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使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

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DOI：

10.3791/65572

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2023年10月20日

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

本文内容

摘要

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV 的研究人员，我们提供了一套包括转基因表达盒克隆、粗制载体生产以及细胞培养转导的实验方案。

摘要

重组腺相关病毒载体（rAAV）可在多种组织类型中实现高效且持久的外源基因表达，且无需整合到宿主基因组中，因此在动物模型和临床应用中成为基因递送的常用工具。除了治疗用途外，rAAV也是实验室中用于在培养细胞内递送符合研究人员实验需求和科学目标的外源基因的有力工具。一些应用实例包括外源报告基因、过表达表达盒、RNA干扰以及基于CRISPR的工具（包括用于全基因组筛选的系统）。与电穿孔或化学转染相比，rAAV转导对细胞的损伤更小，且无需特殊设备或昂贵试剂即可制备。含有rAAV的粗裂解液或条件培养基可直接加入培养细胞中，无需进一步纯化即可转导多种细胞类型——这一特性常被低估。本文提供了外源基因表达盒克隆的基本操作流程，并演示了如何制备和应用粗制rAAV制剂处理培养细胞。作为原理验证，我们展示了三种此前尚未见于rAAV应用报道的细胞类型的转导效果：胎盘细胞、成肌细胞和小肠类器官。我们讨论了粗制rAAV制剂的适用场景、rAAV在基因递送中的局限性以及衣壳选择时需考虑的因素。本方案为研究人员提供了一种简单、低成本且高效的方法，可在细胞培养中利用rAAV实现有效的DNA递送，而无需繁琐的滴定和纯化步骤。

引言

阐明细胞功能的分子基础通常需要在细胞培养中表达转基因DNA。为了实现表达，转基因必须穿过细胞的选择性膜并到达细胞核1,2。因此，有效绕过细胞的物理屏障并调控其核心过程的能力，是应用转基因技术揭示新生物学现象的必要条件。其中一种方法利用了病毒递送和表达外源DNA的内在能力3,4。

腺相关病毒（AAV）是最小的哺乳动物病毒之一：其基因组为4.7千碱基（kb）的单链DNA，包含两个基因——rep（编码复制酶）和cap（编码衣壳蛋白），包裹在直径为25 nm的60聚体二十面体衣壳内。这两个rep/cap基因具有多个启动子、阅读框和剪接产物，可编码至少九种不同的蛋白质，这些蛋白质对病毒的复制、产生和包装至关重要5,6。此外，基因组两端含有称为反向末端重复序列（ITRs）的二级结构，这些结构在DNA复制、基因组包装以及转导过程中的下游加工中均必不可少7,8,9,10。ITRs是基因组包装进衣壳所必需的唯一DNA元件，因此可通过将病毒的rep/cap基因替换为研究者选择的调控元件和/或目的基因，将AAV克隆用于外源基因递送6。由此产生的重组腺相关病毒（rAAV）携带经过人工设计的载体基因组（VG），已广泛应用于临床基因治疗，并取得了诸多成功11。该载体在实验室中的应用尚被低估：rAAV可在培养细胞中高效实现外源基因表达，满足研究者的实验需求12。

生产重组腺相关病毒（rAAV）最常用的方法是通过三质粒共转染HEK293或293T细胞（图1）。第一个质粒通常称为cis质粒，包含由ITR（反向末端重复序列）两侧包围的目的转座基因（pAAV）。根据具体应用，含有常见元件（如强启动子或基于CRISPR的工具）的cis质粒可直接购买获得。第二个质粒是pRep/Cap质粒，包含野生型AAV的rep和cap基因，以反式提供——即位于另一个不含ITR的独立质粒上，该质粒表达调控和结构元件，进而与cis质粒相互作用——因此被称为反式质粒。衣壳除了在物理上包裹病毒基因组（VG）外，还影响细胞嗜性12,13。通过在反式提供特定血清型的cap基因，研究人员可轻松选择针对特定靶细胞优化的衣壳血清型，从而最大化转导效率。最后，由于AAV属于依赖细小病毒属（Dependoparvovirus），其需要辅助病毒来激活病毒启动子驱动的rep/cap基因表达，这一功能由腺病毒辅助基因实现，通常由第三个质粒（如pAdΔF6）提供14,15。在三质粒共转染72小时后，可通过反复冻融循环将载体从生产细胞释放至培养基中。随后收集整个培养皿的内容物，并通过离心去除大的细胞碎片；所得的培养基上清液即为粗制的rAAV制剂，可用于后续的转导实验。

HEK 293(T) 细胞转染、载体收获、转导过程示意图、基因表达分析。
图 1：粗制 rAAV 载体制备流程概览。 粗制 rAAV 的制备与转导可在 5 天内完成。请点击此处查看该图的放大版本。

与常见的其他转染方法相比，重组腺相关病毒（rAAV）在递送外源基因方面可能更具优势，因为传统方法通常伴随细胞毒性、转染效率低以及需要昂贵的试剂和设备，例如电穿孔或基于化学/脂质的转染方法16,17。rAAV能够规避这些障碍，通常可实现高效的外源基因表达，同时毒性极低，且操作时间短。重要的是，rAAV的制备及其在细胞培养中的应用十分简便，通常无需从培养基中纯化病毒载体（图1）。此外，与慢病毒介导的外源基因递送不同，rAAV不会将其病毒基因组（VG）整合到宿主基因组中，从而降低了插入突变的风险18。尽管rAAV在基因递送方面具有潜在优势，但仍需考虑其局限性。重要的一点是，由于衣壳的物理限制，外源基因（包括ITRs）的大小不应超过4.9 kb，这限制了研究人员有效递送较大调控元件和外源基因的能力。此外，由于rAAV是一种非整合型病毒，在分裂细胞中其转导导致的外源基因表达是短暂的，因此可能不适用于需要稳定表达的实验。然而，若研究人员需要，可采用双rAAV递送Cas9和同源定向修复（HDR）模板的方法，将序列稳定插入特定的基因组位点19。

方案

1. 质粒获取

注意：本方案将把目的基因（GOI）克隆至含有反向末端重复序列（ITR）的质粒中，该质粒包含巨细胞病毒（CMV）启动子和SV40多聚腺苷酸化序列（pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40）。然而，该质粒无需进一步克隆即可用于产生重组腺相关病毒（rAAV），包装一个便捷的双报告基因EGFP和荧光素酶。具有不同调控元件或适用于不同实验（如基于CRISPR的实验）的质粒可在线获取，其克隆步骤与下文类似（详见讨论部分中的额外克隆步骤）。此外，可使用针对不同血清型的rep/cap（即trans）辅助质粒——本方案将采用针对AAV血清型2的rep/cap质粒。

  1. 购买含有ITR的cis质粒、腺病毒辅助质粒、rep/cap质粒以及含有目的基因（GOI）的质粒的细菌斜面。将细菌分别划线接种于含有针对各质粒抗性对应的抗生素的琼脂平板上。在30 °C条件下过夜培养以促进生长。
    注意：如果无法直接购买到含有目的基因的质粒，可在线购买合成DNA片段（见材料表）。此外，如有需要，也可使用合成DNA片段以跳过整个PCR过程。
  2. 从每个平板上挑取单个菌落，接种于3 mL添加了相应抗生素的Luria Bertani（LB）培养基中，在30 °C、180 rpm振荡条件下过夜培养。取1 mL菌液转移至含有50 mL添加了相应抗生素的LB培养基的无菌250 mL锥形瓶中，在30 °C、180 rpm条件下振荡过夜培养。
  3. 将菌液转移至50 mL离心管中，在室温下以3,000 × g离心20分钟，弃去上清液。按照制造商说明书，使用低内毒素或无内毒素的中量质粒提取试剂盒提取质粒。
    ​注意：ITR为不稳定结构。为防止ITR发生缺失或突变，应于30 °C培养细菌，以减缓细胞分裂并降低复制错误率。为提高质粒产量和纯度，建议使用中量或大量质粒提取试剂盒。推荐使用低内毒素或无内毒素试剂盒，以减少后续实验中细胞的内毒素污染。质粒提取过程无需在超净工作台内进行，只要在常规实验台上操作，质粒制备污染的风险极低。

2. 将目的基因克隆至含有AAV ITR的质粒

  1. 在DNA查看软件中打开包含目的基因（GOI）的质粒图谱。
    注意：由于衣壳的物理包装限制，整个表达盒（包括ITR）的长度不应超过4.9 kb。此外，由于ITR存在二级结构，无法通过PCR扩增穿过ITR区域。因此，不推荐使用Gibson组装法进行rAAV转基因克隆。
    1. 点击序列 标签以显示质粒的完整序列。滚动至目的基因（GOI）序列的最5'端区域，点击第一个核苷酸 ，并向基因内部拖动以设计一条正向引物。当引物的熔解温度（Tm）达到约55 °C时松开鼠标。
    2. 点击正向引物。手动在引物序列的最5'端添加EcoRI限制性酶切位点序列（5' GAATTC 3'）。此外，在该限制性酶切位点的5'端额外添加六个随机碱基，以确保酶能够高效地与DNA结合。点击添加引物。代表性示例如图2所示。
    3. 检查引物，确保其不会形成发夹结构或引物二聚体（限制性酶切位点本身为回文结构除外）。若形成发夹结构，可调整六个额外碱基的随机序列。同时，确保该引物在质粒的其他位置无非特异性结合。
    4. 重复上述步骤，在目的基因（GOI）最3'端区域向基因内部设计一条反向引物。点击反向引物，并在引物中包含NotI限制性酶切位点（5' GCGGCCGC 3'）。
      注意：目的基因（GOI）中不能含有EcoRI或NotI限制性酶切位点——若存在，则需选用其他限制性内切酶。
  2. 在50 µL的PCR反应体系中扩增目的基因（GOI）。使用表1中列出的所需各组分。
    1. 将反应体系放入PCR仪中，并根据表2中的循环参数进行程序设置。若正反向引物的Tm不同，应以较低的Tm值作为退火温度。
    2. 取5 µL PCR产物，加入1 µL 6×上样缓冲液，混匀后进行电泳。将DNA Marker与PCR产物在含溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上电泳，并用紫外光成像观察结果。
      警告：溴化乙锭为已知诱变剂。
    3. 若凝胶上出现单一且特异的条带，则使用柱式PCR产物纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化剩余的PCR产物。若出现多条条带（由非特异性扩增导致），则切下目标条带，并使用凝胶回收试剂盒按照说明书纯化DNA。
  3. 在50 µL反应体系中，使用表3中列出的所需各组分，对纯化后的PCR产物和pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40骨架质粒进行双酶切消化，37 °C孵育1小时。由于凝胶回收后质粒DNA的回收效率较低，因此需要使用较大量的pAAV质粒DNA。
    注意：所用限制性内切酶为高保真（HF）版本。普通NotI酶不能与CutSmart缓冲液兼容。若使用其他酶，则可能需要不同的孵育温度和缓冲液。
    1. 使用柱式PCR产物纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化经酶切的PCR产物。
    2. 向50 µL酶切反应产物中加入10 µL 6×上样缓冲液，用于制备凝胶电泳样品。将DNA Marker、酶切反应产物以及250 ng未酶切质粒（阴性对照）上样至含溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶（使用宽孔梳），电泳后用紫外光成像，切下目标片段（约4.5 kb），并使用凝胶回收试剂盒按照说明书纯化DNA。
  4. 在20 µL连接反应体系中，使用表4中列出的所需各组分，将经酶切的PCR产物与经酶切的pAAV骨架质粒进行连接。计算所需PCR产物量时，请使用公式1。通常采用3:1的摩尔比（PCR产物/插入片段 : 骨架质粒/pAAV），骨架质粒质量为50 ng。
    插入片段质量计算公式，\( \text{插入片段质量（ng）} = \frac{\text{骨架质量（ng） × 插入片段长度（kb） × 比例}}{\text{骨架长度（kb）}} \)，用于分子克隆计算的公式。     公式1
  5. 设置阴性对照，将PCR产物替换为水。将连接反应在16 °C过夜孵育，或在室温下孵育2小时。
  6. 将一管感受态、重组缺陷型细菌细胞（如Stbl3细胞）置于冰上解冻，取50 µL转移至1.5 mL离心管中。直接加入3 µL连接反应产物，冰上孵育30分钟。
    注意：ITR为不稳定结构，因此需使用重组缺陷型菌株以减少ITR缺失和重组事件的发生。DH5α细胞可间歇性用于质粒扩增（一至两次），但不推荐长期使用。中量提取（midiprep）纯化后应定期检测ITR完整性。
    1. 将细菌在42 °C水浴中热激30秒，立即转移至冰上冷却2分钟。加入200 µL LB培养基，在30 °C、180 rpm条件下振荡培养1小时。
    2. 取125 µL菌液涂布于含相应抗生素的琼脂平板，30 °C过夜培养（约18小时）。挑选多个单克隆，分别接种至含3 mL LB培养基（含相应抗生素）的无菌塑料培养管中，30 °C、180 rpm振荡过夜培养。
      ​注意：为防止ITR缺失或突变，细菌应在30 °C培养以减缓细胞分裂速度，降低复制错误率。此外，应优先挑选较小的菌落，因为缺失ITR的质粒可能具有生长优势。
    3. 将每管培养物取1.8 mL转移至2 mL离心管中，室温下6,000 x g离心3分钟。使用质粒小提试剂盒提取DNA。将剩余1.2 mL菌液于4 °C保存。通过DNA测序或诊断性限制性酶切鉴定正确克隆。
      注意：建议对插入片段进行Sanger测序，但标准方法无法完整读取ITR区域。ITR完整性应通过如下所述的限制性酶切进行验证。
    4. 向无菌的250 mL三角瓶中加入50 mL含相应抗生素的LB培养基。取500 µL保存的菌液接种至三角瓶中，30 °C、180 rpm振荡培养至OD600达到0.2–0.5（约18小时）。将菌液转移至50 mL离心管中，4 °C、3,000 x g离心20分钟。使用低内毒素或无内毒素中量提取试剂盒提取质粒DNA。
    5. 使用20 µL体系进行诊断性限制性酶切（使用XmaI或SmaI）以检测ITR完整性。反应体系包含500 ng质粒DNA、0.5 µL酶和1×缓冲液，37 °C孵育1小时。将反应产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。若ITR完整，酶切后应出现一条约2.9 kb的条带和另一条与表达盒大小相符的条带。若未观察到该特异条带，则表明ITR可能不完整，需重新进行克隆。
      注意：若质粒中除ITR区域外还含有XmaI（或SmaI）酶切位点，则凝胶上将出现额外条带。

PCR引物设计示意图，DNA序列注释，正向和反向引物，基因区域。
图2：引物设计的代表性示例。 针对mScarlet转基因的正向和反向引物设计（代表性示例）。请点击此处查看该图的放大版本。

用量组分
X µL模板 DNA (25 ng)
1 µLF 引物 (10 µM)
1 µLR 引物 (10 µM)
1 µLdNTP (10 mM)
10 µLPhusion 缓冲液 (5x)
1 µLPhusion 聚合酶
X µL水
50 µL终体积

表1：PCR扩增试剂。 成功进行PCR反应所需的组分。

步骤温度时间
初始变性98 °C1 分钟
30 个循环98 °C10 秒
引物退火温度（Tm）30 秒
72 °C每 kb 30 秒
最终延伸72 °C10 分钟
保存4 °C无限期

表2：PCR扩增程序。 成功进行PCR反应所需的循环参数。

用量组分
X µLPCR 产物 (1µg) 或 pAAV 质粒 (3µg)
5 µL缓冲液 (10x)
1 µLEcoRI-HF
1 µLNotI-HF
X µL水
50 µL终体积

表3：消化试剂。 成功进行消化反应所需的组分。

体积组分
X µL插入片段 (X ng)
X µL载体骨架 (50 ng)
2 µLT4 DNA连接酶缓冲液 (10x)
1 µLT4 DNA连接酶
X µL水
20 µL终体积

表4：连接反应试剂。 成功进行连接反应所需的组分。

3. 采用三质粒转染法进行载体生产

注意：以下数值针对6孔板中的单个孔进行优化，可获得终体积为2 mL的粗提物。所有数值均可按10倍放大用于15 cm培养板（终体积为20 mL），或按4倍缩小用于24孔板（终体积为500 µL）。

  1. 通过将100 mg PEI MAX溶解于100 mL蒸馏水中，配制1 µg/µL的聚乙烯亚胺盐酸盐（PEI）MAX储备液。用NaOH调节pH至7.1。使用0.22 µm滤器过滤除菌，并将溶液分装为1 mL每份，于-20 °C冷冻保存。解冻后，试剂可在4 °C保存1个月。
  2. 将3 × 105个HEK293或HEK293T细胞接种至6孔板中，培养基为预热的含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L葡萄糖，110 mg/L丙酮酸钠）。在37 °C、5% CO2的培养箱中培养至约75%–90%汇合度（图3）。
    注意：已观察到使用青霉素/链霉素（P/S）培养的细胞会降低载体产量。采用适当的无菌操作技术可避免使用P/S，因此建议不要在HEK293细胞培养中添加抗生素20。若下游转导实验需要P/S，建议在收获后向粗提物中添加P/S。
  3. 在2 mL离心管中，配制含有1.3 µg pAAV2/2（Rep/Cap，血清型2）、1.3 µg pAAV.GOI、2.6 µg pAdΔF6以及无血清（SF）DMEM（4.5 g/L葡萄糖，110 mg/L丙酮酸钠）的混合物，总体积为100 µL（参见补充表1以获取便捷计算方法）。
  4. 另取一管配制阴性对照，用任意无关质粒替换pRep/Cap。该阴性对照用于排除粗提物中可能存在的未包装pAAV.GOI质粒在转导过程中转染细胞的影响，尽管此类情况较为罕见。
    注意：内毒素含量低或无内毒素的质粒大提（maxiprep）或中提（midiprep）产物最适合三质粒共转染，通常比质粒小提（miniprep）DNA产生更高的载体滴度，尽管小提DNA可用于快速初步测试。
  5. 向质粒混合物中加入5.2 µL PEI MAX，得到质粒:PEI比例为1:1的混合物。在涡旋振荡器上以7档脉冲振荡10–15次，充分混匀。若同时制备多个载体，应在不同时间点依次向各质粒混合物中加入PEI，间隔1分钟（例如，第1个制备在t = 0分钟，第2个在t = 1分钟，依此类推），以便为后续步骤中的吸液和反应稀释留出充足时间。
    ​注意：已证实质粒:PEI比例为1:1时效果最佳。但用户可根据自身条件优化该比例以获得最高效率。有关PEI优化方法，请参见讨论部分（另见补充表2）。
  6. 每管准确孵育15分钟后，加入1.9 mL SF DMEM（4.5 g/L葡萄糖，110 mg/L丙酮酸钠）稀释反应体系，终体积为2 mL。轻柔吹打混匀2次。过度混匀会破坏质粒/PEI复合物，导致转染效率降低。
  7. 吸除孔内培养基，将质粒:PEI混合物沿孔壁缓慢加入，避免细胞脱落。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养72小时。培养期间出现的细胞裂解和脱落是重组腺相关病毒（rAAV）生产的正常现象（图4）。

显微镜下的细胞培养图像；细胞形态学分析。
图3：准备转染的HEK293细胞。 进行三质粒转染所需的HEK293细胞理想汇合度（75%–90%）。 请点击此处查看该图的放大版本。

四天细胞培养生长情况；显微镜图像 第0-3天；细胞增殖观察。
图4：转染后的HEK293细胞。 HEK293细胞在转染pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40、pAAV2/2、pAdΔF6以及质粒:PEI为1:1比例后0天、1天、2天或3天的形态变化。比例尺：400 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 收集粗制载体样品

  1. 将转染后的整块细胞板在 -80 °C 下冷冻 30 分钟，随后在 37 °C 下解冻 30 分钟。重复此过程，共进行三次冻融循环。操作过程中不要打开盖子——确保板内保持无菌状态。完成冻融后，细胞板可继续保存在 -80 °C，直至准备进行后续步骤。
    注意：使用非加湿培养箱进行解冻效果更佳，可最大限度减少板外表面的冷凝水，从而避免意外污染。
  2. 以下两个步骤需在超净工作台中采用无菌技术操作。通过移液充分混匀每个孔中的内容物，以确保细胞充分裂解。将裂解液转移至 2 mL 离心管中，在室温下以 15,000 × g 离心 15 分钟，以去除细胞碎片。
  3. 小心地将上清液转移至新的 2 mL 离心管中。该粗制备品可直接使用，无需滴定或纯化。载体可在 4 °C 保存数月，或在 -20 °C 保存数年。
    ​注意：如有需要，可通过定量 PCR（qPCR）对耐 DNase 颗粒内的载体基因组（VG）数量进行定量，从而计算滴度。因此，滴度单位为 VG/mL。在 4 °C 保存数月的载体在使用前应重新测定滴度，因为载体可能发生聚集或吸附于管壁，导致有效滴度下降。

5. 转导

  1. 将目标细胞类型（例如 Huh7）接种于 96 孔板中，目标汇合度为 50%–75%，具体数值取决于转导持续时间。过高的汇合度可能导致 AAV 转导效率降低。
  2. 对于无需精确剂量的应用（例如在新细胞类型中测试一组衣壳蛋白的转导能力），可在不了解粗制制备物滴度的情况下，直接将载体（例如 CMV.mScarlet）加入细胞。用无血清（SF）培养基对粗制制备物进行 1:3 的系列稀释，以获得适用于该实验的最佳载体用量。吸除 96 孔板中的培养基，并向各孔中加入 50–100 µL 稀释后的粗制制备物。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。
    ​注意：血清中可能含有可中和 AAV 载体并降低转导效率的抗体。然而，对于敏感细胞类型，转导过程中仍可使用含血清培养基。
  3. 转导后 48 小时（hpt）去除载体，并用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。对于敏感细胞类型，也可在转导后 2 小时即去除载体，并更换为含血清培养基。对于多数实验，可过夜孵育以完成转导，并于次日早晨更换为新鲜的含血清培养基。对于 Huh7 和 U2-OS 等耐受性较强的细胞类型，无需更换培养基。
  4. 使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 10 分钟，以终止转导。也可根据具体实验需求采用其他终止方法（例如裂解）。对于大多数细胞类型，外源基因表达峰值出现在转导后 48 小时，因此该时间点常作为实验终点。

6. 不同细胞类型的转导方法的变体

注意：不同细胞类型需要不同的培养条件。因此，应根据具体细胞类型的需求优化转导时载体的添加条件。以下针对代表性结果中所包含的细胞类型提供了非常具体的转导方案，以展示研究人员可根据自身需要尝试的一些转导方案变异形式。

  1. 小鼠小肠类器官
    1. 从小鼠（C57BL/6J）小肠隐窝组织制备小鼠小肠类器官（mSIOs）。将类器官包埋于90%基底膜基质中，并在24孔板中培养，孔板内含类器官生长培养基（不含抗生素）或转导前培养基（50% Wnt3a条件培养基［使用L Wnt-3A细胞在类器官生长培养基中自行制备］、10 mM烟酰胺、10 µM ROCK抑制剂和2.5 µM CHIR99021），于37 °C、5% CO2条件下培养一代（5–7天），之后进行转导。
    2. 转导前，用D-PBS清洗类器官，通过移液破坏基底膜基质圆顶结构，并将类器官在解离培养基中于37 °C孵育10分钟，进一步通过移液将其解离为小细胞簇。
    3. 加入含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基（含5% FBS）终止细胞解离过程，将细胞簇转移至离心管中，在室温下以1000 × g离心5分钟收集细胞簇。
    4. 将细胞簇重悬于转导培养基（含10 µg/mL聚凝胺的转导前培养基或含10 µg/mL聚凝胺的类器官生长培养基）中，转移至48孔板，随后加入包装CMV.mScarlet的粗制AAV制剂进行转导。
    5. 通过在37 °C、600 × g条件下离心1小时进行类器官转导，然后在37 °C继续孵育6小时。将转导后的类器官收集至1.5 mL微量离心管中，在室温下以1000 × g离心5分钟，置于冰上。
    6. 去除上清液后，将转导后的类器官重悬于含转导前培养基或类器官生长培养基的90%基底膜基质中，将20 µL液滴接种至预热的腔室盖玻片的一个孔中。
    7. 在培养箱中孵育10分钟后，向液滴中加入350 µL转导前培养基或类器官生长培养基进行包埋，并在37 °C培养箱中继续孵育。转导后2–5天，通过共聚焦显微镜观察转导类器官，测定转导效率，并估算每个类器官中红色荧光细胞的百分比。
  2. BeWo细胞
    1. 转导前24小时，将人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于96孔板中。将包装CMV.mScarlet的粗制AAV制剂用无血清F12-K BeWo培养基稀释至1:1，每孔总体积补至50 µL。吸除孔中培养基，每孔加入50 µL稀释后的AAV制剂。
    2. 在37 °C孵育过夜（约18小时），然后每孔加入含10% FBS的F12-K BeWo培养基100 µL，使总体积达到150 µL。继续孵育6小时，转导后总时间为24小时（hpt）。
    3. 成像前，在F12-K培养基中用Hoechst染料对活细胞染色30分钟，然后更换为含10% FBS、1× GlutaMAX补充剂和1×丙酮酸钠补充剂的无酚红DMEM进行成像。使用共聚焦显微镜，配备DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组，在37 °C、5% CO2条件下进行活细胞成像。
  3. Hepa1-6和Huh7细胞
    1. 转导前24小时，将小鼠Hepa1-6肝细胞和人Huh7肝细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于含DMEM（4.5 g/L葡萄糖、110 mg/L丙酮酸钠、10% FBS）的96孔板中。
    2. 直接向细胞中加入50 µL未稀释的包装CMV.mScarlet的粗制AAV制剂，在37 °C孵育48小时。用PBS洗涤一次，4%多聚甲醛固定，Hoechst染料染色10分钟。使用共聚焦显微镜，配备DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组进行成像。
  4. C2C12和HSkMC细胞
    1. 转导前72小时，将未分化的鼠源C2C12成肌细胞和未分化的原代人骨骼肌细胞（HSkMC）成肌细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于96孔板中。
    2. 将包装CMV.mScarlet的粗制AAV制剂用DMEM（4.5 g/L葡萄糖、青霉素/链霉素、20% FBS）按1:1稀释用于C2C12成肌细胞，或用骨骼肌生长培养基稀释用于HSkMC成肌细胞。通过更换为分化培养基，将HSkMC成肌细胞诱导分化为肌管。
    3. 将成肌细胞和肌管在稀释后的AAV制剂中于37 °C孵育24小时。用Hoechst染料对活细胞染色10分钟，使用共聚焦显微镜，配备DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组进行成像。

结果

筛选适合转导目标培养细胞的最优衣壳
通过转导多种细胞类型以确定不同衣壳血清型的嗜性（图5）。将天然血清型AAV214、AAV421、AAV522、AAV823、AAV924以及工程化衣壳变体Anc8025、DJ26、LK0327和KP128，与携带CMV启动子驱动mScarlet表达的载体基因组进行包装，该载体按本实验方案所述方法克隆获得。未经滴定的粗制载体制剂用相应的培养基稀释后用于细胞转导，转导时间超过24小时，随后进行成像分析（图5B）。转导效率通过表达mScarlet的细胞占总细胞数的比例来计算；对于小鼠小肠类器官，则通过单个z平面中mScarlet阳性细胞的比例进行计算（图5C）。分化后的C2C12和HSkMC成肌细胞未提供转导效率（mScarlet阳性细胞）数据，图中所示为未分化的C2C12和HSkMC成肌前体细胞的转导结果（图5A）。

在所测试的细胞系中，AAV2 和 KP1 是转导效率最高的血清型（图 5A）。还观察到，来源于不同物种的相似细胞类型在转导效率上存在差异。例如，使用 AAV2 时，小鼠来源的肝细胞系 Hepa1-6 的转导效率明显低于人源肝细胞系 Huh7（图 5B）。此外，不同的培养基条件在转导过程中也起着重要作用。与在类器官生长培养基中培养的小鼠小肠类器官（mSIOs）相比，在转导前培养基中培养的 mSIOs 转导效率较低（图 5C）。另外，AAV2 能有效转导未分化的 HSkMC 成肌细胞和已分化的 HSkMC 肌管细胞（图 5B），但由于肌管细胞的定量分析较为困难，因此未提供相关数据。

图5 中观察到的不同细胞类型的高转导效率表明，粗制的载体制备物可有效用于多种细胞类型的转导，无需进一步纯化或滴定等步骤。然而，在选择衣壳时应谨慎考虑，以最大化目的基因的递送效率。许多其他细胞系和衣壳此前已被测试并发表，但所用载体均为纯化的制备物12。

培养基条件对转导效率的影响与载体颗粒无关。然而，通常认为嗜性（即细胞类型特异性的载体摄取与表达）是衣壳特异性的属性29。迄今为止，尚未观察到等剂量的粗制与纯化制备物在细胞嗜性方面存在差异。因此，粗制载体可用于细胞培养，其使用方式与纯化载体相似。

不同细胞系中AAV载体的转导效率；数据图表、荧光显微镜图像。
图5：多种细胞类型的粗制载体转导效果。（A）加入携带mScarlet转基因的不同AAV载体后，mScarlet+细胞所占百分比。（B）由AAV2血清型递送mScarlet并表达该蛋白的细胞。比例尺：100 µm（Hepa1-6、Huh7、C2C12和HSkMC），200 µm（BeWo），20 µm（mSIO）。缩写：hpt = 转导后小时数。（C）小鼠小肠类器官（mSIOs）分别在转导前培养基或类器官生长培养基中接受rAAV处理。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：三质粒转染工作表。 请点击此处下载该文件。

补充表 2：PEI 优化工作表。 请点击此处下载该文件。

讨论

克隆
上述克隆方案不仅限于所使用的 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 质粒，可根据研究人员的实验需求轻松调整。许多含有 ITR 的质粒均可在线购买获得。例如，含有 Cas9 和 sgRNA 克隆位点的质粒已有提供，但需要额外的少量步骤，如寡核苷酸退火和 PNK 处理30。此外，也可找到仅含有 ITR 而无内部调控元件、但具备多克隆位点（MCS）的质粒31。若使用不同的质粒，通常只需更改本方案中用于消化的限制性内切酶（RE）。然而，rAAV 的一个局限性在于其装载容量有限。由于衣壳的物理限制，包括 ITR 在内的载体基因组不应超过 4.9 kb。

从细菌中提取质粒时，必须使用低内毒素或无内毒素的中量或大量提取试剂盒，以减少在三质粒转染或转导过程中对细胞造成的损伤。普通小提试剂盒提取的质粒通常含有较多杂质、浓度较低，且超螺旋DNA含量较少，这些因素均可能影响重组腺相关病毒（rAAV）的后续生产，因此不推荐使用。

在克隆过程中，理解ITR的结构和特性至关重要。首先，通过PCR扩增ITR区域极为困难，因此应避免需要跨越ITR进行PCR扩增的克隆设计，同时限制使用Gibson组装克隆技术。因此，限制性内切酶克隆法是将片段克隆至含ITR质粒的首选方法。此外，若测序区域包含ITR，某些Sanger测序引物可能不适用。建议使用从ITR向外延伸、对载体基因组主体进行测序的引物，以获得更精确的测序结果。其次，当将含ITR的质粒转入细菌进行扩增时，ITR容易发生缺失、重排和突变32,33。为减少此类事件的发生，建议使用重组缺陷型的感受态细菌菌株（如Stbl3），并在30 °C条件下培养，以减缓细胞分裂速度。最后，观察发现较小的菌落可能对应于未发生重排或缺失的克隆，因为缺失ITR的质粒可能具有生长优势，从而形成较大的菌落。因此，建议挑选较小的菌落进行后续操作。

载体生产
重组腺相关病毒（rAAV）载体的成功生产受多种因素影响。其中一个关键因素是用于转染的 HEK293 或 293T 细胞的健康状态。通常，较低的传代次数较为理想，因为高传代次数的细胞可能出现基因型和表型变异，从而降低 rAAV 滴度。此外，接种细胞的密度应达到 75%–90% 的融合度，以实现高效生产。细胞密度过低会导致载体产量下降，因为可用于生产载体的细胞数量较少；而细胞过度生长则会影响转染效率。

试剂批次、细胞库以及不同实验室之间的普遍差异均可能导致转染效率和病毒滴度的差异。其中一个可优化的因素是转染反应中的质粒与PEI的比例，该比例的调整有助于提高滴度。必须使用新鲜的PEI MAX（<1个月以内）。建议以1:1的质粒:PEI比例作为起始点；若转染或转导效率较低，应测试多个不同的比例。若使用带有可视化读出信号的报告基因（例如本文中用作克隆起始材料的CMV.Luc.IRES.EGFP报告基因），则滴度优化将更为简便。进行优化时，请按照方案第3步操作，使用12孔板，并将质粒质量及试剂体积均减半（最终质粒总量为2.6 µg）。相应调整PEI体积，使比例范围从1:0.75至1:3，以0.25为递增梯度（图6）。每种反应体系在孵育15分钟后，加入950 µL无血清培养基稀释。为方便操作，可预先配制包含三种质粒的总混合液（master mix），并分装至1.5 mL离心管中，再分别加入PEI——详见补充文件2。收集病毒载体，转导目标细胞并进行成像分析。转导效率最高（GFP阳性细胞比例最高）的孔所对应的PEI:DNA比例即为最佳比例，可获得最高病毒滴度。

质粒转染过程示意图：配制主混合液、调整PEI比例、转导细胞、收获载体。
图6：PEI优化工作流程。 PEI优化所需步骤的示意图。通过测试多种质粒与PEI的比例，以确定最佳比例。 请点击此处查看该图的放大版本。

收获与滴度注意事项
用于收获重组腺相关病毒（rAAV）载体的冻融技术可有效裂解HEK293细胞，所得澄清裂解液可直接用于转导培养细胞。某些rAAV血清型（如AAV1、AAV8和AAV9）在载体生产过程中会从细胞中释放，因此可直接从培养细胞的培养基中收集，无需进行冻融循环34。本方法在使用AAV2衣壳时，通常可获得约1 × 1010 VG/mL的滴度，使用AAV8衣壳时可达1 × 1011 VG/mL。虽然使用去垢剂或其他化学裂解方法可获得更高的滴度，但这些试剂对后续应用中的细胞具有毒性，且需要将rAAV从裂解液中进一步纯化。研究人员在判断粗制样品是否适用于其研究需求时，应权衡滴度较低这一折衷因素。然而，本方法产生的略低滴度仍能高效转导多种细胞类型（参见代表性结果）。除转染效率和细胞状态外，载体滴度还受rAAV生产过程中所用衣壳类型以及基因组（VG）内转基因的大小和序列影响35。

在收获粗制载体时，三质粒转染过程中使用的质粒DNA可能残留在制备物中，尽管这种情况较为罕见，但仍可能在转导过程中导致下游的转染。此外，未被包装的病毒基因组（VG）可能结合在衣壳外表面，引发针对裸露且外源性的单链DNA的先天免疫反应36,37。因此，对于敏感的细胞类型，可能需要对载体进行DNase消化和纯化处理，以去除未包装的VG和残留质粒。

若要计算粗提物的滴度，可通过qPCR定量耐DNase颗粒（DRP）内包装的病毒基因组（VG）数量。简言之，取少量粗提物进行DNase消化，以去除质粒DNA、污染的核酸或部分包装的VG。随后对样品进行qPCR，定量DRP内受到保护的VG，从而获得以每毫升粗提物中病毒基因组（vector genome）数量表示的滴度38。不建议使用基于ELISA的检测方法来测定载体滴度，此类方法仅定量衣壳滴度。与野生型AAV病毒相比，重组AAV（rAAV）存在一定比例的空衣壳和部分包装的衣壳39。ELISA会检测所有衣壳，无论其是否含有基因组，因而会高估样品中具有感染能力的功能单位数量，而这些功能单位必须包含完整包装的VG。

转导注意事项
多种因素会影响重组腺相关病毒（rAAV）的转导效果，因此在开展任何新实验时都应充分考虑这些因素。根据驱动转基因表达的启动子类型不同，外源基因的表达可能在转导后4小时（hpt）即开始出现，通常在48 hpt时达到峰值。需要特别注意从细胞初始接种到实验终点之间的总时长，以便合理估算细胞的起始汇合度，确保实验结束时细胞不会过度生长。若细胞过度汇合，可能因应激反应而改变其生物学行为，从而干扰实验结果。某些细胞类型（如U2-OS细胞）对过度生长和接触抑制具有较强的耐受能力。此外，这类细胞还能耐受长时间（48小时以上）处于无血清的条件培养基中——即本制备方案所获得的产物。然而，对于较为敏感的细胞类型，则可能需要添加血清，或将粗制病毒液用特殊生长培养基稀释，以维持细胞在转导期间的健康状态。使用含血清培养基可能导致转导效率略有下降，但这是为保障细胞健康而可能需要接受的权衡，研究人员应予以充分考虑。

对于快速分裂的细胞，通常在实验终止于48 hpt时，起始汇合度约为50%最为理想。然而，可根据实验的具体需求相应调整汇合度。不建议对汇合度超过75%的单层型永生化细胞系进行转导，因为转导效率会下降。大多数培养的细胞类型在与粗制rAAV制剂过夜孵育后，于次日早晨更换为含血清的新鲜培养基，均可实现有效转导并保持良好状态。

衣壳血清型是制备重组腺相关病毒（rAAV）以转导靶细胞时需要考虑的重要因素，因为衣壳是决定细胞嗜性及后续外源基因表达水平的主要因素13。AAV2 是一种广泛应用的血清型，因其能够高效转导多种培养细胞12。AAV2 的这一特性可能归因于肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）作为其主要的附着因子，以及培养细胞在体外培养适应过程中表面 HSPGs 表达水平较高40。其他衣壳（如 AAV9）在转导多种细胞类型方面效果较差，这可能与其依赖的附着因子在此类环境中不表达有关41。因此，若目标细胞尚未在文献中被测试过使用 rAAV 转导的效果，我们推荐优先选用 AAV2 作为培养细胞中的衣壳类型。

请注意，粗制载体存在的一个主要局限性是其不适用于动物模型的转导。体内研究需要经过纯化并进行质量评估的制备物。

转基因表达及潜在整合问题
重组腺相关病毒（rAAV）不能稳定实现转基因的持久表达。随着时间推移，病毒基因组（VG）可能被沉默，经过数次传代后转基因表达可能被关闭42。此外，大多数病毒基因组以附加体形式存在，而rAAV不包含病毒Rep蛋白，因此无法像野生型病毒溶原性感染那样介导病毒基因组频繁整合到宿主基因组中，也不能促进病毒基因组的复制43。因此，在转导细胞中，附加体形式的病毒基因组会随着细胞分裂在子代细胞中逐渐被稀释。

所有递送的转基因DNA材料均有可能发生基础水平的整合。然而，含有ITR的病毒基因组（VG）发生整合的频率更高44。因此，在少数细胞亚群中可能观察到转基因的持续表达。尤其当使用重组腺相关病毒（rAAV）递送DNA切割酶（如Cas9）时，使用者应考虑这一可能性，因为双链断裂可能导致更高的整合频率和持续表达45。尽管这使得rAAV成为递送同源定向修复模板以实现内源标记或基因添加的理想候选载体，但仍需考虑Cas9插入的可能性19,46。

披露

A.C.M. 担任强生制药公司的顾问，并在 NewBiologix 公司的科学顾问委员会任职。其余所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

感谢 Robert Tjian 和 Xavier Darzacq 对本研究的支持以及提供实验室设备。感谢 Mark Kay 惠赠 KP1 和 LK03 rep/cap 质粒，感谢 Luk Vandenberghe 提供 AAV4 rep/cap 质粒。本研究经费由霍华德·休斯医学研究所（编号 34430，R. T.）和加州再生医学研究所培训项目（EDUC4-12790）提供。N.W. 感谢伯克利干细胞中心通过 Siebel 博士后奖学金以及德国研究基金会（DFG）通过 Walter Benjamin 博士后奖学金提供的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Snapgene DNA 查看软件Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔF6AddGene112867
LB 琼脂氨苄青霉素Sigma-AldrichL0418
Boekel Scientific Economy Digital IncubatorBoekel Scientific133000
LB 培养基，粉末MP Biomedicals113002042
氨苄青霉素（二钠盐）GoldBioC-103-5
New Brunswick I26 摇床EppendorfM1324-0000
50 mL 离心管Corning430828
Centrifuge 5810 REppendorf22627040
QIAGEN 质粒大提试剂盒（Plasmid Plus Midi Kit）Qiagen12945
PCR 可拆分 8 联管条USA Scientific1402-3900
Mastercycler nexusEppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518S随 Phusion 聚合酶购买提供
Phusion 高保真 DNA 聚合酶NEBM0530S
凝胶上样染料，橙色（6X）NEBB7022S
DNA Clean & Concentrator-100ZymoD4029
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒ZymoD4001
NotI-HFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
CutSmart Buffer (10x)NEBB6004S随限制性内切酶购买提供
UltraPure 琼脂糖Thermo Fisher Scientific16500100
溴化乙锭Sigma-AldrichE1510
T4 DNA 连接酶NEBM0202S
T4 DNA 连接酶反应缓冲液NEBB0202S随 T4 连接酶购买提供
Eppendorf Safe-Lock 管（1.5 mL）Eppendorf22363204
Precision 微处理器水浴锅Thermo Scientific51221046
无菌塑料培养管Fisher Scientific149566B
2.0 mL 微量离心管Thomas Scientific1149Y01
ZR 质粒小提试剂盒 - 经典型ZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
HEK 293T 细胞ATCCCRL-3216
Falcon 6 孔板Corning353046
Gibco DMEM，高糖，含丙酮酸Thermo-Fisher11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 培养箱Marshall ScientificMCO-18AIC
PEI MAX（聚乙烯亚胺盐酸盐）Polysciences24765-100
Mixer Vortex Genie 2Electron Microscopy Sciences102091-234
Sanyo 超低温冰箱Sanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 带透明窗口VWR390-0384
Eppendorf 微型离心机Eppendorf05-400-005
Falcon 96 孔板Corning353072
C57BL/6J 小鼠JAX品系 #000664
类器官生长培养基STEMCELL Technologies6005
L Wnt-3A 细胞ATCCCRL-2647
烟酰胺SigmaN0636-100G
ROCK 抑制剂STEMCELL Technologies72302
CHIR99021STEMCELL Technologies72052
Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜Fisher356231
24 孔板Fisher08-772-1
D-PBSThermo Fisher Scientific14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12 含 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies36254
polybreneMillipore SigmaTR-1003-G
48 孔板Fisher08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek 带腔盖玻片Fisher12-565-470
BeWo 细胞ATCCCCL-98
F-12K 培养基ATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7加州大学伯克利分校 BSD 细胞培养中心HUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
骨骼肌细胞生长培养基SigmaC-23060
骨骼肌细胞分化培养基SigmaC-23061
Invitrogen EVOS 数码彩色荧光显微镜Fisher Scientific12-563-340
Perkin Elmer Opera PhenixPerkin ElmerHH14001000
PhenoPlate 96 孔板Perkin Elmer6055302
DMEM，高糖，无谷氨酰胺，无酚红Thermo-Fisher31053028
GlutaMAX 补充剂Thermo-Fisher35050079
丙酮酸钠Thermo-Fisher11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)Addgene130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)Addgene112865
pAnc80L65AAPAddgene92307
KP1 (rep/cap)由斯坦福大学 Mark Kay 教授惠赠
LK03 (rep/cap)由斯坦福大学 Mark Kay 教授惠赠
pAAV4 (rep/cap)由哈佛医学院 Luk Vandenberghe 教授惠赠
pAAV.Cas9.sgRNAAddgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock（合成 DNA 片段）IDT

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AAV AAV AAV DNA

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