脂肪来源的间充质基质细胞与原代混合神经胶质细胞共培养以减轻朊病毒诱导的炎症

摘要

脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）具有强大的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。本文演示如何分离和培养小鼠AdMSCs及原代混合神经胶质细胞，刺激AdMSCs以使其上调抗炎基因和生长因子，评估AdMSCs的迁移能力，并将AdMSCs与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞进行共培养。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）通过产生抗炎性细胞因子、趋化因子和生长因子，在炎症调控中发挥重要作用。这些细胞在朊病毒病及其他蛋白质错误折叠相关神经退行性疾病背景下，具有调节神经炎症的能力。朊病毒病可分为散发性、获得性和遗传性；其病因是朊病毒蛋白在脑内发生错误折叠并聚集所致。这类疾病均具有致命性，目前尚无有效治疗方法。

疾病最早期的征兆之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的活化以及相关的炎症反应，这种变化发生在可检测到朊病毒聚集和神经元丢失之前；因此，可利用间充质干细胞（MSCs）的抗炎和调节特性来治疗朊病毒病中的星形胶质细胞增生。近期，我们发现脂肪来源的间充质干细胞（AdMSCs）与BV2细胞或原代混合胶质细胞共培养时，可通过旁分泌信号通路减轻朊病毒诱导的炎症反应。本文介绍了一种利用刺激后的AdMSCs有效减轻朊病毒诱导炎症的可靠治疗方法。

从鼠类脂肪组织中可轻松分离出杂合子群体的脂肪间充质干细胞（AdMSCs），并在体外培养中进行扩增。用炎症性细胞因子刺激这些细胞，可增强其向朊病毒感染的脑组织匀浆迁移的能力，并促进其产生抗炎调节因子。结合这些技术，可用于研究间充质干细胞（MSCs）在朊病毒感染中的治疗潜力，并可进一步适用于其他蛋白质错误折叠及神经炎症性疾病的探索。

引言

胶质细胞炎症在多种神经退行性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病和朊病毒病）中发挥关键作用。尽管异常蛋白聚集被认为是疾病发病机制和神经退行性变的主要原因，但胶质细胞也在加剧这一过程中起到一定作用^1,2,3。因此，靶向胶质细胞诱导的炎症是一种有前景的治疗策略。在朊病毒病中，细胞型朊蛋白（PrP^C）错误折叠为致病相关朊蛋白（PrP^Sc），后者形成寡聚体并发生聚集，破坏脑内稳态^4,5,6。

朊病毒病最早期的征兆之一是星形胶质细胞和小胶质细胞引发的炎症反应。通过去除小胶质细胞或改造星形胶质细胞来抑制该反应的研究普遍显示，在动物模型中疾病发病机制并未改善，甚至有所恶化^7,8,9。因此，调节胶质细胞炎症反应而不完全消除该反应，作为一种治疗策略具有潜在吸引力。

方案

小鼠在中国科罗拉多州立大学经国际实验动物评估和认可委员会认证的实验动物资源中心繁育和饲养，饲养过程遵循科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准的第1138号协议。

1. 分离原代皮层混合胶质细胞并用朊病毒进行感染

1. 为分离包含星形胶质细胞和小胶质细胞的原代混合胶质细胞，获取出生0至2天的C57Bl/6小鼠幼崽。
   注意：本方案改编自先前的方案 ^15,16.
2. 逐只通过断头法处死幼鼠，取出其脑组织，分离并弃去小脑和脑干。
   1. 将脑组织置于含有冷 MEM/EBSS 及 2 倍浓度青霉素/链霉素/新霉素（PSN）的 3 cm 培养皿中。在解剖显微镜下分离脑半球，移除并弃去中脑。从大脑皮层中分离并弃去海马和脑膜。
   2. 将两个大脑半球置于含有5 mL MEM/EBSS + 2x PSN的50 mL锥形管中，并置于冰上。
3. 在组织培养罩内，用移液器轻轻吸去50 mL锥形管中的培养基，使皮质组织块留在管底。用包被过的玻璃移液管加入10 mL预热的解离培养基，用玻璃移液管吹打组织10–20次。
4. 将悬液转移至含有小磁力搅拌子的50 mL烧杯中，置于磁力搅拌器上以最低转速（约30 rpm）....

结果

用TNFα或干扰素-γ（IFNγ）刺激AdMSCs 24小时，可诱导抗炎分子和生长因子表达水平的变化。TNFα或干扰素-γ（IFNγ）处理AdMSCs可上调TNF刺激基因6（TSG-6）mRNA的表达，而仅TNFα（而非IFNγ）可导致转化生长因子β-1（TGFβ-1）mRNA水平升高。TNFα或IFNγ刺激可增加血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达，但对成纤维细胞生长因子（FGF）mRNA的表达无显著影响（图1A）。这些结果提示，AdMSCs同样可响应朊病毒感染脑组织匀浆液中的因子，这类因子可能包括多种细胞因子和损伤相关分子模式（DAMPs）^18,19,20。我们发现，在含有0.1%正常脑组织匀浆液（NBH）或洛基山实验室（RML）株小鼠适应性羊瘙痒病脑组织匀浆液的培养基中培养AdMSCs 24小时，均可上调TSG-6 mRNA的表.......

讨论

本文展示了一种可靠且相对经济的实验方案，用于评估脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）在胶质细胞模型中减轻朊病毒诱导的炎症反应的作用。AdMSCs 可通过体外培养轻松分离并扩增，仅需约1周时间即可用于实验。该方案可稳定获得一群异质性细胞，通过免疫荧光和流式细胞术检测，这些细胞表达符合间充质基质细胞特征的标志物，并在接触细胞因子或朊病毒感染的脑组织匀浆后仍保持其免疫学功能¹⁴。本文所示数据表明，当暴露于上述刺激物时，AdMSCs 会上调抗炎性细胞因子和生长因子的表达。这一特性可用于"激活" AdMSCs，促使其产生有助于减轻炎症反应的分子。使用促炎性细胞因子刺激 AdMSCs 可增强其特定目的基因的表达^14,23,24，包括抗炎基因和生长因子如 TSG-6、TGFβ-1 和 VEGF。经朊病毒感染动物的脑组织匀浆处理后，AdMSCs 中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Cytiva	SH30042.01
5 mL 血清移液管	Celltreat	229005B
6 孔组织培养板	Celltreat	229106
10 cm 细胞培养皿	Peak Serum	PS-4002
10 mL 血清移液管	Celltreat	229210
15 mL 圆锥形离心管	Celltreat	667015B
50 mL 圆锥形离心管	Celltreat	667050B
BV2 小胶质细胞系	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
细胞刮刀	Biologix Research Company	70-2180
结晶紫	Electron Microscopy Sciences	12785
分散酶	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
必需氨基酸	Thermo Scientific	11130051
乙醇（100%）	EMD Millipore	EX0276-1
胎牛血清（热灭活）	Peak Serum	PS-FB4	可购买已热灭活的产品，也可在实验室中自行灭活
甲醛	EMD Millipore	1.04003.1000
玻璃 10 mL 血清移液管	Corning	7077-10N
Hank’s 平衡盐溶液	Sigma Aldrich	H8264-500ML
血细胞计数板/纽鲍尔计数室	Daigger	HU-3100
高糖 DMEM	Cytiva	SH30022.01
含 L-谷氨酰胺的低糖 DMEM	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
非必需氨基酸	Sigma-Aldrich	M7145-100M
多聚甲醛（16%）	MP Biomedicals	219998320
青霉素/链霉素/新霉素	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
磷酸盐缓冲液	Cytiva	SH30256.01
重组小鼠 IFN-γ 蛋白	R&D Systems	485-MI
重组小鼠 TNF-α（aa 80-235）蛋白，CF 级	R&D Systems	410-MT
RNeasy 小量试剂盒	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	用 Sigmacote 上下抽吸两次，使玻璃移液管内壁充分涂布，然后彻底干燥。用铝箔包裹，并在 24 小时后进行高压灭菌。
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	胶原酶/分散酶混合物
无菌、独立包装的棉签	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert 组织培养小室，24 孔，孔径 = 8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert 组织培养小室，6 孔，孔径 = 0.4 µm	Greiner Bio-One	657641