利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

摘要

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过 密度梯度离心（DGC）可识别BEV的形态、粒径和浓度等物理特性，并探讨DGC方法在临床与科学研究中的潜在应用。

摘要

细菌胞外囊泡（BEVs）是由细菌产生的纳米级囊泡，在细菌与细菌之间以及细菌与宿主之间的通讯中发挥重要作用，可传递来自亲代细菌的蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子。源自肠道微生物群的BEVs不仅在胃肠道内发挥作用，还可到达远端器官，对生理和病理过程产生重要影响。理论上深入探究来源于人类粪便的BEVs的类型、数量及其功能，对于理解肠道微生物群分泌BEVs的机制及其生物学作用至关重要。这些研究同时也要求进一步优化当前BEVs的分离与纯化策略。

本研究通过建立两种密度梯度离心（DGC）模式——自上而下法（Top-down）和自下而上法（Bottom-up），优化了BEV的分离与纯化工艺。BEV在第6至第8组分（F6-F8）中富集分布。根据颗粒形态、大小、浓度及蛋白质含量评估该方法的有效性。计算了颗粒和蛋白质的回收率，并通过检测特异性标志物分析两种DGC模式的回收率与纯度。结果表明，自上而下离心模式的污染水平较低，且回收率和纯度与自下而上模式相当。7小时的离心时间足以实现每毫克粪便样本中10⁸个BEV的浓度。

除了粪便外，根据成分和黏度的差异进行适当修改后，该方法也可应用于其他类型的体液。总之，这一详细且可靠的方案将有助于标准化地分离和纯化BEVs，从而为后续的多组学分析和功能实验奠定基础。

引言

肠道被广泛认为是人体内定植微生物群落最丰富的器官，其中参与定植和增殖的细菌超过90%^1,2。大量证据表明，肠道微生物群通过受损的肠屏障调节肠道微环境，并与远端器官的功能障碍发生相互作用^3,4。越来越多的研究表明，肠道微生物群失衡与炎症性肠病（IBD）的进展^5,6以及通过肠-脑轴介导的认知障碍密切相关^5,6,7,8。细菌产生的细菌胞外囊泡（BEVs）在这些病理过程中发挥着重要作用。

细菌外膜囊泡（BEVs）是包裹细菌衍生物的纳米级颗粒，直径范围为20至400 nm。研究表明，这些颗粒能够促进细菌与其宿主生物之间的相互作用^9,10。尽管无法直接观察到，但由于其在诊....

方案

本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，并在取得参与者知情同意后进行。本研究所采用的所有方法均遵循国际人类微生物组标准（IHMS： http://www.microbiome-standards.org/）提供的标准操作指南。所有后续液体操作步骤均须在生物安全柜或超净工作台内进行。

1. 粪便样本的采集与分装

1. 向参与者分发粪便采样器、密封袋和冰盒，并提供详细的指导，说明如何采集和保存样本。
2. 指导每位参与者使用提供的采样器收集粪便样本，并在24小时内将样本运送至实验室，运输过程中保持温度为4 °C。
3. 样本送达实验室后，使用无菌勺将少于3.5 g的粪便分装至已预先称重的50 mL离心管中。在管壁上标注粪便样本的重量，以供后续预处理步骤使用。
   暂停点：若无法立即处理样本，应在做好相应记录后，将样本置于-80 °C长期保存。

2. 粪便样本制备

1. 将500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）置于4 °C预冷。使用50 mL注射器将预冷的PBS通过0.22 µm聚醚砜（PES）滤膜过滤，分装至十个50 mL离心管中。
2. 将两个50 mL离心管置于冰上，每管加入3.5 g粪便样本。向每管中加入35 mL PBS。
   注....

结果

确定富含细菌胞外囊泡（BEV）的组分分布
为确定富含细菌胞外囊泡（BEVs）的组分分布，设立空白对照以测定在OD 340 nm处的吸光度值，并根据测定结果及碘克沙醇说明书（步骤8.1）计算各组分的密度。表2展示了密度测定结果，显示F4至F9组分的密度处于通常与胞外囊泡相关的范围内。该结果表明，大部分BEVs被分离于这些组分中，因此将F4–F9定义为BEVs的粗略范围。采用透射电子显微镜（TEM）对从F4–F9组分中分离得到的粪便BEVs的形态特征进行表征，如图1所示。TEM图像（图2）显示存在典型的杯状结构，这是BEVs的特征性形态。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和双辛可宁酸蛋白定量法（BCA）分别测定颗粒数量和蛋白质浓度，以进一步评估回收率和纯度。图3展示了各组分的蛋白质和颗粒浓度，结果显示F6和F7组分的浓度最高，其次是F5和F8组分。随后进行考马斯亮蓝染色（CBBS）和蛋白质印迹.......

讨论

细菌胞外囊泡（BEVs）是由细菌分泌的脂质双层纳米颗粒，携带大量蛋白质、脂质、核酸及其他生物活性分子，有助于介导细菌的功能效应²⁰。源自肠道的BEVs已被证实参与炎症性肠病、克罗恩病和结直肠癌等疾病的发生发展，同时还影响整体代谢并介导认知功能障碍^{4,16,17,20,21,22,23,24,25,26}。目前，从人体样本——粪.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 %（w/v）戊二醛（用去离子水将2.5 %储备液稀释配制）	ACMEC	AP1126	在步骤8.3.3中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察
1 %（w/v）甲基纤维素（以去离子水从原始粉末配制）	Sigma-Aldrich	M7027	在步骤 8.3.6 中使用透射电子显微镜对 BEV 进行形态学观察
1.5 % (w/v) 醋酸铀酰（用去离子水从原始粉末配制）	Polysciences	21447-25	在步骤8.3.5中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察
1000 μL，200 μL, 10 μL 移液管	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	转移溶液
5 %（w/v）牛血清白蛋白溶液（用TBST缓冲液将原始粉末配制而成）	Fdbio 科学	FD0030	用于第 8.5.6 步的 Western 印迹封闭
5 × 上样缓冲液	Fdbio 科学	FD006	在第8.5.1步中用于蛋白质印迹和考马斯亮蓝染色
75 % (v/v) 乙醇	LIRCON	LIRCON-500 mL	表面消毒
96孔板	Rar	A8096	测定吸光度值
抗钙联蛋白抗体	Abcam	ab92573	蛋白质印迹（一抗）
抗CD63抗体	Abcam	ab134045	Western 印迹（一抗）
抗CD9抗体	Abcam	ab236630	蛋白质印迹（一抗）
抗鞭毛蛋白抗体	Sino Biological	40067-MM06	蛋白质印迹（一抗）
抗整合素β1抗体	Abcam	ab30394	蛋白质印迹（一抗）
抗LPS抗体	赛默飞世尔科技	MA1-83152	蛋白质印迹（一抗）
抗LTA抗体	赛默飞世尔科技	MA1-7402	蛋白质印迹（一抗）
抗OmpA抗体	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD，https://www.cusabio.com/	蛋白质印迹（一抗）
抗Syntenin抗体	Abcam	ab133267	蛋白质印迹（一抗）
抗TSG101抗体	Abcam	ab125011	蛋白质印迹（一抗）
高压灭菌	ZEALWAY	GR110DP	实验所用物品和培养基的灭菌
平衡	Mettler Toledo	AL104	用PBS平衡已加样的离心管
二辛可宁酸法测定	Fdbio 科学	FD2001	在步骤 8.2 测定 BEVs 的蛋白质含量
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	制备图1所示的BEVs分离与纯化的示意图工作流程
生物安全柜	Haier	HR1200-II B2	进行粪便样本处理的相关操作
Centrifuge 5810 R；转子 F-34-6-38	Eppendorf	5805000092；5804727002，适配器：5804774000	BEVs 预处理（步骤 3）
化学发光装置	BIO-OI	OI600SE-MF	用于第 8.5.12 步 Western 印迹中的信号检测
Cytation 5	BioTek	F01	用于测量吸光度（步骤 8.1）和荧光值（图 6）的微孔板检测仪
Dil标记的低密度脂蛋白	ACMEC	AC12038	干扰组分分布的定义
电泳设备	Bio-rad	1658033	用于第8.5.2、8.5.3和8.5.5步的蛋白质印迹实验中的蛋白质分离与转膜
增强型化学发光HRP试剂盒	Fdbio科学	FD8020	用于第8.5.12步的Western印迹信号检测
大肠杆菌	美国典型培养物保藏中心	ATCC8739	以BEVs作为阳性对照进行分离。方案：将25 g LB培养基粉末溶解于1 L去离子水中，高压灭菌。转移800 μ将保存的 L 型大肠杆菌接种至培养基中。37 ℃培养 °在培养摇床中孵育。然后在3,000离心 × 4℃下20分钟2000 × g离心 °C, 12, 000 × 4℃下30分钟3000 × g离心 °C，将上清液通过0.22 μm滤膜过滤 μm 膜，并在 160,000 下进行超速离心 × 4℃下70分钟离心，转速为g °C. 将定义为大肠杆菌粗提BEV的沉淀重悬于1.2 mL PBS中（步骤3、4）。
50 mL Falcon管	KIRGEN	KG2811	BEVs 预处理（步骤 3）
甲胎蛋白染色缓冲液	AbSci	ab.001.50	第8.5.4步考马斯亮蓝染色
滤纸	Biosharp	BS-TFP-070B	在步骤 8.3（吸取溶液）中使用透射电子显微镜对 BEV 进行形态学观察
铜网，Formvar/碳膜支持	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	在步骤8.3中使用透射电子显微镜对BEV进行形态学观察
HEPES 粉末	Meilunbio	MB6078	制备不同浓度的碘克沙醇缓冲液用于密度梯度离心
HRP AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L）	Fdbio 科学	FDM007	蛋白质印迹（二抗）
HRP AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）	Fdbio 科学	FDR007	蛋白质印迹（二抗）
摇床培养箱	Qiangwen	DHZ-L	培养大肠杆菌
Kimwipes™ 精细操作擦拭布	Kimtech Science	34155	在步骤 4.15 中擦拭超速离心管的内壁
LB肉汤	Hopebio	HB0128	培养大肠杆菌
低温冰箱（-80） °C)	Haier	DW-86L338J	储存样品
甲醇	Alalddin	M116118	用于第8.5.5步Western blot实验中PVDF膜的活化
1.5 mL 微量离心管	KIRGEN	KG2211	密度梯度离心后回收组分
2 mL 微量离心管	KIRGEN	KG2911	密度梯度离心后回收组分
5 mL 微量离心管	BBI	F610888-0001	密度梯度离心后回收组分
酶标仪	赛默飞世尔科技	Multiskan MK3	在步骤 8.2 测定 BEVs 的蛋白质含量
Millipore 滤膜 0.22 μm	默克密理博	SLGP033RB	过滤除菌；材质：聚醚砜，PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	密度梯度离心液
NaOH	GHTECH	1.01394.068	密度梯度离心溶液（pH 调整）
Optima™ XPN-100	贝克曼库尔特	A94469	第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	密度梯度离心储备液
轨道摇床	尤宁	CS-100	在步骤2中溶解粪便
磷酸盐缓冲液	Procell	PB180327	在第2步溶解粪便
移液器	Eppendorf	3120000267, 3120000259	转移溶液
塑料巴斯德吸管	ABCbio	ABC217003-4	在预处理步骤3.4中去除上清液
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	用于第8.5.5步蛋白质印迹中的蛋白转膜
预制聚丙烯酰胺凝胶，4–20% 15孔板	ACE	F15420Gel	用于第8.5.2、8.5.3步的蛋白质印迹实验中的蛋白质分离
一抗稀释液	Fdbio 科学	FD0040	在第 8.5.8 步的蛋白质印迹实验中使用
蛋白标准品	Fdbio 科学	FD0672	在第8.5步中用于蛋白质印迹和考马斯亮蓝染色
快速蛋白质印迹溶液	UBIO	UW0500	用于第8.5.5步蛋白质印迹中的蛋白转印
SW 32 Ti 摆动桶转子	贝克曼库尔特	369650	第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心
20 mL、50 mL 注射器	捷运通道	ZSQ-20ML，YCXWJZSQ-50 mL	转移缓冲液并去除预处理中的上清液
TBS 粉末	Fdbio 科学	FD1021	在第 8.5 步的蛋白质印迹实验中使用
透射电子显微镜（TEM）	日立	H-7650	第8.3步中对BEV的形态学观察
Tween-20	Fdbio 科学	FD0020	在第8.5步的蛋白质印迹实验中使用
超速离心管	贝克曼	326823, 355642	第4步和第7步中用于BEVs分离的超速离心
超净工作台	AIRTECH	SW-CJ-2FD	执行液体处理的相关操作
水浴锅	Bluepard	CU600	用于第8.2.5步中测量BEVs的蛋白质含量
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734，软件 ZetaView（版本 8.05.14 SP7）	纳米颗粒跟踪分析（NTA）用于在步骤 8.4 中测量 BEV 的粒径和浓度