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人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

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DOI：

10.3791/65570

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2023年7月7日

 ,  , 
1Ksilink

本文内容

摘要

本方案描述了人类中脑多巴胺能神经元的细胞培养，随后进行免疫染色，并通过获取的显微高内涵图像生成神经元表型谱，从而识别由遗传或化学调控引起的表型变化。

摘要

帕金森病（Parkinson's disease, PD）与多种导致中脑多巴胺能（mDA）神经元丢失的细胞生物学过程相关。目前许多 体外 帕金森病（PD）的细胞模型缺乏复杂性，且未考虑多种表型。利用人源诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的中脑多巴胺能（mDA）神经元进行表型分析，可通过并行检测与PD相关的细胞类型中多种神经元表型，弥补上述不足。本文介绍了一种从商业可得的人mDA神经元中获取和分析表型谱的实验方案。采用神经元特异性的荧光染色组合，用于可视化细胞核、α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶（TH）以及微管相关蛋白2（MAP2）相关的表型。所描述的表型分析方案具有可扩展性，使用384孔板、自动化液体处理系统和高通量显微镜技术。本方案的应用实例包括来自健康供体的mDA神经元，以及携带与PD相关的Leucine-rich repeat kinase 2（LRRK2）基因G2019S突变的mDA神经元。LRRK2) 基因。两种细胞系均用LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理，并检测表型变化。此外，我们展示了如何利用聚类分析或基于机器学习的有监督分类方法来分析多维表型谱。本所述方案将特别适用于从事神经元疾病建模或研究化合物对人神经元作用的研究人员。

引言

帕金森病（PD）中多种细胞生物学过程受到干扰。例如，线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质降解缺陷、囊泡运输及内体-溶酶体功能紊乱均与中脑多巴胺能（mDA）神经元的丢失相关，这些现象在帕金森病中普遍存在1。因此，帕金森病似乎涉及多种可相互作用并加剧彼此的致病机制。研究这些机制间相互作用的一种有效方法是构建中脑多巴胺能（mDA）神经元的全面表型指纹或表型谱。

表型分析是一种基于一组可测量特征为样本建立特征谱的方法，其次，它还利用该特征谱对样本进行预测2,3。分析的目标是捕获多种多样的特征，其中一些特征可能此前尚未与疾病或治疗相关联3。因此，表型分析能够揭示出意想不到的生物学过程。表型分析通常依赖于荧光染色的细胞，已有标准化的检测方法（如细胞绘画，Cell Painting）被开发用于构建表型特征谱4。最近，表型分析已被应用于小分子的表征，或仅基于患者来源的成纤维细胞准确预测帕金森病（PD）亚型5,6。尽管取得了这些进展，表型分析却很少应用于有丝分裂后分化的细胞，例如表达与PD相关的突变（如LRRK2 G2019S）的人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的中脑多巴胺能（mDA）神经元。iPSC来源模型面临的重要挑战包括：不同分化批次或基因型之间存在细微或可变的病理特征，以及孤立的PD表型无法反映疾病的整体复杂性。此外，尽管iPSC神经元模型具有生理相关性，但由于技术复杂性的担忧，它们在PD药物发现过程中的应用仍十分有限7,8。

我们此前已建立了一种稳健的方法，用于检测人源中脑多巴胺能（mDA）神经元中多种与帕金森病（PD）相关的病理生理表型，这些表型对基因和化学化合物诱导的表型变化均具有敏感性9。本文详细描述了该方法的进一步优化版本，用于从中脑多巴胺能神经元生成表型谱（图1）。与此前报道的表型分析方法相比，本方案具有多项优势，例如使用高质量的中脑多巴胺能神经元并具备良好的技术可重复性。这是首次能够在化学干预后，以高度可扩展的方式对生理上具有相关性的终末分化（post-mitotic）中脑多巴胺能神经元进行表型谱分析。完全分化且可冷冻保存的中脑多巴胺能神经元现已可商业化获得，显著降低了批次间分化过程的变异性。其次，通过采用明确的实验设计（例如控制培养时间或避免使用培养板边缘孔）、自动化液体处理系统以及自动显微成像技术，可进一步减少技术性变异。此外，本文还概述了使用无监督聚类或有监督分类方法进行表型谱初步分析的步骤，说明了如何对表型谱数据进行分析。本方案适用于关注基因或化学扰动引起中脑多巴胺能神经元表型变化的研究人员，尤其适用于需要高度可扩展实验设计的研究场景，例如在化合物筛选项目中，或在研究少量化合物效应（如评估其毒性作用）时。总之，预计人类神经元表型谱技术将成为研究复杂疾病相关表型及表征药物候选物细胞效应的有力工具。

细胞培养流程图：包被、解冻、处理、染色、成像、图谱生成。
图1：从人iPSC来源的中脑多巴胺能神经元生成基于图像的表型图谱的实验方案示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 神经元接种用培养基和培养板的准备（第1天）

  1. 在第-1天为神经元接种准备培养板时，使用前将层粘连蛋白（Laminin）升至室温（RT）。用预冷的含Ca2+和Mg2+的PBS+/+缓冲液将层粘连蛋白原液（0.1 mg/mL）按1/10比例稀释，配制层粘连蛋白工作液。
    注意：所有试剂均列于材料表中。溶液与缓冲液的组成详见表1-4。
  2. 随后，向经多聚-D-赖氨酸（PDL）预包被的384孔板每孔加入25 µL层粘连蛋白工作液，4 °C过夜孵育。包被后的培养板可在4 °C保存至多一周。
    注意：本方案可在此步骤暂停，最长暂停一周。使用塑料封膜密封培养板。
  3. 配制完全维持培养基，并于4 °C保存，最长可保存一个月（表1）。

2. 神经元的解冻（第0天）

  1. 在第0天解冻神经元时，将水浴预热至37 °C，并将完全维持培养基平衡至室温，避光放置。
  2. 从液氮罐中取出含有 commercially obtained 冻存神经元的冻存管（见材料表），置于干冰上。随后将冻存管放入水浴中2分钟。待液体完全解冻后，用70%乙醇对冻存管进行消毒。
  3. 使用P1000移液器吸取解冻后的神经元（约370 µL），将其转移至50 mL离心管中，避免上下吹打。接着，用630 µL完全维持培养基冲洗冻存管，以45°角逐滴加入50 mL离心管中，滴加过程中缓慢振荡。
    注意：必须缓慢逐滴加入培养基，以避免细胞因渗透压冲击而破裂。采用45°角并轻柔振荡，可在移液过程中最大限度降低局部渗透压。
  4. 同样使用P1000移液器向50 mL离心管中加入1 mL完全维持培养基。然后缓慢加入2 mL完全维持培养基。滴加过程中小心振荡。
  5. 进行细胞计数。准备一个微量离心管，加入10 µL台盼蓝和10 µL细胞悬液，取10 µL加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪（见材料表）或手动方式进行计数。
  6. 计数完成后，在室温下以400 × g 离心5分钟，离心含有神经元的50 mL离心管，弃去上清液。使用P1000移液器和1 mL完全维持培养基小心重悬细胞沉淀。然后加入所需体积的培养基，以达到目标浓度（300,000 个细胞/mL，详见下一步）。

3. 在制备好的培养板上接种神经元（第0天）

  1. 在第0天将神经元接种到已准备好的培养板上时，从冰箱中取出包被好的培养板，置于细胞培养罩内，使其平衡至室温约30分钟。
  2. 接种前，使用自动液体处理仪或16通道移液器吸取每孔15 µL的包被液。每孔保留约10 µL，以防止损伤包被层。
  3. 随后，使用16通道移液器向每孔加入50 µL细胞悬液（细胞密度为300,000个细胞/mL，按步骤2.6制备），使每孔接种15,000个神经元，最终每孔体积为60 µL。
  4. 在384孔板中，避免使用第1、2、23、24列以及A、B、O、P行，以尽量减少可能影响表型特征的边缘效应。将未使用的空孔加入80 µL PBS。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育。

4. 培养基更换或化合物处理（第3天）

  1. 根据孔的数量，在室温下预热适当体积的完全维持培养基。避免光照。
  2. 如果需要更换培养基，请进入步骤 4.4。如果需要进行化合物处理，请确认化合物储备液的浓度及所用溶剂（水、DMSO、甲醇等）。
  3. 使用完全维持培养基，为所有拟测试的浓度配制 1.5 倍浓缩的化合物溶液。
    注意：作为中性对照，应使用与待测化合物相同浓度的相应溶剂。若使用不同浓度的多种或未知化合物，建议单独开展剂量-反应实验，以评估溶剂对表型谱的影响。
  4. 若使用自动移液系统，将 60 µL 的 1.5 倍浓缩化合物溶液加入 384 孔储存板中。也可使用 16 通道移液器。如需更换培养基，则改为加入 60 µL 完全维持培养基。
  5. 使用自动移液系统，从含神经元的培养板中每孔吸出并弃去 40 µL 培养基，使每孔剩余 20 µL；然后从 384 孔储存板中向每孔加入 40 µL 的 1.5 倍浓缩化合物溶液，以达到目标终浓度。
    注意：关键是要避免完全更换培养基，始终在孔中保留部分残留培养基，以防止对神经元层或包被层造成损伤。
  6. 若神经元培养时间超过本方案所述的 6 天，应每 2–3 天更换一次培养基。

5. 神经元固定与染色（第6至7天）

  1. 在第6天和第7天固定并染色神经元时，所有加液和洗涤步骤均使用自动化液体处理仪。或者，可使用16通道移液器。
  2. 用1×PBS稀释Triton X-100，配制10% Triton X-100溶液。涡旋振荡至溶液均匀。4 °C保存。
  3. 固定神经元时，每孔加入20 µL 16% PFA，使终浓度为4%。室温孵育30分钟，用1×PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，每孔保留20 µL PBS。
    警告：PFA被认定为有害物质，可引起经口、经皮和吸入毒性，对眼睛具有危害，并可能导致遗传突变和癌症。操作PFA时必须佩戴适当个人防护装备（如眼部和面部防护），并确保良好通风。应防止PFA释放到环境中。
  4. 进行通透和封闭时，配制2×封闭液（表2）。
  5. 每孔加入20 µL 2×封闭液（终浓度为1×），室温孵育1小时，用PBS洗涤1次。洗涤后每孔保留20 µL PBS。
  6. 进行一抗染色（见材料表）时，配制2×一抗染色缓冲液（表3）。
  7. 每孔加入20 µL 2×一抗染色缓冲液（终浓度为1×），4 °C孵育过夜。第7天次日早晨，用PBS洗涤3次。洗涤后每孔保留20 µL PBS。
  8. 进行二抗染色（见材料表）时，配制2×二抗染色缓冲液（表4）。
  9. 每孔加入20 µL 2×二抗染色缓冲液（终浓度为1×），室温避光孵育2小时，用PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，每孔保留100 µL PBS。
    1. 在板上加盖铝封膜以减少蒸发。或者，用塑料封膜和铝箔覆盖板。随后进行成像，或于4 °C保存。
      ​注意：本方案可在此暂停，最长可暂停一周。若观察到背景荧光，可考虑延长封闭时间；若染色不足，可尝试提高一抗浓度或延长孵育时间。

6. 荧光染色神经元的成像（第7天）

  1. 在第7天获取已铺板、培养并染色的神经元的图像。理想情况下，使用自动共聚焦荧光显微镜（参见材料表）。也可手动获取图像。
  2. 分别使用405 nm、488 nm、561 nm和647 nm激光器采集Hoechst、TH、α-突触核蛋白和MAP2通道的图像（图2）。
    注意：为获得足够数量且详细的表型分析数据，应使用40倍物镜，并采用由3个Z平面（间隔2 µm）组成的Z栈，每孔采集16个视野。若神经元层中存在因移液操作导致的损伤区域，应尽量避免对这些区域成像。
  3. 根据显微镜和相机的不同，分别调整四个荧光通道的曝光时间和激发强度，以获得最佳的荧光信号动态范围。
    ​注意：成像软件通常提供直方图以帮助确定理想的曝光时间。若直方图在低信号区域（左侧）过于集中，则曝光时间过短或激发强度过低；若在右侧最大信号水平处出现陡峭的截断峰，则信号已饱和。此时应降低激发强度或缩短曝光时间。
  4. 以无损且开放的格式（如.tif）存储图像。

7. 图像处理（第8天）

  1. 创建定量表型谱需要进行图像分割和表型特征提取。使用 PhenoLink 软件进行图像分割和特征提取（材料表）。PhenoLink 的安装说明可在 GitHub 仓库中找到（https://github.com/Ksilink/PhenoLink）。
    注意：图像分割用于识别和分离图像中的不同对象或区域，而表型特征提取则用于分析并提取这些区域中的相关信息。目前已有多种替代软件解决方案可用于从多通道荧光图像中提取定量信息，例如 CellProfiler10、ImageJ/FIJI11、Napari12 或 Knime Analytics Platform13。
  2. 对经过光照校正的原始图像执行图像分割。根据每块培养板的经验确定各荧光通道的强度阈值，以使背景信号最小化，并确保所分割的信号与原始图像中的信号相对应。同一天处理和染色的培养板通常需要相近的通道强度阈值来进行分割。
  3. 定义细胞核大小和强度，以区分活细胞与死细胞。当使用 40x 图像时，保留所有其他默认参数并运行软件。每个孔将计算出 126 个定量图像特征（补充表 1）。
  4. 利用生成的表格形式的定量数据构建表型谱，并比较不同细胞系或处理条件下的表型谱。每一行对应一个生物学条件（孔），每一列对应一个确定的表型特征。
    ​注意：我们提供了一个示例输出文件以及数据分析流程，以说明其使用方法（见 材料表）。此外，图 3 展示了表型谱的组成结构。

8. 表型谱生成与可视化（第8天）

  1. 如果您的计算机上未安装 Python 和 Jupyter，请安装 Anaconda 发行版并打开 Jupyter 软件。下载提供的 Jupyter 笔记本文件及其他所有提供文件，并将它们保存在同一目录下（参见 材料表）。使用 Jupyter 软件打开 Jupyter 笔记本文件。
    注意：Anaconda 是一个免费开源的编程语言平台，支持 Python 等语言。该平台包含 Python 解释器 Jupyter，可用于执行提供的 Jupyter 笔记本，以创建和分析表型谱（https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling）。
  2. 使用 Jupyter 软件逐单元格执行 Jupyter 笔记本中的代码。提供的示例数据文件 .fth 和依赖项文件 requirements .txt 必须与 Jupyter 笔记本位于同一目录中。每个 Jupyter 笔记本单元格均附有注释，说明其功能。
    注意：必须按正确顺序使用 Jupyter 笔记本，从数据加载和缩放开始，逐单元格执行至结尾。所有数据和图形输出将存储在 Jupyter 笔记本源目录中新创建的文件夹中。图 4 展示了工作流程及流程输出结果。

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结果

在中脑多巴胺能（mDA）神经元中进行表型分析是量化细胞生物学多个方面及其在实验干预过程中变化的有效方法。为示范该方法，本研究使用了冻存的LRRK2 G2019S突变型及健康供体来源的mDA神经元。这些神经元已分化约37天，处于有丝分裂后状态，表达神经元标志物（TUBB3和MAP2）以及多巴胺能神经元标志物，包括酪氨酸羟化酶（TH）与FOXA2的共表达，而胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）则呈阴性14。根据所述实验方案，两种细胞系均培养6天，并用0.1 µM的LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理。神经元经Hoechst核染色以及针对α-突触核蛋白、TH和MAP2的抗体进行免疫染色（图2）。

接下来，对图像进行分割并提取表型特征。我们确定了126个定量特征，这些特征可汇总为基于孔板的表型谱（图3A，B）。每个特征及其在各实验条件下的数值均可查阅。部分特征在化合物处理后出现变化。...

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讨论

表型分析是一种通过应用荧光染色、显微镜成像和图像分析来测量细胞中大量表型的技术3。通过在不同细胞系或其他实验条件下获取并比较表型谱，可以深入了解细胞生物学中的复杂变化，而这些变化在仅使用单一检测指标时可能被忽略。本文描述了表型分析在人源iPSC分化而来的中脑多巴胺能（mDA）神经元中的应用，该细胞类型常用于模拟帕金森病（PD）的细胞生物学特征17,18,19。相较于以往使用通用荧光染色4、非神经元细胞类型5,6或不可扩展的方法7,8，mDA神经元中的表型分析具有多项优势。首先，本方法能够在生理学相关的终末分化mDA神经元中进行...

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披露

所有作者均受雇于 Ksilink。

致谢

作者谨向 Ksilink 的所有同事致以诚挚感谢，感谢他们提供的宝贵帮助和讨论，这些帮助和讨论促成了本方案的设计。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗鸡 – Alexa 647Jackson ImmunoResearch703-605-155免疫荧光
Anacondahttps://www.anaconda.com/download
抗-Map2NovusNB300-213免疫荧光
抗小鼠 - Alexa 488赛默飞世尔科技A11001免疫荧光
抗兔 - Alexa 555赛默飞世尔科技A21429免疫荧光
抗酪氨酸羟化酶默克T2928免疫荧光
抗-α-突触核蛋白Abcam138501免疫荧光
Bravo 自动液体处理平台，配备 384ST 头安捷伦若无液体处理仪可用，建议使用电子多通道移液器。
共聚焦显微镜 横河CV7000建议使用自动共聚焦荧光显微镜以确保图像质量的一致性。
Countess 自动细胞计数仪Invitrogen接种前细胞计数。也可使用手动计数板进行。
DPBS +/+Gibco14040-133洗涤缓冲液
EL406 洗板机分配器 BioTek（安捷伦） 若无液体处理仪可用，建议使用电子多通道移液器。
甲醛溶液（PFA 16%）EuromedexEM-15710-S染色前固定
Hoechst 33342InvitrogenH3570细胞核染色
iCell 基础培养基 1富士胶片M1010神经元基础培养基
iCell DPN，供体编号#01279，表型AHN，批号#106339，1M富士胶片C1087表观健康的供体
iCell DPN，供体编号11299，表型 LRRK2 G2019S，表型帕金森病批次编号106139富士胶片C1149携带 LRRK2 G2019S 突变的供体 
iCell 神经系统补充剂富士胶片M1031基础培养基添加剂
iCell 神经补充剂 B富士胶片M1029基础培养基添加剂
Jupyter Python Notebook自主研发https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling用于从原始数据执行表型特征可视化与分类的笔记本
层粘连蛋白BiolaminaLN521包被平板
PFE-360MedChemExpressHY-120085LRRK2激酶抑制剂
PhenoLink自主研发https://github.com/Ksilink/PhenoLink图像分析软件
PhenoPlate 384孔板，PDL包被Perkin Elmer6057500用于细胞培养和成像的预包被板。该板可使用 Yokogawa CV7000 显微镜的所有物镜对所有孔进行成像。
Abgene 120 储存板 µL赛默飞世尔科技AB-0781使用Vprep移液系统进行化合物分配所必需。若不可用，建议使用电子多通道移液器。
TritonSigmaT9284裂解前透化
台盼蓝SigmaT8154-20ML活细胞的测定
Vprep 移液系统 安捷伦换液和化合物加样。或者，可使用电子多通道移液器。

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