脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）具有强大的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。本文演示如何分离和培养小鼠AdMSCs及原代混合神经胶质细胞，刺激AdMSCs以使其上调抗炎基因和生长因子，评估AdMSCs的迁移能力，并将AdMSCs与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞进行共培养。
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摘要
摘要
间充质基质细胞（MSCs）通过产生抗炎性细胞因子、趋化因子和生长因子，在炎症调控中发挥重要作用。这些细胞在朊病毒病及其他蛋白质错误折叠相关神经退行性疾病背景下，具有调节神经炎症的能力。朊病毒病可分为散发性、获得性和遗传性；其病因是朊病毒蛋白在脑内发生错误折叠并聚集所致。这类疾病均具有致命性，目前尚无有效治疗方法。
疾病最早期的征兆之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的活化以及相关的炎症反应，这种变化发生在可检测到朊病毒聚集和神经元丢失之前；因此，可利用间充质干细胞（MSCs）的抗炎和调节特性来治疗朊病毒病中的星形胶质细胞增生。近期，我们发现脂肪来源的间充质干细胞（AdMSCs）与BV2细胞或原代混合胶质细胞共培养时，可通过旁分泌信号通路减轻朊病毒诱导的炎症反应。本文介绍了一种利用刺激后的AdMSCs有效减轻朊病毒诱导炎症的可靠治疗方法。
从鼠类脂肪组织中可轻松分离出杂合子群体的脂肪间充质干细胞（AdMSCs），并在体外培养中进行扩增。用炎症性细胞因子刺激这些细胞，可增强其向朊病毒感染的脑组织匀浆迁移的能力，并促进其产生抗炎调节因子。结合这些技术，可用于研究间充质干细胞（MSCs）在朊病毒感染中的治疗潜力，并可进一步适用于其他蛋白质错误折叠及神经炎症性疾病的探索。
引言
胶质细胞炎症在多种神经退行性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病和朊病毒病）中发挥关键作用。尽管异常蛋白聚集被认为是疾病发病机制和神经退行性变的主要原因，但胶质细胞也在加剧这一过程中起到一定作用1,2,3。因此，靶向胶质细胞诱导的炎症是一种有前景的治疗策略。在朊病毒病中，细胞型朊蛋白（PrPC）错误折叠为致病相关朊蛋白（PrPSc），后者形成寡聚体并发生聚集，破坏脑内稳态4,5,6。
朊病毒病最早期的征兆之一是星形胶质细胞和小胶质细胞引发的炎症反应。通过去除小胶质细胞或改造星形胶质细胞来抑制该反应的研究普遍显示，在动物模型中疾病发病机制并未改善，甚至有所恶化7,8,9。因此，调节胶质细胞炎症反应而不完全消除该反应，作为一种治疗策略具有潜在吸引力。
间充质基质细胞（MSCs）因其能够以旁分泌方式调节炎症，已成为多种炎症性疾病的潜在治疗方法10,11。研究表明，MSCs能够迁移至炎症部位，并通过分泌抗炎分子、生长因子、微小RNA等物质，对这些微环境中的信号分子作出响应10,12,13。我们先前已证实，来源于脂肪组织的MSCs（记为AdMSCs）能够向朊病毒感染的脑匀浆迁移，并通过上调抗炎细胞因子和生长因子的基因表达，对该脑匀浆产生响应。
此外，脂肪间充质干细胞（AdMSCs）能够降低BV2小胶质细胞和原代混合胶质细胞中与核因子-κB（NF-κB）、含3号NOD样受体家族pyrin结构域（NLRP3）炎性小体信号通路以及胶质细胞活化相关的基因表达14。本文提供了从小鼠中分离AdMSCs和原代混合胶质细胞、刺激AdMSCs以促进调节性基因上调、评估AdMSCs迁移能力，以及将AdMSCs与朊病毒感染的胶质细胞进行共培养的实验方案。我们希望这些操作流程可为进一步研究间充质干细胞（MSCs）在调控神经退行性疾病及其他疾病中胶质细胞介导的炎症反应中的作用提供基础。
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方案
小鼠在中国科罗拉多州立大学经国际实验动物评估和认可委员会认证的实验动物资源中心繁育和饲养，饲养过程遵循科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准的第1138号协议。
1. 分离原代皮层混合胶质细胞并用朊病毒进行感染
- 为分离包含星形胶质细胞和小胶质细胞的原代混合胶质细胞，获取出生0至2天的C57Bl/6小鼠幼崽。
注意：本方案改编自先前的方案 15,16. - 逐只通过断头法处死幼鼠，取出其脑组织，分离并弃去小脑和脑干。
- 将脑组织置于含有冷 MEM/EBSS 及 2 倍浓度青霉素/链霉素/新霉素（PSN）的 3 cm 培养皿中。在解剖显微镜下分离脑半球，移除并弃去中脑。从大脑皮层中分离并弃去海马和脑膜。
- 将两个大脑半球置于含有5 mL MEM/EBSS + 2x PSN的50 mL锥形管中，并置于冰上。
- 在组织培养罩内，用移液器轻轻吸去50 mL锥形管中的培养基，使皮质组织块留在管底。用包被过的玻璃移液管加入10 mL预热的解离培养基，用玻璃移液管吹打组织10–20次。
- 将悬液转移至含有小磁力搅拌子的50 mL烧杯中，置于磁力搅拌器上以最低转速（约30 rpm）搅拌10分钟。从搅拌器上取下烧杯，倾斜30°静置3分钟，使组织沉降至底部。小心移去细胞悬液（上清液），转移至冰上的新50 mL离心管中。
- 向10 mL解离培养基中加入DNase-I（4,000 U/mL），重悬组织并继续搅拌10分钟。随后更换新鲜解离培养基（不含DNase-I），重复此步骤2–4次（每使用两只小鼠幼崽重复一次），每次将细胞悬液转移至冰上预冷的50 mL锥形管中，直至烧杯底部仅剩纤维状组织。
- 将锥形管中的细胞悬液在1,000 × g条件下离心10分钟 g 在4 °C条件下，吸除上清液，加入胶质细胞生长培养基。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以每平方厘米10个细胞的密度接种细胞。6 在10 cm细胞培养处理皿中。置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。2.
- 24小时后，移除培养基，并更换为新鲜的胶质细胞培养基。培养细胞至2周内达到100%汇合度；随后进行传代并接种用于实验。
- 对于 体外 朊病毒感染，将胶质细胞以每孔100,000个细胞接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到80%–100%。在加入细胞培养物之前，将朊病毒和正常脑组织匀浆用PBS稀释至20%，并暴露于紫外光照射30分钟。吸除待感染胶质细胞的培养基，向每孔加入1.5–2 mL胶质细胞生长培养基，其中含0.1%终浓度的正常或朊病毒脑组织匀浆。
- 72小时后，吸去培养基，用PBS洗涤细胞，以去除任何残留的脑匀浆物。更换为新鲜的胶质细胞生长培养基（不含脑匀浆物）。
- 为了分离AdMSCs细胞，使用 血清移液管和 轻柔地吸取脂肪组织及约1 mL HBSS/胰蛋白酶溶液，转移至含有2 mL DMEM/F12培养基（含200 U/mL DNase-I和400 U/mL胶原酶/中性蛋白酶混合物）的4 cm培养皿中。用小剪刀将脂肪组织块剪成小于5 mm的小片，于37 °C孵育1.5小时。
- 将培养皿中的内容物用移液管转移至50 mL锥形管中，并用移液管反复吹打混合液约10次。确保组织充分分散，形成相对均一的混合物。在4 °C条件下以1,000 × g离心5 min。 g 离心以沉淀基质血管组分，该组分呈红色。
- 小心吸除上清液，用 5 mL 预热的无菌 PBS 重悬沉淀，于 4 °C、1,000 × g 离心 g 孵育3分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL AdMSC培养基中（含L-谷氨酰胺的低糖DMEM，添加15%热灭活胎牛血清（hiFBS）、1%氨基酸、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素-非必需氨基酸混合液（PSN））。
- 将40 µm细胞筛置于新的无菌50 mL锥形管上，用移液器将细胞悬液通过细胞筛过滤，以去除未完全解离的组织。向一个10 cm细胞培养处理皿中加入9 mL AdMSC培养基，并将过滤后的细胞悬液移入培养皿中。置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2.
- 次日更换为新鲜的AdMSC培养基。待细胞融合度达到80–90%时，于72 h至96 h之间进行传代。
- 按照上述方法分离AdMSCs，并传代两次以获得稳定且均一的细胞群体 14用无菌 PBS 洗涤细胞两次，每孔加入 2 mL 预热的胰蛋白酶（0.25%）。于 37 °C 培养 5 分钟，或直至细胞完全从培养板脱落。每孔加入 8 mL 预热的 AdMSC 培养基，吹打混匀细胞悬液，转移至锥形管中，于 1,000 × g 4 °C 离心收集沉淀。
- 将 AdMSCs 重悬于 3–10 mL 培养基中（根据所用培养板数量而定），使用血细胞计数板进行细胞计数。在含 AdMSC 培养基的 6 孔板中，每孔接种 100,000 个细胞。置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。2 过夜。
- 次日，用细胞因子或脑组织匀浆刺激细胞。
- 对于细胞因子刺激的细胞，制备含有10 ng/mL TNFα或200 ng/mL IFNγ的AdMSC培养基。对照孔使用新鲜培养基。
- 对于朊病毒感染脑组织匀浆处理，从终末期感染朊病毒的小鼠（22L 或 RML 菌株）获取 20% 脑组织匀浆（溶于 PBS 中）。将 AdMSC 培养基配制为终浓度 0.1% 的朊病毒感染脑组织匀浆或正常脑组织匀浆（对照组）。
- 吸弃各孔中的培养基，用移液器向对应的孔中加入1.5 mL含细胞因子或脑组织匀浆液的培养基。每组设三个重复孔。将培养板放回培养箱中继续培养。
- 吸弃培养基，用预热的PBS洗涤细胞2次，每孔加入含1% β-巯基乙醇的350 μL裂解缓冲液，使用细胞刮刀收集细胞裂解物。按照小型试剂盒生产商的说明书进行RNA提取，包括DNase消化步骤。对于逆转录-qPCR，每个样本使用25 ng RNA进行逆转录，再以SYBR Green和各基因10 μM的引物扩增cDNA。采用2−ΔΔCt法分析mRNA表达水平。-ΔΔCT 方法并相对于参考基因的表达进行归一化 β-actin 17.
注意：所有实时定量 PCR 均按照 MIQE 指南进行。 - 在6孔板中接种BV2小胶质细胞，每孔50,000个细胞，或接种原代混合胶质细胞，每孔100,000个细胞。次日，用含有0.1%朊病毒感染脑组织匀浆或正常脑组织匀浆的培养基处理BV2细胞。对于混合胶质细胞，需等待细胞融合度达到80–90%时再进行脑组织匀浆感染。
- 将细胞在含有脑匀浆的培养基中孵育72小时。用PBS洗涤细胞2次，以去除残留的脑匀浆，加入新鲜培养基，放回培养箱继续培养。
- 使用第3代AdMSCs进行共培养。如需刺激AdMSCs，使用含10 ng/mL TNFα的培养基处理24小时，再与BV2细胞或混合胶质细胞共培养。刺激后的AdMSCs用PBS洗涤3次，以去除残留的TNFα。
- 按照步骤1.15所述对AdMSCs进行胰蛋白酶消化，并重悬于AdMSC培养基中。
- 离心 AdMSC 悬液，1,000 × g 4 °C 下孵育 5 分钟。在此期间，将 BV2 细胞或混合胶质细胞的培养基更换为每孔 2 mL 的 AdMSC 培养基，并将孔径为 0.4 微米的 6 孔板细胞培养小室插入其中一半的孔中。向每个插入的小室中加入 2 mL AdMSC 培养基，未插入小室的孔则额外添加 2 mL 培养基。
- 完成AdMSCs离心后，将细胞沉淀重悬于AdMSC培养基中。使用血细胞计数板对AdMSCs进行计数，并向每个插入式培养小室中加入50,000–100,000个细胞。
- 对于BV2细胞，共培养孵育24小时；对于混合胶质细胞，孵育时间可短至24小时，最长可达7天。
- 在与AdMSCs共孵育所需时间后，移除插入物并弃去，或将插入物转移至新的6孔板中，用PBS洗涤插入物2次，向混合胶质细胞或BV2细胞中加入RNA提取试剂盒提供的缓冲液，刮取插入物以分析AdMSC的RNA。
- 使用含有10 ng/mL TNFα的培养基处理第2代AdMSCs。次日，用预热的无菌PBS洗涤细胞3次，并在无血清AdMSC培养基中孵育4小时。
- 进行迁移细胞实验时，每个小室中加入25,000个AdMSCs，并在37 °C下孵育24小时。在此期间，迁移细胞将从插入室的上层迁移并通过膜附着于插入室的底侧。小心吸除孔板和插入室内的内容物，用PBS洗涤2次，每孔保留1 mL PBS，以确保插入室两侧保持湿润。
- 使用镊子逐个取出小室，用棉签轻轻但彻底地擦拭上室，以去除未迁移的细胞。吸除残留的 PBS，然后向小室的孔和上室中各加入 500 μL 结晶紫溶液，确保小室膜完全浸没。
- 将插入物在室温下于结晶紫溶液中孵育1小时。为最好地保留颜色，应快速进行下一步操作，每次仅处理一个插入物。
- 吸出小室孔和插入式培养小室上室中的结晶紫溶液，用 PBS 洗涤 3 次。再次用棉签擦拭上室。
- 将插入物置于含有1 mL PBS的新24孔板的一个孔中。将该板放置在配有相机的倒置显微镜上。使用10倍物镜，对插入物中心区域的四个随机位置拍摄图像，仅聚焦于插入物的底面。
- 对每个孔完成上述操作后，将图像上传至选定的图像处理软件，并调整背景以增强与紫色染色细胞的对比度。使用细胞计数器手动计数细胞。
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结果
用TNFα或干扰素-γ（IFNγ）刺激AdMSCs 24小时，可诱导抗炎分子和生长因子表达水平的变化。TNFα或干扰素-γ（IFNγ）处理AdMSCs可上调TNF刺激基因6（TSG-6）mRNA的表达，而仅TNFα（而非IFNγ）可导致转化生长因子β-1（TGFβ-1）mRNA水平升高。TNFα或IFNγ刺激可增加血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达，但对成纤维细胞生长因子（FGF）mRNA的表达无显著影响（图1A）。这些结果提示，AdMSCs同样可响应朊病毒感染脑组织匀浆液中的因子，这类因子可能包括多种细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）18,19,20。我们发现，在含有0.1%正常脑组织匀浆液（NBH）或洛基山实验室（RML）株小鼠适应性羊瘙痒病脑组织匀浆液的培养基中培养AdMSCs 24小时，均可上调TSG-6 mRNA的表...
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讨论
本文展示了一种可靠且相对经济的实验方案，用于评估脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）在胶质细胞模型中减轻朊病毒诱导的炎症反应的作用。AdMSCs 可通过体外培养轻松分离并扩增，仅需约1周时间即可用于实验。该方案可稳定获得一群异质性细胞，通过免疫荧光和流式细胞术检测，这些细胞表达符合间充质基质细胞特征的标志物，并在接触细胞因子或朊病毒感染的脑组织匀浆后仍保持其免疫学功能14。本文所示数据表明，当暴露于上述刺激物时，AdMSCs 会上调抗炎性细胞因子和生长因子的表达。这一特性可用于"激活" AdMSCs，促使其产生有助于减轻炎症反应的分子。使用促炎性细胞因子刺激 AdMSCs 可增强其特定目的基因的表达14,23,24，包括抗炎基因和生长因子如 TSG-6、TGFβ-1 和 VEGF。经朊病毒感染动物的脑组织匀浆处理后，AdMSCs 中...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢实验动物资源中心提供的动物饲养服务。本论文的资助来源包括博特彻基金、墨菲·特纳基金、科罗拉多州立大学兽医学院以及生物医学科学学院研究委员会。图2A、图2C和图3A使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL 血清移液管 | Celltreat | 229005B | |
| 6 孔组织培养板 | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm 细胞培养皿 | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 mL 血清移液管 | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Celltreat | 667050B | |
| BV2 小胶质细胞系 | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| 细胞刮刀 | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| 结晶紫 | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| 分散酶 | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| 必需氨基酸 | Thermo Scientific | 11130051 | |
| 乙醇（100%） | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| 胎牛血清（热灭活） | Peak Serum | PS-FB4 | 可购买已热灭活的产品，也可在实验室中自行灭活 |
| 甲醛 | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| 玻璃 10 mL 血清移液管 | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| 血细胞计数板/纽鲍尔计数室 | Daigger | HU-3100 | |
| 高糖 DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| 含 L-谷氨酰胺的低糖 DMEM | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| 非必需氨基酸 | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| 多聚甲醛（16%） | MP Biomedicals | 219998320 | |
| 青霉素/链霉素/新霉素 | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| 磷酸盐缓冲液 | Cytiva | SH30256.01 | |
| 重组小鼠 IFN-γ 蛋白 | R&D Systems | 485-MI | |
| 重组小鼠 TNF-α（aa 80-235）蛋白，CF 级 | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | 用 Sigmacote 上下抽吸两次，使玻璃移液管内壁充分涂布，然后彻底干燥。用铝箔包裹，并在 24 小时后进行高压灭菌。 |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | 胶原酶/分散酶混合物 |
| 无菌、独立包装的棉签 | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert 组织培养小室，24 孔，孔径 = 8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert 组织培养小室，6 孔，孔径 = 0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
参考文献
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