方法文章

使用间充质干细胞通过 体内 软骨内骨化进行整合骨形成

DOI：

10.3791/65573

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2023年7月14日

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1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

本文内容

摘要

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通过植入由间充质干细胞产生的人工软骨组织，通过软骨内骨化进行骨治疗有可能规避传统疗法的缺点。透明质酸水凝胶可有效扩大均匀分化的软骨移植物，并在 体内融合移植物之间形成具有血管化的整合骨。

摘要

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使用间充质干细胞 （MSC） 的常规骨再生疗法很难应用于大于临界尺寸的骨缺损，因为它没有诱导血管生成的机制。植入由间充质干细胞制成的人造软骨组织通过软骨内骨化 （ECO） 在 体内 诱导血管生成和骨形成。因此，这种ECO介导的方法可能是未来一种很有前途的骨再生疗法。这种 ECO 介导的方法临床应用的一个重要方面是建立一个方案，用于准备足够的软骨以植入以修复骨缺损。设计大小符合实际骨缺损形状的单个移植软骨块尤其不切实际。因此，被移植的软骨必须具有多块植入时整体形成骨骼的特性。水凝胶可能是一种有吸引力的工具，用于扩大用于软骨内骨化的组织工程移植物以满足临床要求。尽管许多天然衍生的水凝胶在 体外 支持MSC软骨形成，在 体内支持ECO，但满足临床应用需求的最佳支架材料尚未确定。透明质酸（HA）是软骨细胞外基质的重要组成部分，是一种可生物降解和生物相容的多糖。在这里，我们表明HA水凝胶具有优异的特性，可以支持基于MSC的软骨组织的 体外 分化，并促进 体内软骨内骨的形成。

引言

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自体骨仍然是修复因创伤、先天性缺损和手术切除引起的骨缺损的金标准。然而，自体骨移植具有显着的局限性，包括供体疼痛、感染风险和可从患者中分离出的骨量有限 1,2,3,4。许多生物材料已被开发为骨替代品，将天然或合成聚合物与矿化材料（如磷酸钙或羟基磷灰石）相结合 5,6。这些工程材料中的骨形成通常使用矿化材料作为启动材料来实现，以使干细胞通过膜内骨化 （IMO） 过程直接分化成成骨细胞7。该过程缺乏血管生成步骤，导致植入后移植物的体内血管化不足8,9,10，因此，使用这种过程的方法可能不是治疗大骨缺损的最佳方法11。

用于概括软骨内骨化 （ECO） 过程的策略已被证明可以克服与传统的基于 IMO 的方法相关的重大问....

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方案

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该方案使用4周龄的雄性裸鼠。在22-24°C和50%-70%相对湿度下，在12小时光/暗循环下将四只小鼠饲养在笼子中。所有动物实验均按照东京医科齿科大学机构动物护理和使用委员会批准的指南（批准编号:A2019-204C、A2020-116A 和 A2021-121A）进行。

1. 缓冲液和试剂的制备

  1. 通过将MSC生长培养基的补充试剂盒添加到MSC基础培养基中来制备间充质干细胞生长培养基（MSC生长培养基），并将其储存在4°C。
  2. 通过向培养基中加入10%胎牛血清（FBS），50μg/ mL庆大霉素，200μML-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1ng / mL碱性成纤维细胞生长因子来制备Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham's F12（DMEM / F-12）培养基，并将其储存在4°C。
  3. 使用前向DMEM中加入1%ITS-G添加剂，0.12%牛血清白蛋白，50μg/ mL庆大霉素，0.35mM L-脯氨酸，100nM地塞米松和10ng / mL TGF-β3来制备软骨培养基。
  4. 使用前向DMEM中加入10mM β-甘油磷酸盐，0.12%牛血清白蛋白，10nM地塞米松，200μM抗坏血酸-2-磷酸盐，50nM L-甲状腺素，50μg/ mL庆大霉素和50pg / mL IL-1β来制备肥厚培养基。
  5. 用200μL在60°C预热的熔化石蜡涂覆24孔培养皿....

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结果

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将MSC封装的HA水凝胶在补充有TGFβ3（软骨生成诱导剂41 ）的软骨形成培养基中培养（步骤4.1）。我们将 HA 的特性与胶原蛋白的特性进行了比较，胶原蛋白已被证明可有效创建用于软骨内骨化的基于 MSC 的人工软骨移植物，如前所述38。本研究中未将未分化的 MSC 列为阴性对照，因为已经证明未分化的 MSC 需要矿化表面作为启动基质，才能通过成骨分化（即膜内骨化）产生骨骼7。

透明质酸水凝胶的大小在整个 体外 培养期间没有变化，这是根据倒置显微镜下测量的直径判断的，而用于比较的胶原蛋白水凝胶在培养开始后不久就开始收缩。为了减少 体外 培养后 HA 和胶原构建体之间的大小差异，与用于制备 HA 水凝胶的凝胶相比，MSC 的数量和用于制造 HA 水凝胶的凝胶体积减半。然而，软骨培养 3 周后 HA 构建体的湿重是胶原构建体的 4 倍。

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讨论

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使用适当的支架材料来促进从肥厚软骨到骨骼的过渡，是扩大基于 MSC 的工程肥厚性软骨移植物和治疗具有临床意义的骨缺损的有前途的方法。在这里，我们表明 HA 是一种极好的支架材料，可在体外支持基于 MSC 的肥厚软骨组织的分化并促进体内软骨内骨形成 38。此外，在体内，HA构建体被证明可以促进植入同一口袋中的多个构建体的融合，以形成单个整合的骨骼。由于间充质干细胞与支架材料的相互作用会显着影响软骨和肥厚软骨生成，因此为 ECO 选择合适的支架材料对于产生临床有效的组织工程软骨移植物非常重要。嵌入HA水凝胶中的细胞从中心到外围均匀地表现出软骨细胞的圆形形态特征，表明透明质酸在整个水凝胶21,30中提供了有利于均匀软骨形成的环境。与 HA 不同，胶原蛋白通过整合素结合序列 （RGD） 与 MSC 相互作用;然而，这种相互作用的持续性阻止了MSCs在软骨形成途径43中进一步分化，这.......

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披露

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作者宣称不存在任何利益冲突。

致谢

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这项工作得到了日本科学振兴会（JSPS）的科学研究补助金（KAKENHI）的支持（资助号）。JP19K10259 和 22K10032 到 MAI）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25w/v% 胰蛋白酶-1mmol/L EDTA.4Na 溶液FUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku 工业
坏血酸-2-磷酸Nacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
碱性成纤维细胞生长因子ReprocellRCHEOT002 
牛血清白蛋白FUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess 自动细胞计数仪，带细胞计数室载玻片和台盼蓝染色剂 0.4%InvitrogenC10283
地塞米松MerckD8893
DomitorNippon Zenyaku 工业
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco 改良 Eagle 培养基MerckD6429高葡萄糖
Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基/营养混合物 F-12 火腿默克D6421
胎牛血清HycloneSH30396.03
硫酸庆大霉素FUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045 10 mg/mL
哈赛巴发生器TechnoMaxCH-400-5QB50 ppm次氯酸水
人间充质干细胞LonzaPT-2501
HyStem细胞培养支架试剂盒MerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G 补充剂FUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741&次100
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺FUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L （&次;100）
L-脯氨酸Nacalai Tesque29001-42
L-甲状腺素MerckT1775
MSCGM 间充质干细胞生长培养基
BulletKit		LonzaPT-3001
石蜡FUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100ml紫花09-2051-100
TGF-β;3 ProteintechHZ-1090
Vetorphale明治 Seika Kaisha
Visiocare 软膏SAVAVET/SAVA Healthcare
&β;-甘油磷酸酯FUJIFILM Wako Pure Chemical 电话：048-34332
抗盐

参考文献

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  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews....

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