建立经口鼻瘘小鼠模型

摘要

本文概述了建立具有口鼻瘘小鼠模型的逐步操作流程。通过使用加热的眼科烧灼器损伤硬腭中线部分，导致口腔与鼻腔之间形成开口，从而建立口鼻瘘。

摘要

本研究介绍了一种利用加热的眼科烧灼器建立口腔鼻腔瘘模型的有效方法。采用C57BL/6小鼠建立口腔鼻腔瘘（ONF）模型。为构建ONF，首先对小鼠进行麻醉和固定，并暴露其硬腭。在手术过程中，使用眼科烧灼器在硬腭中线处造成一个2.0 × 1.5 mm的全层黏膜损伤。为确保实验成功，关键在于控制ONF的大小并尽量减少出血。术后第7天通过解剖学和功能学评估验证ONF模型的有效性。鼻中隔在口腔内的出现，以及向口腔内注射无菌水后从鼻孔流出的现象，证实了ONF模型的成功建立。该模型表现出实用且稳定的口腔鼻腔瘘特征，具有较低的死亡率、显著的体重变化以及较小的ONF尺寸变异。未来的研究可考虑采用此方法，以阐明腭部伤口愈合的机制，并探索口腔鼻腔瘘的新型治疗方法。

引言

口鼻瘘（ONF）是口腔与鼻腔之间的异常开口，临床上表现为从牙槽突至悬雍垂之间解剖结构的缺损，常为腭裂修复术后的一种并发症¹。ONF患者可出现食物反流、发音障碍及腭咽功能受损，显著影响其生活质量^2,3,4。由于裂隙宽度、Veau分型及手术方法等因素的影响，术后ONF的发生率介于2.4%至55%之间^5,6,7,8。此外，ONF修复术后的复发率也较高，范围为0%至43%⁹。

近年来，眶周骨折（ONF）领域出现了多种有前景的新疗法，包括不同的材料、药物以及新型技术^{10,11,12,13,14,15,16,17}。准确评估治疗效果至关重要，因为这是选择和进一步开发ONF治疗方法的基础。然而，除手术外，短期内对其他治疗效果进行有效评估具有挑战性，因为不同患者的ONF特征存在差异。因此，建立ONF疾病模型对于验证这些治疗方法的有效性十分必要。

几十年来，研究人员已在多种动物物种中建立了口鼻瘘（ONF）模型，包括大鼠^18,19、仔猪^20,21、小型猪²²和犬²³，因为这些物种具有较发达的硬腭，适合进行外科操作。然而，小鼠的基因序列和全基因组与人类高度相似，使其成为研究和开发新药的重要模型^24,25,26。此外，小鼠在不同批次间的个体差异较小，因此是建立ONF模型的理想选择^12,13,27。

然而，创建口鼻瘘（ONF）的详细步骤并未被描述，且未考虑ONF大小的稳定性。此外，ONF形成的验证仅依赖于观察²⁸，并未确认口腔与鼻腔之间是否存在直接连通。也未通过其他方式加以证明，例如小鼠因ONF导致进食困难而出现体重下降。此外，研究中未考虑伤口大小的正常变异，而这一点对于促进或抑制伤口愈合的药物或材料研究至关重要。因此，迫切需要建立一种稳定且经过验证的ONF模型。

本研究的目的是建立一种实用的口腔鼻瘘模型，以解决上述问题，希望本方案能为未来关于腭部伤口愈合机制及口腔鼻瘘新疗法的研究奠定基础。

方案

本研究中的所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会审查并批准。本研究使用成年C57BL/6小鼠（雌性）。

1. 手术准备

1. 准备手术所需器械：接种环、眼科烧灼器、显微外科剪、显微外科镊、注射器和针头（26 g × 0.63 英寸）（图 1A、B）（参见材料表）。
   注意：手术前，将手术器械（包括眼科烧灼器、显微外科镊和显微外科剪）在 102.9 kPa（1.05 kg/cm²）和 121 °C 条件下高压灭菌 20 分钟。
2. 准备所需的手术耗材：手术巾、乳胶手套、无菌棉、无菌敷料、无菌金属箔、作为手术平台的泡沫板、橡皮筋（可通过撕开医用乳胶手套获得）以及胶带（图 1C）（参见材料表）。
   注意：每只小鼠应使用独立的一套耗材，包括用于手术区域的注射器和无菌敷料。
3. 使用酒精擦拭清洁手术区域及设备（光源、泡沫板和温度维持装置，参见材料表）。用无菌金属箔覆盖手术过程中可能接触的仪器旋钮和手柄。
4. 无菌条件下打开各器械包装，并小心放置于手术区域。启动接种环（参见材料表）及照明设备以备使用。将眼科烧灼器放入接种环中，加热至 250 °C，持续 20 分钟。

2. 手术步骤

1. 按照以下步骤固定小鼠并打开口腔。
   1. 选择一只体重为20-25 g、年龄为8-12周的雌性C57BL/6J小鼠。在进行任何操作前，将小鼠饲养7天。
   2. 通过腹腔注射Zoletil50（80 mg/kg）和 Xylazine（5 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见材料表）。在小鼠眼睛上涂抹眼科眼膏。等待直至小鼠对脚趾夹捏无反应。
      ​注意：当小鼠无法自主翻身时，表明其已准备好接受操作。
   3. 将小鼠固定在铺有无菌布的泡沫板上。使用胶带将小鼠以仰卧位固定在手术平台上（图2A）。
   4. 打开小鼠口腔。在眶耳平面之前插入两根 针头（26 g ×  0.63 英寸），并在其后方再插入两根。将橡皮筋绕过针头并穿过门齿，以保持口腔张开。使用显微外科镊子撑开嘴角（图2B）。
      注意：确保硬腭充分暴露。将舌头固定在橡皮筋下方，以防止视野受阻以及后续实验中发生烫伤。
2. 在硬腭上建立口鼻瘘（ONF）（图3A-F）。
   1. 取出已加热至250 °C并维持20分钟的眼科烧灼器。将烧灼器尖端置于硬腭中线与第一前磨牙连线交点处前方1 mm位置，在硬腭中线处造成贯穿全层黏膜的损伤。
      注意：避免烫伤小鼠舌头。
   2. 数秒后，当烧灼器尖端周围的黏膜变为白色时，移开烧灼器。
   3. 将烧灼器放回加热装置中，并继续加热至250 °C，维持10分钟。重复前述步骤，沿创口边缘逐步扩大损伤，直至创口达到2.0 mm长、1.5 mm宽。
      注意：每次扩展应紧贴前一次损伤的边缘进行。使用游标卡尺测量创口的长度和宽度。创口面积应占硬腭总面积的10%。
   4. 使用显微外科剪刀清除创口周围多余的变性软组织。用无菌棉球止血，防止小鼠发生吸入性窒息。测量创口，确保其为位于中线、大小为2.0 × 1.5 mm的贯穿全层硬腭黏膜损伤。

3. 术后护理

1. 向小鼠给予美洛昔康 术后苏醒时，皮下注射，每日5 mg/kg，持续3天²⁹.
2. 将小鼠置于体温维持装置中，直至其完全恢复意识。
   ​注意：应确保小鼠的体位有利于呼吸。每隔10-15分钟旋转小鼠一次，以防止血液淤积或肺叶塌陷。待小鼠体温恢复后，将其放回笼中，并在笼底提供无菌果冻和辐照饲料供其食用。

4. 口鼻瘘创建的验证

注意：在手术后第7天评估口鼻瘘（ONF）造模的成功情况。

1. 准备必要的手术用品：橡胶带、胶带、注射器、手术单、乳胶手套、无菌敷料、无菌金属箔和泡沫板。
2. 穿戴手术单和无菌手套以维持无菌条件。使用酒精对泡沫板、光源和温度维持装置进行消毒。
3. 通过腹腔注射 Zoletil50（80 mg/kg）诱导全身麻醉。等待直至小鼠对足趾夹捏无反应。采用与步骤 2.1.3 和 2.1.4 相同的方法固定小鼠并暴露硬腭。
4. 进行解剖结构验证：确保伤口处仍可见鼻中隔，表明成功建立了口腔鼻腔瘘（ONF）（图 4A、B）。
5. 进行功能验证：闭合小鼠口腔，使用无菌注射器向其口腔内注入无菌水。当液体从小鼠鼻孔流出时，表明口腔鼻腔瘘（ONF）成功建立。
6. 将小鼠置于温度维持装置（37 °C）上，直至其完全恢复意识。每 10–15 分钟翻转小鼠一次，以防止血液淤积或肺叶塌陷。

结果

为评估该实验方法的可行性和稳定性，对十只小鼠进行了相同的操作，并观察了死亡率、伤口大小变化、体重变化及组织学分析结果。小鼠于第7天被实施安乐死。

该手术的死亡率较低。眼科烧灼器和发生器（如图1A-C所示）是本实验使用的关键器械。视神经挫伤模型是根据所提供的方案建立的。在十只接受手术的小鼠中，仅有一只在术后第7天死亡。整个实验期间的总体死亡率约为10%。

结果表明，采用所述方法生成的ONF在尺寸上表现出显著差异。在手术当天，所有小鼠均呈现椭圆形伤口，长度为2.0 mm，宽度为1.5 mm。在术后第7天评估ONF形成情况时，观察到ONF尺寸存在显著差异（P = 0.0085）（图5A，B）。

ONF 的存在可能导致食物反流和进食困难等并发症...

讨论

研究人员已探索了多种材料、药物和新技术用于治疗ONF^{10,11,12,13,14,15,16,17}。随着外科手术技术的进步，ONF的发生率和复发率已有所降低。然而，由于该疾病具有独特特性，临床上ONF患者数量有限，因此需要建立标准化模型以研究潜在治疗方法。尽管已有若干建立ONF模型的方法被报道^18,19,20,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
发芽器	Electron Microscopy Sciences	66118-20	加热与消毒设备
乳胶手套	Allmed		或类似产品
光源	Olympus	A1813
美洛昔康	MedChemExpress	HY-B0261	研碎；5 mg/kg
显微外科器械（剪刀和镊子）	江苏同慧医疗器械有限公司	M-Y-0087	外科器械
眼科烧灼器	宿迁文冲医疗器械有限公司	1.00234E+13	外科器械
无菌棉	盐城贝谷科技有限公司		或类似产品
无菌金属箔	Biosharp		或类似产品
无菌单	3M	XH003801129	或类似产品
手术铺巾	盐城贝谷科技有限公司		或类似产品
注射器	盐城贝谷科技有限公司	S-015301	或类似产品
胶带	Bkmamlab		或类似产品
体温维持装置	Harvard Apparatus	LE-13-2104
赛拉嗪50	Virbac		80 mg/kg