通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

摘要

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

摘要

传统的使用间充质干细胞（MSCs）的骨再生疗法难以应用于超过临界尺寸的骨缺损，因其缺乏诱导血管生成的机制。将由间充质干细胞（MSCs）构建的人工软骨组织植入体内，可诱导血管生成并促进骨形成 在体 通过软骨内成骨（ECO）实现。因此，这种由ECO介导的方法未来可能成为一种有前景的骨再生治疗策略。该ECO介导方法在临床应用中的一个重要方面是建立一套能够制备足量用于植入以修复骨缺损的软骨的方案。设计单一块状、尺寸和形状与实际骨缺损完全匹配的移植软骨尤其不具可行性。因此，所移植的软骨必须具备在植入多块时仍能整体形成骨组织的特性。水凝胶可能是扩大组织工程化移植物规模以满足临床需求、用于软骨内成骨的一种有吸引力的工具。尽管许多天然来源的水凝胶支持MSC软骨形成 体外 和 ECO 体内，目前尚未确定能够满足临床应用需求的最佳支架材料。透明质酸（HA）是软骨细胞外基质的关键组分，是一种可生物降解且生物相容性良好的多糖。本文表明，HA水凝胶具有优异的特性，可支持 体外 MSC来源的软骨组织分化及促进软骨内成骨 体内.

引言

自体骨由于创伤、先天性缺陷和手术切除所致的骨缺损修复仍是金标准。然而，自体骨移植存在显著局限性，包括供区疼痛、感染风险以及可从患者体内获取的骨量有限^1,2,3,4已开发出多种生物材料作为骨替代物，这些材料将天然或合成聚合物与矿化材料（如磷酸钙或羟基磷灰石）相结合。^5,6在这些工程材料中，通常利用矿化材料作为诱导物质，使干细胞通过膜内成骨（intramembrane ossification, IMO）过程直接分化为成骨细胞，从而实现骨形成。⁷该过程缺乏血管生成步骤，导致不足 体内 移植后移植物的血管化^8,9,10因此，采用此类方法治疗大段骨缺损可能并非最佳选择¹¹.

模拟软骨内成骨（ECO）过程的策略已被证明可....

方案

本实验方案使用4周龄的雄性裸鼠。将四只小鼠共同饲养在一个笼子中，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，温度22−24 °C，相对湿度50%−70%。所有动物实验均依照东京医科牙科大学机构动物护理和使用委员会批准的指南进行（批准编号：A2019-204C、A2020-116A 和 A2021-121A）。

1. 缓冲液与试剂的配制

1. 通过将间充质干细胞生长培养基补充剂套装加入间充质干细胞基础培养基中，配制间充质干细胞生长培养基（MSC growth medium），并在 4 °C 下保存。
2. 通过向 DMEM/F-12 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、50 µg/mL 硫酸庆大霉素、200 µM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和 1 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子，配制杜尔贝科改良伊格尔培养基与汉姆 F12 培养基（DMEM/F-12），并在 4 °C 下保存。
3. 使用前，在 DMEM 培养基中添加 1% ITS-G 补充剂、0.12% 牛血清白蛋白、50 µg/mL 硫酸庆大霉素、0.35 mM L-脯氨酸、100 nM 地塞米松和 10 ng/mL TGF-β3，配制软骨诱导培养基。
4. 使用前，在 DMEM 培养基中添加 10 mM β-甘油磷酸钠、0.12% 牛血清白蛋白、10 nM 地塞米松、200 µM 抗坏血酸-2-磷酸、50 nM L-甲状腺素....

结果

将包裹MSC的HA水凝胶培养在添加了TGFβ3的软骨诱导培养基中，TGFβ3是一种软骨生成诱导剂⁴¹（步骤4.1）。我们将HA的特性与胶原蛋白进行了比较，此前已有研究证明胶原蛋白在构建基于MSC的人工软骨移植物用于软骨内骨化方面具有有效性³⁸。本研究未将未分化的MSC作为阴性对照，因为已有研究表明，未分化的MSC需要矿化表面作为启动底物，才能通过成骨分化（即膜内骨化）形成骨组织⁷。

透明质酸水凝胶的尺寸在整个过程中未发生变化 体外 培养周期，根据倒置显微镜下测量的直径判断，而作为对照的胶原水凝胶在培养开始后不久即出现收缩。为减小透明质酸与胶原构建物在培养后出现的尺寸差异 体外 在成软骨培养中，用于制备透明质酸（HA）水凝胶的间充质干细胞（MSCs）数量和凝胶体积均减半，与胶原水凝胶所用剂量相比有所减少。然而，经过3周的软骨培养后，HA构建物的湿重是胶原构建物的4倍。

讨论

使用能够促进肥大软骨向骨组织转化的合适支架材料，是扩大基于间充质干细胞的工程化肥大软骨移植物并治疗具有临床意义尺寸骨缺损的有前景策略。本文表明，透明质酸（HA）是一种优异的支架材料，可支持基于间充质干细胞的肥大软骨组织的分化 体外 并促进软骨内骨形成 在体内³⁸此外， 在体内HA 构建体被证实能够促进植入同一部位的多个构建体融合，形成单一的整合骨组织。由于间充质干细胞（MSCs）与支架材料的相互作用显著影响软骨形成及肥大性软骨生成，因此为促进软骨内骨化（ECO）选择合适的支架材料，对于制备具有临床应用效果的组织工程软骨移植物至关重要。包埋于 HA 水凝胶中的细胞从中心到边缘均一致呈现软骨细胞特征性的圆形形态，表明透明质酸为水凝胶内软骨的均匀形成提供了有利环境。^21,30与HA不同，胶原蛋白通过整合素结合序列（RGDs）与MSCs相互作用；然而，这种相互作用的持续存在会阻碍MSCs在软骨形成途径中的进一步分化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 w/v% 胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA·4Na 溶液	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
抗坏血酸-2-磷酸	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
碱性成纤维细胞生长因子	Reprocell	RCHEOT002
牛血清白蛋白	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess 自动细胞计数仪（含细胞计数板载玻片和 0.4% 台盼蓝染液）	Invitrogen	C10283
地塞米松	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Merck	D6429	高糖
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham 营养混合物 F-12）	Merck	D6421
胎牛血清	Hyclone	SH30396.03
硫酸庆大霉素	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper 发生器	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm 次氯酸水
人源间充质干细胞	Lonza	PT-2501
HyStem 细胞培养支架试剂盒	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G 添加剂	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200 mmol/L (×100)
L-脯氨酸	Nacalai Tesque	29001-42
L-甲状腺素	Merck	T1775
MSCGM 间充质干细胞生长培养基 BulletKit	Lonza	PT-3001
石蜡	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH 7.4 100 ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare 软膏	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-甘油磷酸钠	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332