积需要 6.0 x 104 细胞。需要保持未分化状态的细胞应接种于添加10%（v/v）FBS的DMEM培养基中，而需要分化的细胞则应接种于添加5% FBS的DMEM培养基中。 (v/v) 胎牛血清
    2. 第1天：开始RA诱导分化处理。
      1. 配制添加5%（v/v）FBS和1% (v/v) 抗生素-抗真菌素，以及终浓度为 10 µM 的 RA 或 加入等量的乙醇作为该分化程序的溶剂对照。移除用于接种的带孔盖玻片中的培养基，用1×PBS冲洗，然后向各孔中加入新的DMEM。
    3. 第3天：将培养基更换为新鲜的含视黄酸（RA）或乙醇的培养基。
      1. 移除第1天的培养基 并更换为新鲜培养基，培养基中添加 2% (v/v) FBS、1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂，以及 10 µM RA 或等体积的 95% 乙醇，后者作为该分化程序的溶剂对照。移除用于接种的腔室载玻片中的培养基，用 1x PBS 洗涤，然后向各孔中加入新的培养基。
    4. 第6天：对细胞进行成像。
      注意：细胞分化时间因实验方案而异，但使用视黄酸处理 SH-SY5Y 细胞六天足以诱导其形成类神经元表型86.
      1. 进行活体成像，具体细节见第3和第4节图2).

2. 大鼠海马神经元原代培养

  1. 大鼠海马神经元分离的材料准备
    1. 配制新鲜的添加物DMEM。
      1. 将DMEM（高糖，不含丙酮酸钠）与10%（v/v）热灭活的FBS、1%（v/v）丙酮酸钠溶液和1%（v/v）青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）混合后经滤器除菌。4 °C保存，最长可保存2周。
    2. 配制新鲜的添加补充剂的神经元生长培养基。
      1. 过滤除菌含有2% (v/v) B27添加剂和0.25% (v/v) 谷氨酰胺补充剂和 1% (v/v) 青霉素-链霉素（见 材料表). 4 °C 下保存，最长可存放 2 周。
  2. 制备原代海马神经元培养
    1. 按照先前发表的研究方法制备原代海马神经元培养87 以及从生产商网站上的产品说明书中获取的分离自E18大鼠海马的材料88 （参见 材料表）。该方案可获得以神经元为主的细胞群体 <2% 星形胶质细胞
      注意：本实验方案后续步骤将使用该组织运输时所用的休眠培养基，请勿丢弃。
    2. 准备组织解离所需的材料和培养基。
      1. 用火焰灼烧巴斯德移液管以缩小其孔径，并用铝箔包裹后保存，防止污染，直至使用。将预先配制的DMEM、1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和神经元生长培养基预热至37 °C。用无菌镊子向15 mL圆锥形离心管中加入2块DNA酶。
    3. 进行组织解离。
      1. 尽可能去除存放解剖所得E18大鼠海马的休眠培养基，再将组织放入含有DNA酶的15 mL圆锥形离心管中，并在37 °C短暂孵育。加入900 µL 1X HBSS，随后加入100 µL 0.5%胰蛋白酶。于37 °C孵育组织15分钟。
        注意：在此孵育期间，可将PDL包被的培养板从储存处取出并放入培养箱中，直至使用。
    4. 进行组织匀浆和细胞计数。
      1. 孵育胰蛋白酶后，弃去培养基，加入1 mL预热的Hibernate培养基-DNA酶（来自前一步骤） 用巴斯德移液管对组织进行匀浆。随着匀浆的进行，培养基会先呈现不透明状，随后逐渐变澄清。
      2. 将解离的神经元加入含有4 mL预热DMEM的新离心管中，然后使用细胞计数仪对细胞进行计数。
    5. 进行原代细胞的铺板与培养。
      1. 以约 1.65 x 10⁵ 个细胞/孔的密度接种细胞4 细胞/厘米²2 在DMEM中。对于2孔腔室盖玻片（4 cm2），每孔接种65,000–70,000个细胞，加入2 mL DMEM。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养2 孵育2小时后检查细胞贴壁情况。一旦细胞开始贴壁，移除1 mL培养基，并加入等体积的Hibernate培养基，轻轻振荡混匀。培养基混匀后，重复此步骤，移除现有培养基的一半，加入等体积的神经元生长培养基，然后轻轻混匀。
        注意：铺板当天记为第0天 体外 （DIV）0，细胞在DIV 7时可用于成像 (图2).

3. 活细胞成像用细胞的制备

注意：不同细胞类型及其来源（例如培养细胞和原代细胞）的染色要求可能存在差异；详见已发表的文献62,63。

  1. PKmito Orange 的制备
    注意：已有文献报道其他通常可染色线粒体内膜（IMM）的染料64,65,66 并且可商业获得。本方案中仅使用 PKMO。
    1. 重悬 PKMO 粉末（参见 材料表按照制造商说明，用DMSO配制89吸弃细胞培养基，用预热的无酚红培养基洗涤细胞。在预热的、含2% (v/v) 胎牛血清的无酚红DMEM培养基中配制PKMO储备液。 或根据分化状态添加10% (v/v)，HEPES 至终浓度为20 mM，以及1% (v/v) 抗生素-抗真菌剂 按照制造商的说明对细胞进行染色前处理。 该配方若不含PKMO，即为活细胞成像培养基。
  2. 使用PKMO对细胞进行染色
    1. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下将细胞与染料共同孵育2, 30分钟 最少用活细胞成像培养基洗涤细胞三次，最后一次洗涤后进行孵育 37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟2.
    2. 加入新鲜的预热活细胞成像培养基。细胞现在可用于成像。
      ​注意：使用急性处理（如药物和/或应激因素）时，应在活体成像前加入；参见讨论部分 补充图1.

4. 通过 STED 显微镜对活细胞进行成像

注意：本实验方案使用基于倒置显微镜构建的受激辐射损耗（STED）系统，系统配置详见材料表。该系统配备脉冲激发激光器（561 nm 激光器，标称功率约 300 µW）和脉冲 775 nm STED 耗尽激光器（标称功率 1.2 W）、连续可调的振镜扫描器，以及基于 615/20 nm 滤光片的雪崩光电二极管探测器（APD）。本实验采用 100 倍/1.40 数值孔径的油浸物镜用于 STED 成像。图像采集使用 Lightbox 软件完成。所提供的所有细节均直接关联该软件及系统配置。

  1. 成像的一般指南与步骤
    1. 使用载物台培养箱或环境控制腔室以维持细胞活性，但短期的室温实验也可接受。这些步骤针对上述STED系统设置而定。
    2. 选择用于成像的激光器和滤光片组合。
      1. 通过从染料列表中选择染色所用的橙色染料，或选择光谱特性最接近所用染料的染料，并通过双击或将染料拖动至标有“将染料拖至此处”的样本列表中，使其生效。
    3. 选择成像区域。
      1. 在概览图像中，通过选择矩形ROI按钮并点击拖动以围绕目标线粒体创建感兴趣区域（ROI）。当鼠标悬停在角落时，可通过出现的ROI角点或弯曲边缘对ROI进行缩放和旋转。
        注：建议的成像参数汇总见表1。这些参数是基于此前报道的该STED系统与染料组合的经验数据进行调整而得63。
    4. 设置门控。
      1. 在常规菜单旁，选择门控菜单，或点击并按住将其添加到视图中。建议将STED探测器门控时间设置为1-1.05至7.8-7.85 ns，如本文所示。门控时间可有所变化，最短可为1-1.05至7-7.05 ns。
    5. 根据样本情况适当调整激光强度。
      注：通常，STED成像所用的激发光功率为共聚焦成像的2-3倍，因此共聚焦成像需要5%激发激光功率的样本，在STED采集时可使用10%-15%的激发激光功率。
      1. 将STED的激发激光设为15%-20%，STED耗尽激光设为20%-25%，并设置10次线扫描累积。像素驻留时间为4 µs，像素大小为20-25 nm。为改善线粒体密集区域的光学切片效果，培养细胞的针孔保持在1.0 AU，原代大鼠海马神经元细胞则为0.7 AU。
        注：可同时采集共聚焦与STED图像以进行并排比较（图3A、B，图4A），或仅采集STED图像。
  2. 时间序列/ z序列的附加信息
    1. 选择时间序列。
      1. 选择时间下拉菜单。定义延时成像所需的迭代次数（本实验使用5次）和时间间隔（本实验使用25或30秒）（图3C、D，图4B）。
        注：如果时间间隔短于采集时间，则迭代将连续进行而无延迟。进行延时成像时，强烈建议启用完美聚焦单元或类似的焦点追踪功能，以避免可能的漂移。
    2. 设置体积范围。
      1. 通过启用体积选项并调节范围的两个端点，按需设置z轴体积范围。本方案中2D成像使用的步长为150-200 nm。针对原始STED图像去卷积所需的奈奎斯特采样要求，推荐的步长可通过在线工具计算得出90。
        ​注：STED耗尽激光功率以及成像平面数量的增加可能导致染料光漂白加剧，并使细胞受到有害水平的光照。采集后应检查是否存在光毒性和光损伤迹象。

5. 线粒体超微结构的处理与分析工具

注意：图像处理（即去卷积）是可选步骤，但在制作和分析用于发表的 STED 图像时通常会使用。为了实现单个嵴的最优分割，强烈建议进行去卷积以提高对比度并降低噪声，如下所述（图 2）。

  1. STED 图像去卷积
    注意：本实验方案中用于去卷积的软件在以下内容中提供 材料表.
    1. 设置显微镜 图像参数。
      注意：确保显微镜元数据已正确输入图像中 显微的 参数包括封片介质的折射率、浸没介质、像素大小、激发波长、发射波长和耗尽波长，以及其他任何相关信息。包含这些参数的模板可被保存以供重复使用。
    2. 使用软件算法对原始STED图像进行解卷积。
      1. 去卷积软件中的自动化去卷积算法可实现无人值守的去卷积图像处理。选择 表达 按钮，并将去卷积类型设置为快速、标准、强效或保守，以实现不同程度的去卷积效果。图中展示了采用强效设置进行快速去卷积的代表性图像（图3, 图4，以及 图5).
      2. 以ICS2格式保存去卷积软件中的图像。
    3. 手动去卷积，请执行以下步骤。
      1. 简而言之，在进行手动去卷积时，应保存去卷积向导模板以确保一致性，并可在启动向导时选择加载已有模板。若已使用成像设置和参数获取点扩散函数（PSF）数据，则应采用实测的PSF信息。
      2. 如有需要，先裁剪原始STED图像，再使用去卷积软件自动稳定图像。去卷积软件包的附加组件可实现特定补偿 可能的成像伪影，例如热漂移和色差。
      3. 接下来，生成一个对数直方图，以手动或自动执行背景扣除。选择经典的最大似然估计（CMLE）反卷积算法。
        注意：进行去卷积时，需调整的关键参数包括信噪比阈值、迭代次数和质量阈值。可对这些参数进行调节，并通过预览去卷积效果来确定最佳设置。
  2. 分割与颗粒分析
    注意：本实验方案使用 FIJI（Is Just ImageJ），一种开源软件（参见 材料表），用于分割和分析。其他可用于此类目的的类似软件包括 CellProfiler、Icy、Ilastik 和 QuPath。
    1. 准备用于分割的图像。
      1. 打开去卷积软件中的 .obf 原始 STED 图像或 .ics2 文件，方法是进入 文件 → 打开 或通过点击并拖动文件至 ImageJ 工具栏。在此之后，可在分割前对图像进行任何有助于分割的预处理操作。
      2. 为保持更改的一致性，请使用记录功能 插件  → 宏  → 记录 并将关键命令复制粘贴到新宏中，从 插件  → 新  → 大体确保在运行宏之前选择要处理的图像。
        注意：用于大小和形状定量的常见可接受图像处理操作包括裁剪、投影 z 层堆栈以及关闭平滑功能的背景减除。同一数据集内的图像应一致地进行处理，并予以说明。
    2. 调整可训练的 Weka 分割设置
      注意：有关使用半自动分割工具及线粒体下游分析的逐步操作说明的更多详细信息已有发表91.
      1. 在可训练的 Weka 分割（Trainable Weka Segmentation，TWS）中打开反卷积后的 STED 图像92 插件，位于下方 插件 → 分割 → 可训练的Weka分割在分割过程中 设置，选择 高斯模糊, 膜突起，以及 索贝尔滤波器 特征。膜厚度默认值为1，膜块大小默认值为19。
      2. 将类别1或类别2标记为 "嵴" 以及另一个作为 "背景" (图2）。模型也可以与 保存分类器 按钮。选择 加载分类器 以在其他图像中重复使用这些设置。
    3. 执行 TWS 类轨迹记录。
      1. 使用线条工具或其他形状来标记部分嵴或背景区域。至少应有一些背景区域的选择包含嵴之间的空隙。在结构上绘制一条线以分配至任一类别，然后选择 添加至 单击右侧的按钮，选择“cristae”或“background”。双击某一条轨迹，可从该标签中移除对应的结构。
    4. 执行TWS分类训练。
      1. 选择 训练分类器 单击左侧按钮，根据提供给插件的信息生成地图。分割类别的叠加显示可通过该按钮切换开启或关闭 切换 覆盖 按钮，且可调节覆盖层的不透明度 设置分类器可以使用额外的标签重新训练。确认无误后，选择 获取概率 按钮。
    5. 测量颗粒。
      1. 使用嵴概率图对图像进行阈值处理以生成掩膜，然后进入 分析 → 分析颗粒通常可以使用默认的阈值类型，并调整范围以确保包含整个嵴结构。通过分析颗粒所得的测量参数可进行调整 分析 → 设置测量参数.
        注意：根据所选测量参数，将测量并显示线粒体嵴的大小和形状参数示例，如面积、周长、圆度和长宽比图2, 图 5A, 补充表1).
      2. 可选：选择与去卷积图像尺寸相同的原始STED图像，并从管理器中应用ROI，然后选择 测量 在 ROI 管理器中获取强度值。
    6. 获取线图。
      1. 从去卷积的STED图像生成线图。绘制多点线，将线宽调整为几个像素以平均化噪声，并对线进行样条拟合以匹配线粒体形态。图2, 图5B生成的线图用于测量峰与峰之间的距离，以报告在特定范围内心嵴的周期性和分布情况。
        注意：类似地，可通过测量线粒体外周来确定给定区域内独立嵴的数量，以此报告嵴密度。线粒体面积可通过将滤镜应用于去卷积后或原始的STED图像以生成掩膜来确定。在测量面积前，需确保掩膜准确贴合线粒体的轮廓。

结果

本方案描述了培养细胞和原代细胞的生长条件，重点用于活细胞STED成像以及后续对线粒体嵴的分析。利用ImageJ对未分化的SH-SY5Y细胞（图3A）和RA诱导分化的SH-SY5Y细胞（图3B）的线粒体进行投影，可通过传统共聚焦显微镜和STED显微镜以z轴层扫形式采集图像，随后对原始STED图像进行去卷积处理。也可进行延时成像并进行后续去卷积（图3C，D）。对于原代大鼠海马神经元，采用略有不同的成像参数（表1），可采集共聚焦和原始STED的z轴层扫图像，并对原始STED图像进行去卷积处理（图4A）。对原代神经元中的线粒体也可进行延时成像（图4B）。总体而言，延时图像应能够展示线粒体的动态事件。

当用于分割的样本原始STED图像与去卷积STED图像的z层投影结果一致时，即可进行定量测量。TWS插件利用去卷积后的STED图像进行分割，生成概率掩膜，进而创建线粒体嵴的二值掩膜，以获取其大小和形态参数（图5A）。该掩膜所定义的区域将保存至ROI管理器中，如有需要，可将其应用于原始STED图像，以测量相对强度的差异。此外，去卷积STED投影图像还可用于分析特定区域内线粒体嵴的周期性与密度（图5B）。

线粒体结构示意图，标注了嵴、基质和膜；用于细胞呼吸研究。
图1：线粒体形态。 线粒体具有双层膜系统，可划分出不同的亚区室（A）。嵴是内膜向内折叠形成的结构，具有特定的形态特征（B）。缩写：OMM，外线粒体膜；ICS，嵴间腔；IMS，膜间隙；CM，嵴膜；IBM，内边界膜；IMM，内线粒体膜；CT，嵴尖端；CJ，嵴连接处。 请点击此处查看此图的放大版本。

使用STED显微镜进行细胞成像的流程图；显示线粒体分析和图像处理步骤。
图2：实验流程示意图。 将SH-SY5Y细胞或原代大鼠海马神经元培养在PDL包被的盖玻片上。SH-SY5Y细胞并行培养，一部分保持未分化状态，另一部分则通过视黄酸（RA）诱导分化，持续六天。原代大鼠海马神经元在从海马组织分离后，接种于PDL包被的盖玻片上培养七天。待细胞准备成像时，使用PKMO染色，并通过STED显微镜进行成像。随后对原始STED图像进行去卷积处理，将去卷积后的图像导入FIJI软件进行分析，以获得大小和形态参数，如嵴密度、面积、周长、圆度和长宽比。请点击此处查看该图的放大版本。

STED 显微成像，共聚焦与 STED 对比，未分化与分化细胞对比，时间序列成像。
图 3：SH-SY5Y 细胞中线粒体的成像。 展示了非分化（A）和 RA 诱导分化（B）的 SH-SY5Y 细胞中经 PKMO 染色的线粒体的代表性共聚焦图像（左）、原始 STED 图像（中）以及 Huygens 去卷积处理后的 STED 图像 z 轴投影（右）。图（C）展示了 RA 诱导分化 SH-SY5Y 细胞的时间序列成像，时间间隔为 30 秒，共 5 次成像，其中选定区域（白色框）被放大显示于图（D），放大图使用无插值缩放的图像。比例尺：A,B，250 nm；C,D，1 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

STED显微镜对比：共聚焦、原始STED、去卷积；随时间变化的结构动态。
图4：大鼠原代海马神经元中线粒体的成像。 展示了来自大鼠原代海马神经元的线粒体代表性共聚焦（左）、原始STED（中）和Huygens去卷积STED（右）图像的z轴投影（A）。展示了这些神经元中线粒体的时间序列图像，时间间隔为25秒，共5次迭代（B）。比例尺：A，250 nm；B，1 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

去卷积过程示意图；包括显微分析、概率图、掩膜、感兴趣区域（ROI）、灰度值。
图5：在ImageJ中处理去卷积后的STED图像。 展示了使用可训练Weka分割插件（Trainable Weka Segmentation plugin）测量线粒体嵴大小和形状的代表性流程（A）。从左至右依次显示：去卷积后的STED图像、基于TWS插件分割生成的概率图、以概率图作为输入在FIJI中进行阈值处理后得到的掩膜、标注出感兴趣区域（ROI）的掩膜，以及将ROI叠加至原始去卷积STED图像的结果。对应这些对象所测得的面积、周长、圆形度和长宽比数据见补充表1。图中还展示了利用去卷积STED图像绘制线图以测量峰-峰间距，作为线粒体嵴密度的读数指标（B）。比例尺：0.5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

像素大小 (nm)停留时间 (µs)扫描线累加STED 采集期间 561 nm 激发功率 (%)775 nm STED 耗尽光功率 (%)步进大小 (nm)针孔大小 (AU)时间序列间隔 (s)时间序列循环次数
未分化的 SH-SY5Y 细胞2041015202001.0305
RA 诱导分化的 SH-SY5Y 细胞20-25410-121520-22150-2001.0305
原代神经元20-2541010252000.7305
注：像素大小可根据成像需求以及是否计划对图像进行去卷积处理而调整。若需进行去卷积，必须满足适当的采样条件。未经去卷积处理的原始 STED 图像像素大小可高达 30 nm。

表1：STED成像参数汇总。 显示了针对每种细胞类型（未分化SH-SY5Y细胞、RA诱导分化的SH-SY5Y细胞以及原代大鼠海马神经元）进行2D STED成像时所使用的设置。所有时间序列成像均采集5次，时间间隔根据ROI大小进行调整。

补充图 1：添加淀粉样蛋白-β（Aβ）的 SH-SY5Y 细胞成像。 显示了经视黄酸（RA）分化的 SH-SY5Y 细胞在添加 PKMO 染料（上排）和 Aβ-HiLyte647（下排）后的代表性共聚焦图像（左）、原始 STED 图像（中）和去卷积 STED 图像（右）（A）。原始 PKMO STED（绿色）与原始 Aβ STED（品红色）的合并 z 轴投影图像（B），以及去卷积后的 PKMO STED（绿色）与去卷积后的 Aβ STED（品红色）的合并 z 轴投影图像（C）也一并展示。比例尺：0.5 µm。请点击此处下载该文件。

补充表 1：分割后嵴的尺寸和形状测量结果。 显示了来自分割线粒体的、对应于图 5A中轮廓对象的面积（µm2）、周长（µm）、圆形度和长宽比的尺寸和形状测量结果。请点击此处下载该文件。

补充表 2：Aβ 样品采集参数汇总。 显示了用于未分化和 RA 分化 SH-SY5Y 细胞中 PKMO 与 Aβ-HiLyte647 进行二维 STED 成像的设置。Aβ-HiLyte647 可单独使用共聚焦成像，因为无需分辨特定结构；此处展示 Aβ-HiLyte647 的 STED 图像旨在呈现更小颗粒的尺寸。请点击此处下载该文件。

补充文件1：淀粉样蛋白-β处理方案。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案介绍了利用人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 和原代大鼠海马神经元，结合新型靶向线粒体内膜（IMM）的 PKMO 染料进行活细胞 STED 成像的方法。由于 PKMO 染料较新，目前尚无大量文献报道其用于活细胞 STED 成像。使用这些细胞类型进行 STED 成像存在挑战，尤其是神经元细胞的线粒体更为纤细。本方案的一个局限性在于所使用的 PKMO 染料可能对细胞具有毒性。不同细胞及细胞系对该染料的反应各异，因此可能需要调整染料浓度和孵育时间，以在获得强信号的同时避免损伤细胞。一种建议的解决方案是降低染料浓度并延长染色时间63；然而，这可能导致染色效果变差，且未必提高细胞存活率。

与PKMO类似，商用染料Live Orange mito（材料表）也表现出一定的细胞毒性。该染料已用于多种培养细胞，但在相同实验参数下，无法在RA诱导分化的SH-SY5Y细胞中实现与其未分化细胞相当的染色效果（我们未发表的观察结果）。然而，针对此探针和特定细胞类型，可能通过优化获得适宜的染色方案。使用该染料时，探测器门控时间设置为1-1.05至7-7.05 ns，其余参数与表1中保持一致。通常情况下，使用200-250 nM的Live Orange mito对细胞染色45分钟，可获得与本文所示PKMO结果相当的效果。较高浓度短时间染色，或较低浓度相同或略长时间染色，可能产生不同结果，可能更适用于其他细胞类型或培养条件。

成像原代大鼠海马神经元与永生化细胞有所不同，这是由于在成像时轴突和树突的投射特性以及线粒体分布存在差异。本实验步骤中的一个难点在于，接种密度决定了原代培养细胞能否良好贴壁和健康生长；而在较高密度下，到体外培养第10天（DIV 10）时，神经突起容易过度生长。因此，从这些原代神经元中所成像的线粒体很可能主要来自胞体而非突起部分；然而，起始细胞密度较低时若培养成功，则在较晚时间点可获得更佳的成像效果。关键在于尽量降低背景荧光和离焦光，以获得最适合受激辐射损耗显微技术（STED）的对比度。为解决细胞群体纯度问题，使用添加B27的神经元生长培养基培养原代海马神经元可抑制胶质细胞的生长，文献报道该方法可有效提高神经元纯度。 <5%的细胞为星形胶质细胞，而在培养基中缺乏NbActiv1添加剂时，培养物中的星形胶质细胞数量减少至 <2%87对于培养的 SH-SY5Y 细胞和原代大鼠海马神经元，用于细胞生长的 PDL 包被会在图像中产生背景雾状干扰。采用文中报告的设置可获得足够的信噪比。表1）且去卷积消除了大部分观察到的背景信号。

除了本文所述的成像方法外，还可在成像前或成像过程中对细胞施加处理或应激刺激。例如，加入tert-丁基过氧化氢（tBHP）可诱导氧化应激，从而可在添加后随时间监测线粒体的动态变化。加入带有荧光标记的淀粉样蛋白-β（Aβ），可实时监测该多肽相对于线粒体的分布及其对线粒体结构的影响。线粒体健康状况在阿尔茨海默病（AD）中具有重要作用，并被广泛认为参与了Aβ的毒性机制43,71,72。值得注意的是，SH-SY5Y细胞的分化状态会影响Aβ前体蛋白（AβPP）的定位85，因此涉及AβPP的实验需谨慎设计。

作为该方案可调整性的一个示例，本文展示了可在成像前15分钟将荧光标记变体Aβ(1-42)-HiLyte 647加入PKMO染色的细胞中（补充图1）。成像参数相似（补充表2），主要区别在于成像较窄的线粒体时需要更小的针孔。使用STED成像Aβ-HiLyte647时，所需的总激发激光功率（6%–8%）和STED耗尽激光功率（10%–12%）较低，且累积次数较少（六次）。探测器门控时间也从0.1 ns延长至10 ns。尽管对Aβ进行STED超分辨成像并非必需，但原始STED图像的整体信噪比和Aβ颗粒尺寸优于共聚焦图像，且后续还可进行去卷积处理。在将Aβ的STED原始图像或去卷积后的STED图像与PKMO染色的原始STED或去卷积STED图像合并时，采集STED图像并对Aβ的原始STED z轴层扫投影进行去卷积显得尤为有用（补充图1B,C）。两个通道均在同一帧步骤中采集。在施加应激处理或其他添加物后，可获得与图2所列类似、并在图5中适用的时间依赖性定位测量结果，以及线粒体嵴结构的差异。

本文未报道但已有其他研究报道的活细胞线粒体STED双标记其他可能方法包括使用SNAP标记蛋白93、Halo标记蛋白，以及使用针对通用靶点的其他细胞通透性染料，例如线粒体DNA（mtDNA）63。值得注意的是，SNAP和Halo标记的标记策略会影响成像时荧光信号的强度和持续时间94。此外，尽管本方案展示了可应用于分割后线粒体的多种分析示例，但软件工具包还可对这些图像执行大量其他类型的分析。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

原代大鼠海马神经元由康涅狄格大学（美国康涅狄格州斯托尔斯）生物医学工程系的George Lykotrafitis博士和Shiju Gu提供。位于开放研究资源与设备中心先进光学显微镜平台的Abberior STED仪器由授予Christopher O'Connell的美国国立卫生研究院（NIH）资助项目S10OD023618购得。本研究由授予Nathan N. Alder的美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01AG065879资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300054
0.4% 台盼蓝InvitrogenT10282
0.5% 胰蛋白酶-EDTA，无酚红Gibco15400054
100 X 抗生素-抗真菌剂Gibco15240062
100 X/1.40 UPlanSApo 油浸物镜Olympus配备于 Olympus IX83 显微镜，用于第 4 节所述的 STED 系统构建
全反式维甲酸SigmaR2625
淀粉样蛋白-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)AnaSpecAS-64161可提供其他荧光偶联物
B27 添加剂（50 X），无血清Gibco17504044
细胞计数仪（Countess II FL）Life TechnologiesAMQAF1000
离心机Eppendorf5804-R
计数载玻片InvitrogenC10283
锥形管（15 mL）Thermo Fisher Scientific339650
比色皿（石英比色皿）Starna Cells, Inc.9-Q-10与分光光度计联用，如第 1.3 节所述
DMEM（高糖含丙酮酸钠）Gibco11995073用于第 1 节所述的 SH-SY5Y 细胞材料
DMEM（高糖不含丙酮酸钠）Gibco11965092用于第 2 节所述的原代细胞材料
DMEM（无酚红）Gibco31053028用于第 3 节所述的成像实验
DMSOSigmaD8418
牛胰脱氧核糖核酸酶 ISigmaDN25用于第 2.2.1 和 2.2.2 节所述的原代细胞材料制备
DPBS（无钙、无镁）Gibco14190144
E18 大鼠海马组织Transnetyx TissueSDEHP
乙醇（200 证明）Fisher BioreagentsBP28184
胎牛血清（FBS），未经热灭活Gibco26140079用于第 1 节中的培养细胞
胎牛血清（经热灭活）Gibco10082147用于第 2 节的原代细胞培养
滤膜除菌装置（0.1 µm，500 mL）Thermo Fisher Scientific5660010
FIJI（即 ImageJ）及可训练 Weka 分割（TWS）插件----免费开源图像分析软件，包含第 5 节所述的 Trainable Weka Segmentation 插件；TWS 插件来源见正文参考文献 90
GlutaMAX 添加剂（100 X）Gibco35050061用于第 2.1.2 节所述原代细胞材料的谷氨酰胺补充剂
Hausser Scientific Bright-Line 和 Hy-Lite 计数板Hausser Scientific267110
HBSS（无钙、无镁）Gibco14170120用于第 2.2.1 和 2.2.2 节所述的原代细胞材料制备
HEPESGibco15630080
Huygens Professional 去卷积软件（V. 20.10）Scientific Volume Imaging (SVI)--本实验方案中使用的去卷积软件，详见第 5 节
配备连续自动对焦功能的 IX83 倒置显微镜Olympus--本文采用基于 Olympus IX83 倒置显微镜构建的 STED Infinity Line 系统，详见第 4 节
Lightbox 软件（V. 16.3.16118）Abberior--用于 STED 图像采集的厂商软件，详见第 4 节
Live Orange Mito 染料AbberiorLVORANGE-0146-30NMOL活细胞成像中用于线粒体靶向的染料，详见讨论部分
Neurobasal 培养基Gibco21103049用于第 2.1.2 节所述的原代细胞材料
Nunc Lab-Tek II 双孔腔室盖玻片Nunc155379可购买多种规格腔室，但需确保盖玻片为 #1.5
巴斯德吸管（Fisherbrand）Thermo Fisher Scientific22183632
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
PKmito Orange 染料SpirochromeSC053
聚-D-赖氨酸GibcoA3890401
SH-SY5Y 细胞系ATCCCRL2266
丙酮酸钠（100 mM）Gibco11360070用于第 2 节所述的原代细胞材料
分光光度计（GENESYS 180 UV-Vis）Thermo Fisher Scientific840309000
STED Expert Line 显微镜Abberior--STED 系统可定制，但在采购时该仪器属于 Abberior’s Expert Line 系列；系统简要描述见实验方案第 4 节
T25 培养瓶（经组织培养处理，带滤膜瓶盖）Thermo Fisher Scientific156367其他培养容器和规格亦可选用

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利用活细胞STED成像技术可视化神经元细胞模型中线粒体内膜的超微结构
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