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方法文章

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

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DOI：

10.3791/65573

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2023年7月14日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

本文内容

摘要

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

摘要

传统的使用间充质干细胞（MSCs）的骨再生疗法难以应用于超过临界尺寸的骨缺损，因其缺乏诱导血管生成的机制。将由间充质干细胞（MSCs）构建的人工软骨组织植入体内，可诱导血管生成并促进骨形成 在体 通过软骨内成骨（ECO）实现。因此，这种由ECO介导的方法未来可能成为一种有前景的骨再生治疗策略。该ECO介导方法在临床应用中的一个重要方面是建立一套能够制备足量用于植入以修复骨缺损的软骨的方案。设计单一块状、尺寸和形状与实际骨缺损完全匹配的移植软骨尤其不具可行性。因此，所移植的软骨必须具备在植入多块时仍能整体形成骨组织的特性。水凝胶可能是扩大组织工程化移植物规模以满足临床需求、用于软骨内成骨的一种有吸引力的工具。尽管许多天然来源的水凝胶支持MSC软骨形成 体外 和 ECO 体内，目前尚未确定能够满足临床应用需求的最佳支架材料。透明质酸（HA）是软骨细胞外基质的关键组分，是一种可生物降解且生物相容性良好的多糖。本文表明，HA水凝胶具有优异的特性，可支持 体外 MSC来源的软骨组织分化及促进软骨内成骨 体内.

引言

自体骨由于创伤、先天性缺陷和手术切除所致的骨缺损修复仍是金标准。然而，自体骨移植存在显著局限性，包括供区疼痛、感染风险以及可从患者体内获取的骨量有限1,2,3,4已开发出多种生物材料作为骨替代物，这些材料将天然或合成聚合物与矿化材料（如磷酸钙或羟基磷灰石）相结合。5,6在这些工程材料中，通常利用矿化材料作为诱导物质，使干细胞通过膜内成骨（intramembrane ossification, IMO）过程直接分化为成骨细胞，从而实现骨形成。7该过程缺乏血管生成步骤，导致不足 体内 移植后移植物的血管化8,9,10因此，采用此类方法治疗大段骨缺损可能并非最佳选择11.

模拟软骨内成骨（ECO）过程的策略已被证明可克服传统基于膜内成骨（IMO）方法的相关重大问题，ECO 是发育过程中骨骼形成的一种先天机制。在 ECO 过程中，软骨模板中的软骨细胞释放血管内皮生长因子（VEGF），促进血管浸润并将软骨模板重塑为骨组织12ECO介导的成骨方法 通过 软骨重塑与血管生成，这一过程在骨折修复中同样被激活，利用由间充质干细胞（MSCs）衍生的人工软骨组织作为启动材料。软骨细胞能够在骨缺损中耐受缺氧环境，诱导血管生成，并将无血管的软骨移植物转化为具有促血管生成能力的组织。大量研究报道，基于MSC的软骨移植物可生成骨组织 体内 通过实施此类ECO项目13,14,15,16,17,18,19,20,21.

该ECO介导方法在临床应用中的一个基本要求，是如何在临床环境中制备所需数量的软骨移植物。制备与实际骨缺损大小完全匹配的临床用软骨并不现实。因此，当植入多个碎片时，移植物软骨必须能够整体形成骨组织。22水凝胶可能是用于扩大经软骨内骨化组织工程移植物规模的一种有前景的工具。许多天然来源的水凝胶均能支持间充质干细胞的软骨形成。 体外 和 ECO 体内23,24,25,26,27,28,29,30,31,32；然而，满足临床应用要求的最佳支撑材料仍有待确定。透明质酸（HA）是一种可生物降解且生物相容性良好的多糖，存在于软骨的细胞外基质中33HA通过CD44等细胞表面受体与MSCs相互作用，支持其软骨向分化25,26,28,30,31,32,34此外，HA支架可促进IMO介导的人牙髓干细胞成骨分化35，且与胶原蛋白联合使用的支架可促进ECO介导的成骨作用36,37.

本文介绍了一种利用骨髓来源的成人人类间充质干细胞制备透明质酸（HA）水凝胶的方法，并将其应用于肥大性软骨生成。 体外 以及随后的软骨内成骨 体内38我们将透明质酸（HA）的特性与胶原蛋白进行了比较，后者是一种在骨组织工程中广泛应用的材料，常与间充质干细胞（MSCs）联合使用，也是用于扩增人工移植物以实现软骨内成骨的有效材料。17在免疫缺陷小鼠模型中，评估了接种人源间充质干细胞的透明质酸与胶原构建物 体内 通过皮下植入评估ECO潜能。结果表明，透明质酸（HA）水凝胶作为间充质干细胞（MSCs）的支架材料，在构建可经由ECO实现骨形成的工程化软骨移植物方面具有优异性能。

该方案分为两个步骤。首先，将人MSCs接种于透明质酸水凝胶上形成构建物，并诱导其分化为肥大软骨 体外接下来，将已分化的构建体植入裸鼠皮下模型，以诱导软骨内成骨。 体内 (图1).

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方案

本实验方案使用4周龄的雄性裸鼠。将四只小鼠共同饲养在一个笼子中，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，温度22−24 °C，相对湿度50%−70%。所有动物实验均依照东京医科牙科大学机构动物护理和使用委员会批准的指南进行（批准编号：A2019-204C、A2020-116A 和 A2021-121A）。

1. 缓冲液与试剂的配制

  1. 通过将间充质干细胞生长培养基补充剂套装加入间充质干细胞基础培养基中，配制间充质干细胞生长培养基（MSC growth medium），并在 4 °C 下保存。
  2. 通过向 DMEM/F-12 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、50 µg/mL 硫酸庆大霉素、200 µM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和 1 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子，配制杜尔贝科改良伊格尔培养基与汉姆 F12 培养基（DMEM/F-12），并在 4 °C 下保存。
  3. 使用前，在 DMEM 培养基中添加 1% ITS-G 补充剂、0.12% 牛血清白蛋白、50 µg/mL 硫酸庆大霉素、0.35 mM L-脯氨酸、100 nM 地塞米松和 10 ng/mL TGF-β3，配制软骨诱导培养基。
  4. 使用前，在 DMEM 培养基中添加 10 mM β-甘油磷酸钠、0.12% 牛血清白蛋白、10 nM 地塞米松、200 µM 抗坏血酸-2-磷酸、50 nM L-甲状腺素、50 µg/mL 硫酸庆大霉素和 50 pg/mL IL-1β，配制肥大软骨细胞诱导培养基。
  5. 用 200 µL 在 60 °C 预热熔化的石蜡对 24 孔细胞培养板进行包被，室温静置直至石蜡凝固。

2. 人源MSCs的扩增

注意：在开始实验之前，应按照参考文献17中所述方法，通过微团培养筛选出具有高软骨分化潜能的间充质干细胞（MSCs）。

  1. 根据制造商说明书，将原代人骨髓来源的间充质干细胞（第2代）以5 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于10 cm培养皿中，使用间充质干细胞生长培养基，在37 °C、5% CO2 及95%湿度的培养箱中进行培养。
  2. 每2–3天更换一次培养基。当细胞融合度达到80%–90%时，用真空泵吸除培养皿中的培养基，加入5 mL PBS洗涤，再用真空泵吸除洗涤液。
  3. 向培养皿中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液，于37 °C孵育5–10分钟。
  4. 加入1 mL间充质干细胞生长培养基以终止酶反应。将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
  5. 将其他培养皿中的细胞悬液合并至同一50 mL离心管中，并置于冰上保存。
  6. 使用细胞计数仪计数细胞：取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝染液混合后进行计数。
  7. 将剩余细胞悬液在室温下以220 × g 离心3分钟，弃上清，加入冻存液重悬，调整细胞浓度为1.0 × 106 个细胞/mL。
  8. 将1 mL细胞悬液分装至每个冻存管中，于-80 °C保存12小时后转移至液氮中长期保存。所得冻存细胞（第3代）用于本实验方案。
  9. 实验时，将冻存的间充质干细胞以5 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于10 cm培养皿中，在DMEM/F-12培养基中培养至80%–90%融合度（第4代）。

3. 间充质干细胞包封水凝胶的制备

  1. 按照步骤 2.3 - 2.6 所述方法对细胞进行胰酶消化，并制备细胞悬液。
  2. 为制备 10 个构建物（每个构建物含 2.5 × 105 个细胞），将含有 2.5 × 106 个细胞的细胞悬液分装至 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 在 220 × g 条件下离心 3 分钟，用真空泵吸除上清液，并将沉淀置于冰上保存。
  4. 将巯基修饰的透明质酸（HA）、巯基反应性交联剂、聚乙二醇二丙烯酸酯和脱气水瓶恢复至室温。
  5. 在无菌条件下，使用带针头的注射器向含 HA 的瓶子中加入 1.0 mL 脱气水（参见生产商说明书）。
  6. 间歇性涡旋并加热至 37 °C，直至溶液变澄清，然后置于冰上。固体完全溶解所需时间少于 30 分钟。
  7. 在无菌条件下，使用带针头的注射器向交联剂瓶中加入 0.5 mL 脱气水。通过反复倒置使其溶解，然后置于冰上。
  8. 向分装的细胞沉淀（2.5 × 106 个细胞）中加入 120 µL 溶解后的 HA 溶液。通过反复吹打重悬细胞沉淀。
  9. 向含有 HA 和细胞的离心管（步骤 3.8）中加入 30 µL 溶解后的交联剂溶液，轻轻敲击管壁使其混合，然后短暂离心。HA 溶液与交联剂溶液按 4:1 的比例混合。
  10. 将含有间充质干细胞（MSCs，2.5 × 105 个细胞）的混合溶液 15 µL 滴加至石蜡涂层的 24 孔板中，在 37 °C 下静置 30 分钟使其固化（图 2）。由于黏度较高，建议制备的细胞/水凝胶混合物体积比实际需要量多出至少 10%。
    ​注意：该水凝胶的特性此前已有描述39。

4. 体外 分化条件

  1. 向接种了间充质干细胞的透明质酸水凝胶构建物中加入 0.5 mL 软骨诱导分化培养基，每 2–3 天更换一次培养基。
  2. 培养 3 周后，更换为肥大软骨分化培养基（每孔 0.5 mL），继续培养构建物额外 2 周。

5. 体内 间充质干细胞移植

  1. 经过总共5周的 体外 培养后，按照先前所述方法，将构建物皮下植入裸鼠背部38,40.
  2. 称重小鼠，并通过腹腔注射给予由 0.75 mg/kg 体重（b.w.）美托咪定、4.0 mg/kg b.w. 咪达唑仑和 5.0 mg/kg b.w. 丁丙诺啡组成的混合麻醉剂，具体操作如所述38.
  3. 通过手术刺激下无活动反应确认麻醉充分，并在手术过程中定期观察胸部缓慢、规律的起伏运动以监测呼吸深度，通过粉红色黏膜颜色判断氧气供应充足。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
  4. 将小鼠俯卧位放置于无菌手术巾上，使用50 ppm次氯酸水（pH 5.0；HAW）对切口部位进行消毒，并在小鼠体表覆盖带孔无菌手术巾。
    ​注意：所有手术器械须经高压灭菌器、环氧乙烷气体或HAW进行灭菌。外科医生应清洗手指，并穿戴手术衣和手套。
  5. 使用剪刀沿脊柱中线在肩部和臀部区域分别做两个相距2厘米、长度均为5毫米的皮肤切口。
  6. 通过切口将刮匙皮下插入以创建皮下囊袋。
  7. 用镊子将两到三个构建体（每个约15 µL，见步骤5.1）插入每个口袋中。将多个HA构建体植入同一口袋时极易发生融合。为防止融合，应在每个口袋中仅插入一个HA构建体。
  8. 用4-0编织丝线缝合切口。按照所述方法，向小鼠注射麻醉拮抗剂，剂量为0.75 mg/kg体重的阿替美唑。38.
  9. 小鼠从麻醉中恢复期间，将其置于含有无菌垫料的无菌恢复笼内，笼内不放置食物和水瓶，并持续监测体温、脉搏和呼吸。
  10. 在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得将其无人看管。完全恢复后，将动物送回饲养室与其他动物一同饲养。
  11. 在愈合期间每隔几天监测动物是否有任何可能的并发症。在植入后4周和8周时，通过吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，尽量减少其痛苦。
  12. 用镊子在移植部位切开皮肤，取出植入的构建物。将构建物置于4%多聚甲醛中固定16小时，随后进行分析。

6. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准差（SD）报告定量数据。使用商业软件进行统计分析。
  2. 采用 Student's t-检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验，以确定组间显著性差异。p<0.05 和 p<0.01 表示两组之间存在显著性差异。

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结果

将包裹MSC的HA水凝胶培养在添加了TGFβ3的软骨诱导培养基中，TGFβ3是一种软骨生成诱导剂41（步骤4.1）。我们将HA的特性与胶原蛋白进行了比较，此前已有研究证明胶原蛋白在构建基于MSC的人工软骨移植物用于软骨内骨化方面具有有效性38。本研究未将未分化的MSC作为阴性对照，因为已有研究表明，未分化的MSC需要矿化表面作为启动底物，才能通过成骨分化（即膜内骨化）形成骨组织7。

透明质酸水凝胶的尺寸在整个过程中未发生变化 体外 培养周期，根据倒置显微镜下测量的直径判断，而作为对照的胶原水凝胶在培养开始后不久即出现收缩。为减小透明质酸与胶原构建物在培养后出现的尺寸差异 体外 在成软骨培养中，用于制备透明质酸（HA）水凝胶的间充质干细胞（MSCs）数量和凝胶体积均减半，与胶原水凝胶所用剂量相比有所减少。然而，经过3周的软骨培养后，HA构建物的湿重是胶原构建物的4倍。

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讨论

使用能够促进肥大软骨向骨组织转化的合适支架材料，是扩大基于间充质干细胞的工程化肥大软骨移植物并治疗具有临床意义尺寸骨缺损的有前景策略。本文表明，透明质酸（HA）是一种优异的支架材料，可支持基于间充质干细胞的肥大软骨组织的分化 体外 并促进软骨内骨形成 在体内38此外， 在体内HA 构建体被证实能够促进植入同一部位的多个构建体融合，形成单一的整合骨组织。由于间充质干细胞（MSCs）与支架材料的相互作用显著影响软骨形成及肥大性软骨生成，因此为促进软骨内骨化（ECO）选择合适的支架材料，对于制备具有临床应用效果的组织工程软骨移植物至关重要。包埋于 HA 水凝胶中的细胞从中心到边缘均一致呈现软骨细胞特征性的圆形形态，表明透明质酸为水凝胶内软骨的均匀形成提供了有利环境。21,30与HA不同，胶原蛋白通过整合素结合序列（RGDs）与MSCs相互作用；然而，这种相互作用的持续存在会阻碍MSCs在软骨形成途径中的进一步分化

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（KAKENHI）资助（资助编号：JP19K10259 和 22K10032，授予 MAI）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25 w/v% 胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA·4Na 溶液FUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
抗坏血酸-2-磷酸Nacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
碱性成纤维细胞生长因子ReprocellRCHEOT002 
牛血清白蛋白FUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess 自动细胞计数仪（含细胞计数板载玻片和 0.4% 台盼蓝染液）InvitrogenC10283
地塞米松MerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）MerckD6429高糖
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham 营养混合物 F-12）MerckD6421
胎牛血清HycloneSH30396.03
硫酸庆大霉素FUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045 10 mg/mL
Haccpper 发生器TechnoMaxCH-400-5QB50 ppm 次氯酸水
人源间充质干细胞LonzaPT-2501
HyStem 细胞培养支架试剂盒MerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G 添加剂FUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741×100
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺FUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200 mmol/L (×100)
L-脯氨酸Nacalai Tesque29001-42
L-甲状腺素MerckT1775
MSCGM 间充质干细胞生长培养基
BulletKit		LonzaPT-3001
石蜡FUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH 7.4 100 mlMedicago09-2051-100
TGF-β3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare 软膏SAVAVET/SAVA Healthcare
β-甘油磷酸钠FUJIFILM Wako Pure Chemical 048-34332

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