人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

摘要

本方案描述了人类中脑多巴胺能神经元的细胞培养，随后进行免疫染色，并通过获取的显微高内涵图像生成神经元表型谱，从而识别由遗传或化学调控引起的表型变化。

摘要

帕金森病（Parkinson's disease, PD）与多种导致中脑多巴胺能（mDA）神经元丢失的细胞生物学过程相关。目前许多 体外 帕金森病（PD）的细胞模型缺乏复杂性，且未考虑多种表型。利用人源诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的中脑多巴胺能（mDA）神经元进行表型分析，可通过并行检测与PD相关的细胞类型中多种神经元表型，弥补上述不足。本文介绍了一种从商业可得的人mDA神经元中获取和分析表型谱的实验方案。采用神经元特异性的荧光染色组合，用于可视化细胞核、α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶（TH）以及微管相关蛋白2（MAP2）相关的表型。所描述的表型分析方案具有可扩展性，使用384孔板、自动化液体处理系统和高通量显微镜技术。本方案的应用实例包括来自健康供体的mDA神经元，以及携带与PD相关的Leucine-rich repeat kinase 2（LRRK2）基因G2019S突变的mDA神经元。LRRK2) 基因。两种细胞系均用LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理，并检测表型变化。此外，我们展示了如何利用聚类分析或基于机器学习的有监督分类方法来分析多维表型谱。本所述方案将特别适用于从事神经元疾病建模或研究化合物对人神经元作用的研究人员。

引言

帕金森病（PD）中多种细胞生物学过程受到干扰。例如，线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质降解缺陷、囊泡运输及内体-溶酶体功能紊乱均与中脑多巴胺能（mDA）神经元的丢失相关，这些现象在帕金森病中普遍存在¹。因此，帕金森病似乎涉及多种可相互作用并加剧彼此的致病机制。研究这些机制间相互作用的一种有效方法是构建中脑多巴胺能（mDA）神经元的全面表型指纹或表型谱。

表型分析是一种基于一组可测量特征为样本建立特征谱的方法，其次，它还利用该特征谱对样本进行预测^2,3。分析的目标是捕获多种多样的特征，其中一些特征可能此前尚未与疾病或治疗相关联³。因此，表型分析能够揭示出意想不到的生物学过程。表型分析通常依赖于荧光染色的细胞，已有标准化的检测方法（如Cell Painting）被开发用于构建表型特征谱⁴。最近，表型分析已被应用于小分子的表征，或仅基于患者来源的成纤维细胞准确预测帕金森病（PD）亚型^5,6。尽管取得了这些进展，表型分析极少被应用于有丝分裂后分化的细胞，例如表达与PD相关突变（如LRRK2 G2019S）的人诱导....

方案

1. 神经元接种用培养基和培养板的准备（第1天）

1. 在第-1天为神经元接种准备培养板时，使用前将层粘连蛋白（Laminin）升至室温（RT）。用预冷的含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS+/+缓冲液将层粘连蛋白原液（0.1 mg/mL）按1/10比例稀释，配制层粘连蛋白工作液。
   注意：所有试剂均列于材料表中。溶液与缓冲液的组成详见表1-4。
2. 随后，向经多聚-D-赖氨酸（PDL）预包被的384孔板每孔加入25 µL层粘连蛋白工作液，4 °C过夜孵育。包被后的培养板可在4 °C保存至多一周。
   注意：本方案可在此步骤暂停，最长暂停一周。使用塑料封膜密封培养板。
3. 配制完全维持培养基，并于4 °C保存，最长可保存一个月（表1）。

2. 神经元的解冻（第0天）

1. 在第0天解冻神经元时，将水浴预热至37 °C，并将完全维持培养基平衡至室温，避光放置。
2. 从液氮罐中取出含有 commercially obtained 冻存神经元的冻存管（见材料表），置于干冰上。随后将冻存管放入水浴中2分钟。待液体完全解冻后，用70....

结果

在中脑多巴胺能（mDA）神经元中进行表型分析是量化细胞生物学多个方面及其在实验干预过程中变化的有效方法。为示范该方法，本研究使用了冻存的LRRK2 G2019S突变型及健康供体来源的mDA神经元。这些神经元已分化约37天，处于有丝分裂后状态，表达神经元标志物（TUBB3和MAP2）以及多巴胺能神经元标志物，包括酪氨酸羟化酶（TH）与FOXA2的共表达，而胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）则呈阴性¹⁴。根据所述方案，两种细胞系均培养6天，并用0.1 µM的LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理。神经元经Hoechst核染色，并使用针对α-突触核蛋白、TH和MAP2的抗体进行免疫染色（图2）。

接下来，对图像进行分割并提取表型特征。我们确定了126个定量特征，这些特征可汇总为基于孔板的表型谱（图3A，B）。每个特征及其在各实验条件下的数值均可查阅。部分特征在化合物处理后显示出变化.......

讨论

表型分析是一种通过应用荧光染色、显微镜成像和图像分析来测量细胞中大量表型的技术³。通过在不同细胞系或其他实验条件下获取并比较表型谱，可以深入了解细胞生物学中的复杂变化，而这些变化在仅使用单一检测指标时可能被忽略。本文描述了表型分析在人源iPSC分化而来的中脑多巴胺能（mDA）神经元中的应用，该细胞类型常用于模拟帕金森病（PD）的细胞生物学特征^17,18,19。相较于以往使用通用荧光染色⁴、非神经元细胞类型^5,6或不可扩展的方法^7,8，mDA神经元中的表型分析具有多项优势。首先，本方法能够在生理学相关的终末分化mDA神经元中进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗鸡 – Alexa 647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155	免疫荧光
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
抗-Map2	Novus	NB300-213	免疫荧光
抗小鼠 - Alexa 488	赛默飞世尔科技	A11001	免疫荧光
抗兔 - Alexa 555	赛默飞世尔科技	A21429	免疫荧光
抗酪氨酸羟化酶	默克	T2928	免疫荧光
抗-α-突触核蛋白	Abcam	138501	免疫荧光
Bravo 自动液体处理平台，配备 384ST 头	安捷伦		若无液体处理仪可用，建议使用电子多通道移液器。
共聚焦显微镜	横河	CV7000	建议使用自动共聚焦荧光显微镜以确保图像质量的一致性。
Countess 自动细胞计数仪	Invitrogen		接种前细胞计数。也可使用手动计数板进行。
DPBS +/+	Gibco	14040-133	洗涤缓冲液
EL406 洗板机分配器	BioTek（安捷伦）		若无液体处理仪可用，建议使用电子多通道移液器。
甲醛溶液（PFA 16%）	Euromedex	EM-15710-S	染色前固定
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	细胞核染色
iCell 基础培养基 1	富士胶片	M1010	神经元基础培养基
iCell DPN，供体编号#01279，表型AHN，批号#106339，1M	富士胶片	C1087	表观健康的供体
iCell DPN，供体编号11299，表型 LRRK2 G2019S，表型帕金森病批次编号106139	富士胶片	C1149	携带 LRRK2 G2019S 突变的供体
iCell 神经系统补充剂	富士胶片	M1031	基础培养基添加剂
iCell 神经补充剂 B	富士胶片	M1029	基础培养基添加剂
Jupyter Python Notebook	自主研发	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	用于从原始数据执行表型特征可视化与分类的笔记本
层粘连蛋白	Biolamina	LN521	包被平板
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2激酶抑制剂
PhenoLink	自主研发	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	图像分析软件
PhenoPlate 384孔板，PDL包被	Perkin Elmer	6057500	用于细胞培养和成像的预包被板。该板可使用 Yokogawa CV7000 显微镜的所有物镜对所有孔进行成像。
Abgene 120 储存板 µL	赛默飞世尔科技	AB-0781	使用Vprep移液系统进行化合物分配所必需。若不可用，建议使用电子多通道移液器。
Triton	Sigma	T9284	裂解前透化
台盼蓝	Sigma	T8154-20ML	活细胞的测定
Vprep 移液系统	安捷伦		换液和化合物加样。或者，可使用电子多通道移液器。