口鼻瘘小鼠模型的建立

口鼻瘘 （ONF） 是口腔和鼻腔之间的异常开口，临床表现为从肺泡突到悬雍垂的结构区域缺陷，通常作为腭裂修复后的并发症发生¹.ONF 患者会出现食物反流、发音障碍和腭咽功能受损，显着影响他们的生活质量 ^2,3,4。术后 ONF 的发生率在 2.4% 至 55% 之间，这是由于裂隙宽度、Veau 类型和手术方法⁵、⁶、^7、8 等因素造成的。此外，ONF修复后的复发率很高，从0%到43%^不等9。

最近，几种新的治疗方法在ONF领域显示出前景，包括不同的材料、药物和新技术10,11,12,13,14,15,16,17。准确评估治疗效果至关重要，因为它为选择和进一步开发ONF治疗提供了基础。然而，在短期内获得手术以外的治疗效果的有效评估具有挑战性，因为不同患者的 ONF 特征各不相同。因此，建立ONF疾病模型对于验证这些治疗方法的有效性是必要的。

几十年来，研究人员在各种动物物种中生成了口鼻瘘 （ONF） 模型，包括大鼠^18,19、仔猪^20、21、迷你猪 22 和狗 ^23，因为这些物种具有适合手术操作的大量硬腭。然而，小鼠的基因序列和全基因组与人类相似，使其成为研究和开发新药的重要模型24,25,26。此外，小鼠在批次之间几乎没有变化，使它们成为建立ONF模型^12,13,27的有利选择。

但是，没有描述创建ONF的详细步骤，也没有考虑ONF大小的稳定性。此外，ONF形成的验证仅依赖于观察²⁸，而没有确保口腔和鼻腔之间的直接沟通。它没有通过其他方式得到证明，例如由于ONF引起的进食困难导致小鼠体重减轻。此外，没有考虑伤口大小的正常变化，这对于研究促进或抑制伤口愈合的药物或材料至关重要。因此，迫切需要建立一个稳定且经过验证的ONF模型。

本研究的目的是开发一个实用的 ONF 模型来解决上述问题，希望该协议将成为未来研究腭伤口愈合机制和 ONF 新疗法的基础。

本研究中的所有动物手术均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会审查批准。本研究采用成年C57BL/6小鼠（雌性）。

1. 手术准备

1. 收集手术所需的手术器械:生发器，眼科烧灼器，显微外科剪刀，显微外科镊子，注射器和针头（26g×0.63英寸）（图1A，B）（见材料表）。
   注意:在外科手术之前，将手术器械（包括眼科烧灼器、显微外科镊子和显微外科剪刀）高压灭菌，在 102.9 kPa （1.05 kg/cm²） 和 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
2. 收集所需的手术用品:手术单、乳胶手套、无菌棉、无菌床单、无菌金属箔、作为手术平台的泡沫板、橡皮筋（可以通过撕开医用乳胶手套获得）和胶带（图 1C）（见 材料表）。
   注意:为每只小鼠使用一套单独的耗材，包括用于手术区域的注射器和无菌片。
3. 使用酒精湿巾清洁手术区域和器械（光源、泡沫板和温度维持装置，见 材料表）。用无菌金属箔盖住手术过程中可能需要的器械的旋钮和把手。
4. 无菌地打开各个器械，并小心地将它们放置在手术区域。激活发芽剂（参见 材料表）和在手术过程中使用的灯。将眼科烧灼器放入发芽器中，加热至250°C20分钟。

2. 外科手术

1. 按照以下步骤固定鼠标并打开口腔。
   1. 选择一只体重20-25克、年龄为8-12周龄的雌性C57BL/6J小鼠。在进行任何程序之前将小鼠放置 7 天。
   2. 通过腹膜内注射Zoletil50（80mg / kg）和甲苯噻嗪（5mg / kg）麻醉小鼠（参见 材料表）。将眼科眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上。等到没有脚趾捏反应。
      注意: 当鼠标无法独立翻转时，鼠标已准备好进行该过程。
   3. 将鼠标固定在衬有无菌床单的泡沫板上。使用胶带将鼠标以仰卧姿势绑在手术平台上（图2A）。
   4. 打开小鼠的口腔。将两根针（26 g x 0.63 英寸）放在眶耳平面的前面，再放置两根针。将橡皮筋放在针头上，然后交叉门牙以保持嘴巴张开。使用显微外科镊子撑开嘴角（图2B）。
      注意:确保硬腭清晰暴露。将舌头固定在橡皮筋下方，以防止在随后的实验中阻碍视野和燃烧。
2. 在硬腭上创建口鼻瘘（ONF）（图3A-F）。
   1. 取回眼科烧灼器，将其加热至250°C20分钟。将烧灼尖端放置在距离上颚中线和第一前磨牙线交汇处 1 毫米处，在中线的硬腭上造成全层粘膜损伤。
      注意: 避免烫伤鼠标的舌头。
   2. 几秒钟后，当烧灼尖端周围的粘膜变白时，取下眼科烧灼器。
   3. 将眼科烧灼器置于萌发器中，继续加热至250°C10分钟。重复上一步，扩大边缘周围的伤口，直到其长度达到 2.0 毫米，宽度达到 1.5 毫米。
      注意:每次延伸都应遵循最后一次受伤的边缘。使用游标卡尺测量受伤的长度和宽度。损伤应覆盖上颚的 10%。
   4. 使用显微外科剪刀去除伤口周围多余的变性软组织。使用无菌棉止血，防止小鼠吸入性窒息。测量伤口，确保其在中线形成 2.0 x 1.5 毫米的全层硬腭粘膜损伤。

3. 术后护理

1. 在术后觉醒时给予小鼠美洛昔康，剂量为5mg / kg / d，持续3天，皮下注射²⁹。
2. 将鼠标放在温度维持装置上，直到它完全恢复意识。
   注意: 确保鼠标的位置有利于呼吸。每10-15分钟旋转一次小鼠，以防止血液淤积或肺叶塌陷。一旦老鼠热身，将其放回笼子里。在笼子底部提供无菌果冻和辐照饲料供小鼠食用。

4. 口鼻瘘的形成验证

注意:口鼻瘘 （ONF） 创建的成功率在手术后的第 7 天进行评估。

1. 准备必要的手术用品:橡皮筋、胶带、注射器、手术单、乳胶手套、无菌床单、无菌金属箔和泡沫板。
2. 佩戴手术单和无菌手套以保持无菌状态。用酒精对泡沫板、光源、保温装置进行消毒。
3. 通过腹膜内注射Zoletil50（80mg / kg）诱导全身麻醉。等到没有脚趾捏反应。使用步骤 2.1.3 和 2.1.4 中描述的相同方法固定鼠标并暴露硬腭。
4. 通过确保隔膜在伤口部位仍然可见来进行解剖结构验证，表明ONF创建成功（图4A，B）。
5. 进行功能验证:关闭小鼠的口腔，并使用无菌注射器将无菌水注入其口腔。当液体从小鼠的鼻孔流出时，ONF的成功产生得到确认。
6. 将鼠标放在温度维持装置（37°C）上，直到它完全恢复意识。每10-15分钟旋转一次小鼠，以防止血液淤积或肺叶塌陷。

为了评估该实验方法的可行性和稳定性，对 10 只小鼠进行了相同的程序，并观察了死亡率、伤口大小、体重和组织学分析的变化。小鼠在第7天被安乐死。

该手术的死亡率较低。眼科烧灼器和萌发器，如图1A-C所示，是本实验中使用的关键仪器。ONF模型是根据提供的协议创建的。在手术的10只小鼠中，只有1只在手术后第7天死亡。整个实验的总体死亡率约为10%。

结果显示，使用所述方法生成的ONF大小存在显着差异。在手术当天，所有小鼠都表现出椭圆形伤口，长2.0毫米，宽1.5毫米。在手术后第 7 天评估 ONF 形成时，观察到 ONF 大小的显着变化 （P = 0.0085）（图 5A，B）。

ONF的存在可导致食物反流和进食困难等并发症，可能导致体重变化。因此，小鼠的体重也被考虑在内。在手术当天（第1天）和第7天（第7天）对小鼠进行称重，检查ONF形成。与第 1 天相比，第 7 天观察到体重显着减轻 （P < 0.001）（图 6A、B）。他们的体重减轻了25.16%。

对于组织学分析，在第 7 天从小鼠身上采集伤口和正常组织。分离的上颚被用作组织学切片的样本。将它们置于组织包埋盒中，并使用 4% 多聚甲醛和 10% 甲酸脱钙试剂固定。然后将组织包埋在石蜡中，沿冠状平面切成 7 μm 切片，并用苏木精和伊红 （H&E） 染色。ONF的组织学分析显示硬腭粘膜缺失、剥落骨和ONF形成（图7）。进行肺部组织学检查，在正常小鼠和ONF小鼠之间未检测到异常。

图1:手术器械和用品 。 （A）用于加热眼科烧灼器的萌发器。（B） 手术器械:眼科烧灼器、显微外科剪刀、显微外科镊子、注射器和针头（26 克 x 0.63 英寸）。（三）手术用品:手术单、无菌手套、无菌棉、无菌片、无菌金属箔、泡沫板、橡皮筋、胶带。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:小鼠的固定和口腔的开口。 （A）用胶带固定小鼠的前肢。（B） 将注射器针头插入泡沫板，并在针头上放一根橡皮筋。使用橡皮筋和显微外科镊子打开小鼠的口腔。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:口鼻瘘的形成 。 （A） 暴露口腔。（B） 将眼科烧灼器的尖端放在硬腭的中线部分。（C） 移除眼科烧灼器。（D） 使用显微外科剪刀去除伤口周围多余的软组织。（E） 使用无菌棉止血。（F） 最终形成的腭伤口。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:术后第 7 天腭伤口检查 。 （A） 第 1 天的腭部伤口。（B） 第 7 天腭部伤口。白色箭头表示口鼻瘘 （ONF）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:第 1 天和第 7 天的腭伤口大小。 （A） 小鼠在第 1 天和第 7 天的平均值。（B） 使用配对样本 t 检验验证的显着差异。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6:第 1 天和第 7 天小鼠的体重。 （A） 小鼠在第 1 天和第 7 天的平均值。（B） 使用配对样本 t 检验验证的显着差异。请点击这里查看此图的较大版本.

图7:组织学观察。 ONF 的组织学分析显示硬腭黏膜缺失、骨剥离和 ONF 形成。（A） 第 7 天口鼻瘘，放大倍数:4 倍。 （B） 第 7 天口鼻瘘，放大倍数:10 倍。 （C） 无损伤控制，放大倍数:4 倍。 （D） 无损伤控制，放大倍数:10 倍。黑色箭头显示 ONF 的位置。比例尺: A，C = 200 μm; B，D = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

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