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方法文章

已修改 体内 用于血管生成研究的基质凝胶栓塞实验

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DOI：

10.3791/65567

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2023年6月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所述方法可用于评估试剂对血管生成或血管通透性的影响 体内 无需染色。该方法通过尾静脉注射葡聚糖-FITC以可视化新生血管或血管渗漏。

摘要

已开发出多种模型用于研究血管生成 体内然而，这些模型大多复杂且昂贵，需要专用设备，或难以进行后续的定量分析。本文介绍一种改良的基质凝胶栓塞实验，用于评估血管生成 体内在本实验方案中，将血管细胞与基质凝胶混合，并在存在或不存在促血管生成或抗血管生成试剂的条件下，皮下注射至受体小鼠背部。7天后，经尾静脉注射含葡聚糖-FITC的磷酸盐缓冲液，使其在血管中循环30分钟。收集基质凝胶塞，用组织包埋胶包埋后切取12 µm厚切片，无需染色即可进行荧光检测。在本检测中，高分子量葡聚糖-FITC（约150,000 Da）可用于指示功能性血管并检测其长度，而低分子量葡聚糖-FITC（约4,400 Da）可用于评估新生血管的通透性。综上所述，该方案可为血管生成的定量研究提供一种可靠且便捷的方法 体内.

引言

血管生成是指从已有血管形成新生血管的过程，在多种生理和病理过程中发挥关键作用，例如胚胎发育、伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发展等1,2,3,4,5。这一动态过程包含多个步骤，包括基质降解、血管细胞增殖、迁移以及自组织形成管状结构，最终实现新生血管的稳定6。研究表明，促进血管生成在心肌梗死、中风及其他缺血性疾病治疗中具有重要意义7，而抑制血管生成则被视为癌症8和类风湿性疾病9治疗的潜在策略。血管生成已被视为药物发现的一个核心指导原则10。因此，建立一种可靠且便捷的方法来评估血管生成的程度，对于血管生成相关疾病的机制研究或药物开发至关重要。

多个 体外 和 在体 已开发出多种模型用于评估血管生成11其中，二维（2-D）模型，如基质凝胶管形成实验12，无法形成有功能的管状结构。动物模型，例如后肢缺血模型13,14，能够模拟血管生成过程，但操作复杂，且需要激光散斑血流成像系统。三维血管形态发生模型（如基质凝胶栓塞实验）提供了一个可模拟血管生成过程的简单平台。 体内15，但血管生成的检测需要免疫组织化学或免疫荧光染色16,17,18，这些结构具有变异性且难以清晰观察。

本文介绍了一种改良的基质凝胶栓塞实验方案，其中将血管细胞与基质凝胶混合后皮下注射至小鼠背部，形成凝胶栓。在该凝胶栓内，血管细胞需降解基质、增殖、迁移并自我组装，最终在体内环境中形成具有血流的功能性血管。随后通过尾静脉注射荧光标记的葡聚糖，使其流经凝胶栓，并通过观察荧光信号来显示新生血管。血管生成的程度可通过血管长度进行定量评估。该方法能够形成二维血管生成模型无法产生的功能性血管12，且相较于常规基质凝胶栓塞实验11，无需复杂的染色步骤。此外，该方法也不需要如后肢缺血模型中所需的昂贵专用仪器，例如激光散斑血流成像系统13,14,19。该方法具有通用性强、成本低、可量化及操作简便等优点，可用于评估药物的促血管生成或抗血管生成能力，也可应用于血管生成相关机制的研究。

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方案

所有涉及动物受试者的实验程序均经温州医科大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（XMSQ2021-0057，7月19日）th，2021）。所有试剂和耗材均列于下文 材料表.

1. 培养基制备

  1. 10倍浓缩M199培养基：将M199粉末溶于90 mL去离子水中至10倍浓度，加入10 mL胎牛血清（FBS），然后经0.22 µm滤膜过滤。将培养基在4 °C保存，最长可保存2个月。
  2. 完全内皮细胞培养基：在460 mL内皮细胞培养基（ECM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）、5 mL青霉素/链霉素和5 mL内皮细胞生长补充剂。将培养基在4 °C保存，最长可保存1个月。

2. 血管细胞制备

  1. 在100 mm组织培养皿中，加入8 mL完全内皮细胞培养基，于37 °C、5% CO2条件下培养1 × 105个血管细胞（原代培养的内皮祖细胞14、内皮细胞或内皮细胞系），直至细胞融合度达到70%。
  2. 移除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养皿2次，以去除未贴壁的细胞和碎片。吸除PBS后，加入3 mL含2.21 mM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育1分钟。
  3. 加入7 mL完全内皮细胞培养基以中和胰蛋白酶活性，并轻轻吹打使细胞脱离培养皿表面。在光学显微镜下（40倍放大）确认细胞是否完全脱落。
  4. 将细胞悬液收集至15 mL离心管中，以400 × g离心10分钟。弃去上清液，用5 mL完全内皮细胞培养基重悬细胞沉淀。
  5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，将含有2 × 106个细胞的悬液转移至无菌的1.5 mL离心管中。每个凝胶栓含有1.5 × 106个细胞，额外保留25%的细胞以应对操作损耗。每组实验至少包含3个凝胶栓。
    注意：经过多次试验发现，将1.5 × 106个细胞置于300 µL基质胶中可有效促进血管生成，因此选定该条件用于后续实验。
  6. 将细胞悬液以400 × g离心5分钟以收集细胞沉淀，随后弃去上清液。

3. 基质凝胶制备

  1. 将含有细胞沉淀的无菌 1.5 mL 离心管置于 4 °C 水浴中预冷。将 30G 1 mL 胰岛素注射器置于 4 °C 冰箱中预冷。
  2. 在 4 °C 水浴中完全解冻基质胶，切勿混匀或涡旋震荡。将 10x M199 培养基和待测试剂/目标药物置于 4 °C 水浴中预冷。
  3. 按体积比 8.8:1:0.2 将预冷的基质胶与含有 10% FBS 及待测试剂的 10x M199 混合，得到含 1% FBS 和待测试剂的基质胶与 M199 混合液。
  4. 用 400 µL 基质胶混合液重悬细胞，轻轻混匀以避免产生气泡。将离心管置于冰上，直至小鼠准备好进行注射。基质胶混合液需始终置于冰上，以防止凝固。
    ​注意：此处使用含 1.5 × 106 个细胞的 300 µL 基质胶混合液形成凝胶栓。根据步骤 2 中额外增加 25% 的细胞数量，相应准备多出 25% 的凝胶。

4. 小鼠准备

  1. 使用异氟烷（1 L/min 气流下，3% 异氟烷与 100% 氧气混合）在动物麻醉装置的麻醉舱内对 6–8 周龄雄性 Nu/Nu 小鼠（18–25 g）进行麻醉。确认小鼠翻正反射和脚趾夹捏反射消失，表明麻醉成功后，将小鼠从麻醉舱中取出，为其佩戴麻醉面罩，并将异氟烷浓度调整为 1.5%（100% 氧气，1 L/min 气流）。
    注意：整个操作过程中应使用加热垫为动物提供保温支持。
  2. 在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠四肢朝下固定于手术板上，并用胶带固定四肢。

5. 基质凝胶混合物注射

  1. 用1 mL胰岛素注射器和30G针头吸取300 µL基质凝胶混合物，避免产生气泡。需在2分钟内迅速完成基质凝胶的装载，以防在此期间发生凝固。立即将装有基质凝胶的胰岛素注射器置于冰上。
  2. 使用75%酒精棉片清洁小鼠背部皮肤，然后将300 µL基质凝胶混合物皮下注射至小鼠背部一侧。
  3. 轻柔地从注射部位拔出针头，以防止基质凝胶混合物泄漏。检查注射部位是否形成一个小隆起（图1）。
  4. 将小鼠放置于加热垫上2分钟，使基质凝胶混合物凝固并形成栓塞。
  5. 重复步骤5.2至5.4，在小鼠背部另一侧形成栓塞。使用记号笔标记隆起边缘。
  6. 观察小鼠直至其恢复足够意识以维持胸卧位。将小鼠放入单独的笼子中，直至完全恢复。将小鼠饲养于SPF级实验动物实验室，温度为22 ± 2 °C，光照/黑暗周期为12小时/12小时，持续7天。

6. 通过尾静脉注射葡聚糖-FITC

  1. 在基质胶注射7天后，将0.5 mg的葡聚糖-FITC溶于500 µL双蒸水（ddH2O）中，剧烈涡旋振荡，得到终浓度为1 µg/µL的葡聚糖-FITC溶液。
    注意：进行血管生成检测时，使用分子量约为150 kDa的葡聚糖-FITC；进行血管通透性检测时，使用分子量约为4 kDa的葡聚糖-FITC。
  2. 将50 µL葡聚糖-FITC溶液装入29G注射器中。
  3. 将小鼠固定在尾静脉注射装置上，用75%酒精棉球清洁尾部，然后通过尾静脉缓慢注射50 µL葡聚糖-FITC溶液。
  4. 用棉签按压注射部位1分钟以止血，随后将小鼠放回笼中静置30分钟。
  5. 重复步骤6.3和6.4，直至所有小鼠均完成葡聚糖-FITC注射。

7. 基质凝胶栓收集

  1. 腹腔注射1%戊巴比妥钠PBS溶液（200 mg/kg体重），按照IACUC批准的程序处死小鼠。
  2. 使用手术剪沿基质胶塞标记的边界切开皮肤，并移除覆盖在基质胶塞上方的皮肤。
  3. 收集胶塞，并用盛有1×PBS的小烧杯冲洗，以去除多余的血液（图2A）。胶塞的颜色可大致反映血液丰富程度及新生血管含量（图3A）。

8. 包埋基质凝胶塞及切片制备

  1. 用约 0.5 mL 组织包埋胶覆盖组织包埋盒的按钮部分，然后立即按所需方向将基质胶塞置于组织包埋胶上，如图 2B所示。接着，用额外的组织包埋胶将胶塞完全包埋。
  2. 将包埋盒放入 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 12 小时，使其完全固化。
  3. 进行厚切片制备时，取出已固化的胶塞块，按照说明书使用冷冻切片机切出 12 µm 厚的切片，并将切片贴附于显微镜载玻片上。
  4. 从每个胶塞块上切取 5–10 张切片。

9. 血管生成的定量分析（图3）

  1. 使用倒置荧光显微镜，在10倍放大倍数下、488 nm波长处，从该切片的5个独立视野中获取荧光图像。
  2. 使用Image J软件（https://imagej.en.softonic.com/）打开图像文件，点击Angiogenesis Analyze按钮，然后点击Analyze HUVEC Phase Contrast按钮，并切换至Stat Results Table以收集信息。对每张切片所获取的全部5幅荧光图像进行测量。
  3. 分析不同组别中新形成血管的总长度，以统计学方法评估各组间血管生成的差异。
    ​注意：总主段长度表示新形成血管的总长度。能够增加新形成血管长度的试剂称为促血管生成试剂，而减少新形成血管长度的试剂则称为抗血管生成试剂。

10. 血管通透性的定量分析（图4）

  1. 使用倒置荧光显微镜，在20倍放大倍数下，于488 nm波长处获取组织切片5个独立视野的荧光图像。
  2. 使用Image J软件打开图像文件。点击自由选择按钮，圈出渗漏区域，然后点击分析菜单并选择测量选项，以获取渗漏区域的面积信息。以渗漏区域面积与图像总面积的比值表示血管通透性。
  3. 分析不同组别中渗漏区域面积与图像总面积的比值，以统计学方法评估各组间血管通透性的差异。

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结果

图1 是制备基质凝胶、血管细胞、培养基和试剂混合物的流程图。将该混合物皮下注射至裸鼠（Nu/Nu小鼠）背部，并使用加热垫加热以加速其凝固，最终形成凝胶栓。

图2A 是用于识别含有荧光标记葡聚糖血管的流程图。通过尾静脉注射荧光标记的葡聚糖，循环30分钟，使其进入凝胶栓中的功能血管。随后收集凝胶栓，使用组织包埋胶进行包埋（包埋时基质凝胶的方向如图2B所示）。从凝胶栓上切取厚度为12 µm的切片（每侧切取5片），并拍摄荧光图像，用于血管生成和/或血管通透性的定量分析。

图3展示了抗血管生成试剂棕榈酸盐和促血管生成试剂成纤维细胞生长因子1（FGF1）对凝胶栓中血管生成的影响。图3A为对照组、棕榈酸盐处理组或FGF1处理组凝胶栓的外观。血液可...

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讨论

我们提出了一种用于血管生成定量评估的可靠且便捷的方法 体内 未染色。在此方案中，将血管细胞与基质凝胶混合，并加入促血管生成或抗血管生成试剂，随后皮下注射至Nu/Nu小鼠背部以形成凝胶栓图1）。在凝胶栓形成7天后，通过静脉注射dextran-FITC并循环30分钟。收集凝胶栓，用组织包埋胶包埋后切取12 µm厚的切片用于拍照（图2）。葡聚糖-FITC 可用于指示功能性血管而无需染色，新生血管的长度可用于定量评估试剂的促血管生成或抗血管生成功能。在本方案所示示例中，棕榈酸处理缩短了新生血管的长度，而 FGF1 则增加了新生血管的长度（图3），表明棕榈酸具有抗血管生成作用，而 FGF1 具有促血管生成作用。此外，本方案还可用于血管通透性的评估（图 4).

在选择受体小鼠、操作和注射基质胶、收集凝胶塞以及检测血管长度时应格外谨慎。建议使...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由浙江省自然科学基金（LY22H020005）和国家自然科学基金（81873466）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黏附显微镜载玻片CITOTEST188105
麻醉系统RWDR640-S1
细胞计数仪InvitrogenAMQAX1000
细胞培养皿Corning430167
冷冻切片机Thermo FisherCryoStar NX50
荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖-150kDaWEIHUA BIOWH007N07
荧光素异硫氰酸酯标记葡聚糖-4kDaWEIHUA BIOWH007N0705
包埋盒CITOTEST80203-0007
内皮细胞培养基ScienCell35809
内皮细胞生长添加剂ScienCell1025
胎牛血清Gibco10100147C
成纤维细胞生长因子1AtaGenix9043p-082318-A01FGF1
荧光显微镜NikonECLIPSE Ni
加热垫Boruida30-50-30
胰岛素注射器BD300841
异氟烷RWDR510-22-10
实验室 天平SartoriusBSA124S-CW
MatrigelCorning356234基质胶
199培养基干粉Gibco31100-035
微量离心管AxygenMCT-150-C
最佳切割温度（OCT）包埋剂SUKURA4583组织包埋胶
棕榈酸KunChuangKC001
青霉素-链霉素溶液SolarbioP1400
磷酸盐缓冲液SolarbioP1022
手术器械RWDRWD
尾静脉注射装置KEW BASISKW-XXY
胰蛋白酶-EDTA溶液SolarbioT1320
超低温冰箱eppendorfU410
血管内皮生长因子CHAMOTCM058-5HPVEGF

参考文献

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