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方法文章

大规模培养线虫以研究其集体行为

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DOI：

10.3791/65569

⸱

2023年8月25日

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文报道了一种通过使用狗粮琼脂培养基大规模培养线虫以研究其群体行为的系统。该系统可使研究人员大量繁殖滞育幼虫，并可应用于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）及其他相关物种。

摘要

动物表现出动态的群体行为，例如鸟类的成群飞行、鱼类的结群游动以及人类的群体聚集。动物的群体行为已在生物学和物理学领域得到广泛研究。在实验室中，研究人员使用果蝇和斑马鱼等多种模式动物已有近一个世纪的历史，但要研究由这些遗传上易于操作的模式动物所协调的大规模复杂群体行为，仍然是一个重大挑战。本文介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中建立群体行为实验系统的方法。线虫在培养皿盖上爬行并表现出集体成群行为。该系统还可通过改变湿度和光照刺激来调控线虫的相互作用和行为。通过改变环境条件，并利用突变体研究个体运动对群体行为的影响，该系统有助于揭示群体行为背后的机制。因此，该系统对未来的物理学和生物学研究均具有重要价值。

引言

无论是非科学家还是科学家，都对动物的集体行为（如鸟群和鱼群）充满兴趣。集体行为已在物理学、生物学、数学和机器人学等多个广泛领域中得到分析。其中，活性物质物理是一个快速发展的研究领域，专注于由自驱动单元组成的系统，即耗散系统，例如鸟群、鱼群、运动性细菌形成的生物膜、由活性分子构成的细胞骨架，以及自驱动胶体的群体。活性物质物理理论认为，无论个体行为多么复杂，大量生物的集体运动都受少数几条简单规则支配。例如，Vicsek 模型作为描述自驱动粒子集体运动的统一理论候选之一，预测在二维条件下，移动物体之间的短程对齐相互作用足以形成具有异常涨落的长程有序相，类似于动物群集行为1。针对活性物质物理的自上而下实验方法正在迅速发展。先前的实验已证实大肠杆菌（Escherichia coli）中存在长程有序相的形成2。其他近期研究 则使用了细胞3,4、细菌5、运动胶体6或运动蛋白7,8。像 Vicsek 模型这样的简单最小模型已成功描述了这些真实现象。与这些单细胞实验系统不同，动物的集体行为通常只能在野外观察，因为没有人能够对一万个真实的鸟类或鱼类进行受控实验。

生物学家与物理学家有着相同的兴趣：个体之间如何相互作用，并作为群体在功能上表现出集体行为。分析个体行为的传统研究领域之一是神经科学，该领域已在神经元和分子水平上探究了行为背后的机制。迄今为止，已发展出许多神经科学的自下而上研究方法。利用果蝇、线虫Caenorhabditis elegans和小鼠等模式动物，可以促进物理学中的自上而下方法与生物学中的自下而上方法的结合9。然而，在实验室中关于这些模式动物的大规模集体行为的研究发现仍然较少10；目前在实验室中大规模培育具有遗传可操作性的模式动物仍存在困难。因此，在当前生物学与物理学的集体行为研究中，对于通常在实验室开展研究的科学家而言，研究动物的集体行为仍面临挑战。

在本研究中，我们建立了一种用于线虫大规模培养的方法，以研究其集体行为。该系统使我们能够改变环境条件，并利用突变体来考察个体水平运动对集体行为的影响10。在活性物质物理领域，数学模型的参数可在实验和模拟中进行控制，从而验证该模型在建立统一描述方面的有效性。遗传学方法则被用于解析集体行为背后的神经回路机制11。

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方案

1. 蛔虫的制备

注意：分别准备野生型 N2 Bristol 品系12 和 ZX899 品系（lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]）13 用于观察群体行为和光遗传学实验。ZX899 品系需在避光条件下培养。

  1. 将四条喂养充分的成虫线虫接种到含有14 mL添加琼脂的线虫生长培养基（NGM）的60 mm培养皿中，该培养基已接种有 E. coli OP5012.
  2. 在NGM平板中于23 °C培养F1代线虫至饥饿状态，持续7天。此时每平板F1代线虫产量约为100条。线虫所处阶段为混合群体，包含dauer幼虫和饥饿的L1幼虫。

2. 犬粮琼脂（DFA）培养基平板的制备

  1. 将含有 2 g 犬粮粉末和 5 mL 1% 琼脂培养基的玻璃瓶进行高压灭菌，并冷却至室温（图 1A）。
    注意：本实验可使用不同生产商的其他犬粮。

3. 将线虫接种至DFA培养基平板

  1. 将少量（约 0.5 g）DFA 培养基转移至接种了 E. coli OP50 的 NGM 平板中央（图 1B）。进行光遗传学实验时，在接种线虫前，向 DFA 培养基上加入 40 µL 浓度为 50 µM 的全反式视黄醛（channel rhodopsin 2 的辅因子）。
  2. 使用灭菌水从四块 NGM 平板上收集饥饿状态的线虫。
  3. 在 DFA 培养基上靠近平板盖子约 2 mm 处放置一小块狗粮（约 0.5 g）。
  4. 在超净工作台内用紫外光照射 NGM 平板 15 分钟，以防止污染。
  5. 将收集的线虫（约 400 条）接种到 NGM 平板的 DFA 培养基上。不要用封口膜密封平板，以避免增加培养皿内部湿度并产生水滴，导致线虫被困在盖子上。
  6. 在 23 °C 下培养线虫，使其向上爬行至平板盖子，持续约 10–14 天。
    ​注意：由于 10–14 天后盖子上的线虫数量几乎不再增加，推测线虫可能已耗尽食物。

4. 群体行为的观察

  1. 实验当天，将一个未添加大肠杆菌（E. coli）和狗粮琼脂培养基的新NGM平板放置在体视变倍显微镜载物台上的铝板上（图2A）。使用帕尔贴温度控制器将该新NGM平板底部温度维持在23 °C，至少5分钟（图2B）。随后，将此新NGM平板的盖子替换为线虫已爬附其上的原培养板的盖子。使用物镜（×2，NA = 0.5）作为低倍物镜（图2A）。
  2. 将培养皿底部温度从23 °C升高至26 °C，以改变皿内湿度（图2）。
  3. 使用相机以每秒20帧（20 frame s−1）的速度采集平板盖内表面的图像（补充视频S1）。
  4. 将采集的图像保存为标记图像文件格式（Tagged Image File format）。

5. 光遗传学实验

  1. 使用100 W汞灯通过滤光片组提供蓝光，并利用电磁快门系统精确控制光照时间（图2B）。
  2. 在蓝光照射前，将ZX899置于DFA条件下维持5分钟。
  3. 在显微镜载物台上保持23 °C的条件下，对附着在培养皿盖上的ZX899线虫进行光照。
  4. 使用相机以每秒20帧（20 frame s−1）的速度采集培养皿盖内表面的图像（补充视频S2）。

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结果

本实验采用野生型滞育幼虫进行群体行为观察。将线虫在23 °C下培养约10至14天，使其爬升至DFA培养基平板盖子的内表面。实验当天，仅将盖子转移至不含大肠杆菌（E. coli）和DFA培养基的新NGM平板上。该培养皿底部最初通过帕尔帖系统维持在23 °C，随后温度升至26 °C。在显微镜下拍摄视频。图3展示了该视频的若干截图。在湿度变化过程中，线虫动态重塑其网络结构。随着湿度增加，网络中的隔室尺寸也随之增大。最终，网络结构瓦解，在盖子内表面仅留下休眠的线虫聚集体。

用于发酵分析的两步法微生物生长、广口瓶培养及培养皿中的DFA培养基。
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讨论

本研究中，我们展示了一种用于构建大规模集体行为系统的制备方案 秀丽隐杆线虫 在实验室中。基于DFA的方法最初是建立在 秀丽隐杆线虫日本种14 和 Neoaplectana carpocapsae Weiser15，两者均为非模式动物。然而，该方法尚未被用于研究群体行为。 秀丽隐杆线虫 是一种遗传操作可行的模式动物11,12行为遗传学研究使用 秀丽隐杆线虫 促进了个体层面行为研究的开展。然而，在漫长的 秀丽隐杆线虫 研究中，尽管观察到一种简单的聚集模式16,17,18,19

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

我们感谢 秀丽隐杆线虫 感谢遗传学中心提供本研究中使用的菌株。本出版物得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（B）（课题编号 JP21H02532）以及日本学术振兴会（JSPS）创新领域研究补助金的支持 "软体机器人的科学" 日本文部科学省科学研究费补助金（课题编号JP18H05474）、日本学术振兴会科研费变革性研究领域B（课题编号JP23H03845）、日本医疗研究开发机构（AMED）先锋研究计划（课题编号JP22gm6110022h9904）、日本科学技术振兴机构（JST）未来社会创造项目（课题编号JPMJMI22G3）以及JST-FOREST计划（课题编号JPMJFR214R）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>大肠杆菌 以及 秀丽隐杆线虫 品系
大肠杆菌 OP50秀丽隐杆线虫 遗传学中心OP50食物 秀丽隐杆线虫 尿嘧啶营养缺陷型 大肠杆菌 B.
lite-1(ce314)；ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]作者ZX899lite-1(ce314) 突变体，在基因表达受控于ChR2和RFP的情况下携带这些基因 mec-4 以及 unc-122 启动子，分别
N2 布里斯托尔秀丽隐杆线虫 遗传学中心野生型 秀丽隐杆线虫 品系
<强>用于线虫培养
琼脂纯化粉末中川理研01162-15NGM 平板的制备
全反式视黄醛Sigma-AldrichR2500用于光遗传学
胰蛋白胨Becton Dickinson211677NGM 平板的制备
氯化钙和光036-00485NGM 平板的制备
胆固醇和光034-03002NGM 平板的制备
二磷酸氢二钾中野铁工28727-95NGM 平板的制备
狗粮日本宠物食品VITA-ONE用于制备狗粮琼脂培养基
LB肉汤，Lennox中野铁工20066-95用于培养 大肠杆菌 OP50
无水硫酸镁TGIM1890NGM 平板的制备
培养皿（60 mm）Nunc150270NGM 平板的制备
磷酸二氢钾Nakarai tesque28720-65NGM 平板的制备
氯化钠中野铁工31320-05NGM 平板的制备
<强>观察
计算机CT溶液CS6229Windows10 专业版，配备 Intel Xeon Gold 6238R 处理器和 768 GB 内存
CMOS相机滨松光子学 ORCA-Lightning C14120-20P用于数据采集
CMOS 相机奥林巴斯DP74用于数据采集
配备 SZX-MGFP 装置的显微镜奥林巴斯MVX10用于数据采集
x2 物镜OlympusMV PLAPO 2XC工作距离 20 mm，数值孔径 0.5
<强>快门控制
快门OptoSigmaBSH2-RIX用于控制时间模式  光照
快门控制器OptoSigmaSSH-C2B-A用于控制时间模式  光照
<强>温度控制
帕尔帖温度控制单元VICSWLVPU-30用于控制培养皿内部湿度
UNI-THEMO 控制器安培UTC-100用于控制培养皿内部湿度
<强>数据采集软件
HCImage滨松光子用于数据采集

参考文献

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
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  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

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