已修改 体内 用于血管生成研究的基质凝胶栓塞实验

摘要

本文所述方法可用于评估试剂对血管生成或血管通透性的影响 体内 无需染色。该方法通过尾静脉注射葡聚糖-FITC以可视化新生血管或血管渗漏。

摘要

已开发出多种模型用于研究血管生成 体内然而，这些模型大多复杂且昂贵，需要专用设备，或难以进行后续的定量分析。本文介绍一种改良的基质凝胶栓塞实验，用于评估血管生成 体内在本实验方案中，将血管细胞与基质凝胶混合，并在存在或不存在促血管生成或抗血管生成试剂的条件下，皮下注射至受体小鼠背部。7天后，经尾静脉注射含葡聚糖-FITC的磷酸盐缓冲液，使其在血管中循环30分钟。收集基质凝胶塞，用组织包埋胶包埋后切取12 µm厚切片，无需染色即可进行荧光检测。在本检测中，高分子量葡聚糖-FITC（约150,000 Da）可用于指示功能性血管并检测其长度，而低分子量葡聚糖-FITC（约4,400 Da）可用于评估新生血管的通透性。综上所述，该方案可为血管生成的定量研究提供一种可靠且便捷的方法 体内.

引言

血管生成是指从已有血管形成新生血管的过程，在多种生理和病理过程中发挥关键作用，例如胚胎发育、伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发展等^1,2,3,4,5。这一动态过程包含多个步骤，包括基质降解、血管细胞增殖、迁移以及自组织形成管状结构，最终实现新生血管的稳定⁶。研究表明，促进血管生成在心肌梗死、中风及其他缺血性疾病治疗中具有重要意义⁷，而抑制血管生成则被视为癌症⁸和类风湿性疾病⁹治疗的潜在策略。血管生成已被视为药物发现的一个核心指导原则¹⁰。因此，建立一种可靠且便捷的方法来评估血管生成的程度，对于血管生成相关疾病的机制研究或药物开发至关重要。

多个 体外 和 在体 已开发出多种模型用于评估血管生成¹¹其中，二维（2-D）模型，如基质凝胶管形成实....

方案

所有涉及动物受试者的实验程序均经温州医科大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（XMSQ2021-0057，7月19日）^th，2021）。所有试剂和耗材均列于下文 材料表.

1. 培养基制备

1. 10倍浓缩M199培养基：将M199粉末溶于90 mL去离子水中至10倍浓度，加入10 mL胎牛血清（FBS），然后经0.22 µm滤膜过滤。将培养基在4 °C保存，最长可保存2个月。
2. 完全内皮细胞培养基：在460 mL内皮细胞培养基（ECM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素和5 mL内皮细胞生长补充剂。将培养基在4 °C保存，最长可保存1个月。

2. 血管细胞制备

1. 在100 mm组织培养皿中，加入8 mL完全内皮细胞培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养1 × 10⁵个血管细胞（原代培养的内皮祖细胞¹⁴、内皮细胞或内皮细胞系），直至细胞融合度达到70%。
2. 移除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿2次，以去除未贴壁的细胞和碎片。吸除PBS后，加入3 mL含2.21 mM ....

结果

图1 是制备基质凝胶、血管细胞、培养基和试剂混合物的流程图。将该混合物皮下注射至裸鼠（Nu/Nu小鼠）背部，并使用加热垫加热以加速其凝固，最终形成凝胶栓。

图2A 是用于识别含有荧光标记葡聚糖血管的流程图。通过尾静脉注射荧光标记的葡聚糖，循环30分钟，使其进入凝胶栓中的功能血管。随后收集凝胶栓，使用组织包埋胶进行包埋（包埋时基质凝胶的方向如图2B所示）。从凝胶栓上切取厚度为12 µm的切片（每侧切取5片），并拍摄荧光图像，用于血管生成和/或血管通透性的定量分析。

图3展示了抗血管生成试剂棕榈酸盐和促血管生成试剂成纤维细胞生长因子1（FGF1）对凝胶栓中血管生成的影响。图3A为对照组、棕榈酸盐处理组或FGF1处理组凝胶栓的外观。血液可.......

讨论

我们提出了一种用于血管生成定量评估的可靠且便捷的方法 体内 未染色。在此方案中，将血管细胞与基质凝胶混合，并加入促血管生成或抗血管生成试剂，随后皮下注射至Nu/Nu小鼠背部以形成凝胶栓图1）。在凝胶栓形成7天后，通过静脉注射dextran-FITC并循环30分钟。收集凝胶栓，用组织包埋胶包埋后切取12 µm厚的切片用于拍照（图2）。葡聚糖-FITC 可用于指示功能性血管而无需染色，新生血管的长度可用于定量评估试剂的促血管生成或抗血管生成功能。在本方案所示示例中，棕榈酸处理缩短了新生血管的长度，而 FGF1 则增加了新生血管的长度（图3），表明棕榈酸具有抗血管生成作用，而 FGF1 具有促血管生成作用。此外，本方案还可用于血管通透性的评估（图 4).

在选择受体小鼠、操作和注射基质胶、收集凝胶塞以及检测血管长度时应格外谨慎。建议使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黏附显微镜载玻片	CITOTEST	188105
麻醉系统	RWD	R640-S1
细胞计数仪	Invitrogen	AMQAX1000
细胞培养皿	Corning	430167
冷冻切片机	Thermo Fisher	CryoStar NX50
荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
包埋盒	CITOTEST	80203-0007
内皮细胞培养基	ScienCell	35809
内皮细胞生长添加剂	ScienCell	1025
胎牛血清	Gibco	10100147C
成纤维细胞生长因子1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
荧光显微镜	Nikon	ECLIPSE Ni
加热垫	Boruida	30-50-30
胰岛素注射器	BD	300841
异氟烷	RWD	R510-22-10
实验室 天平	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	基质胶
199培养基干粉	Gibco	31100-035
微量离心管	Axygen	MCT-150-C
最佳切割温度（OCT）包埋剂	SUKURA	4583	组织包埋胶
棕榈酸	KunChuang	KC001
青霉素-链霉素溶液	Solarbio	P1400
磷酸盐缓冲液	Solarbio	P1022
手术器械	RWD	RWD
尾静脉注射装置	KEW BASIS	KW-XXY
胰蛋白酶-EDTA溶液	Solarbio	T1320
超低温冰箱	eppendorf	U410
血管内皮生长因子	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF