皮内微透析：一种研究人类微血管功能障碍新机制的方法

摘要

皮内微透析是一种用于研究健康与疾病状态下微血管功能的微创技术。该技术可采用剂量-反应和局部加热方案，以探究皮肤循环中血管舒张和血管收缩的机制。

摘要

皮肤血管系统是一种易于获取的组织，可用于评估人类的微血管功能。皮内微透析是一种微创技术，用于研究皮肤循环中血管平滑肌和内皮功能的机制。该技术可通过药理学手段解析微血管内皮功能障碍的病理生理过程，其指标为一氧化氮介导的血管舒张能力下降，这是心血管疾病发生风险的标志。在该技术中，将微透析探针置入皮肤真皮层，并在探针上方放置带有激光多普勒血流仪探头的局部加热装置，以测量红细胞通量。通过直接施加热刺激来控制或激发局部皮肤温度，同时经探针灌注药理学试剂，以激活或抑制细胞内信号通路，从而诱导血管舒张或血管收缩，或探究特定机制（如辅因子、抗氧化剂等）。通过量化皮肤血管传导率，可明确疾病状态下内皮功能障碍的机制。

引言

心血管疾病（CVD）是美国最主要的死亡原因¹。高血压（HTN）是中风、冠心病和心力衰竭的独立危险因素，估计影响美国约50%以上的人口²。高血压可作为独立的心血管疾病发生（原发性高血压），也可由其他疾病引起，例如多囊肾病和/或内分泌系统疾病（继发性高血压）。高血压病因的多样性使其相关基础机制及靶器官损害的研究变得复杂。目前亟需采用多样且新颖的研究方法，深入探讨与高血压相关的靶器官损害的病理生理学机制。

心血管疾病（CVD）最早期的病理学征象之一是内皮功能障碍，其特征为一氧化氮（NO）介导的血管舒张功能受损^3,4,5。血流介导的血管舒张是量化与CVD相关的内皮功能障碍的常用方法，但微血管床的内皮功能障碍既可独立于大导管动脉发生，也可先于后者出现^6,7,8。此外，与导管动脉相比，阻力小动脉更直接受局部组织影响，并对富氧血液的输送具有更直接的调控作用。微血管功能可预测心血管不良事件发生前的无事件生存期^9,10,11。皮肤微血管系统是一种易于获取的血管床，可用于研究其对生理性和药理性缩血管或扩血管刺激的反应。皮内微透析是一种微创技术，旨在通过靶向性药理学分离手段，研究皮肤微血管中血管平滑肌和内皮功能的机制。该方法与其他技术形成对比：例如，缺血后反应性充血无法实现药理学分离；离子导入法则虽可实现药物递送，但其作用机制的精确性较低（其他文献已有详尽综述¹²）。

该技术的开发与应用原理已在其他文献中得到广泛综述¹³。该方法最初为啮齿类动物神经科学研究而开发，随后首次应用于人类，以从体温调节的角度探讨主动血管舒张的机制。在20世纪90年代后期，该方法被用于研究皮肤局部加热相关的神经和内皮机制。自此以后，该技术已被用于探究皮肤中的多种神经血管信号传导机制。

利用该技术，我们团队及其他研究者已探讨了多种临床人群中微血管内皮功能障碍的机制，包括但不限于血脂异常、原发性衰老、糖尿病、慢性肾病、多囊卵巢综合征、子痫前期、重度抑郁症^{14,15,16,17,18,19}以及高血压^{20,21,22,23,24}。例如，既往一项研究发现，有子痫前期病史但血压正常的女性（其心血管疾病风险升高）与有正常血压妊娠史的女性相比，皮肤循环中一氧化氮（NO）介导的血管舒张功能降低²⁰。另一项研究显示，被诊断为原发性高血压（HTN）的成人与健康对照组相比，其微血管对血管紧张素II的敏感性增加²¹；而在原发性高血压患者中，长期使用巯基供体类降压药物治疗已被证明可降低血压，并改善硫化氢和一氧化氮介导的血管舒张功能²²。Wong 等人²³发现，处于高血压前期的成人存在感觉介导和一氧化氮介导的血管舒张功能受损，这与我们的发现一致：即根据2017年美国心脏协会和美国心脏病学会指南所定义的高血压分期，内皮功能障碍随高血压阶段的进展而加重²⁴。

皮内微透析技术可对健康和疾病状态下微血管功能的机制进行严格控制的研究。因此，本文旨在介绍本研究团队及其他研究者所应用的皮内微透析技术。我们详细描述了通过乙酰胆碱（ACh）进行内皮药理学刺激以考察剂量-反应关系的操作流程，以及采用39 °C或42 °C局部加热刺激方案对内源性一氧化氮（NO）生成进行生理学刺激的方法。我们展示了每种方法的代表性结果，并讨论了由此技术所得发现的临床意义。

方案

所有操作均在招募参与者之前获得宾夕法尼亚州立大学机构审查委员会的批准。

1. 仪器设备设置

1. 打开局部加热装置和激光多普勒血流仪。
   注意：根据制造商的说明，在数据采集前应完成两者的校准。激光多普勒血流仪应连接至数据采集硬件，采样频率设置为 100 Hz（每分钟 100 个样本），并在数据采集软件中进行连续记录。尽管可使用其他数据采集硬件和软件，为简便起见，后续操作说明均基于 PowerLab 硬件和 LabChart 软件的功能。
2. 打开一个 LabChart 软件文件。
   注意：应预先创建一个包含所需数据输入和连续数据采集功能的参考文件。每个微透析位点应对应一个激光多普勒和一个局部加热器的显示面板，且这些面板应与数据采集硬件单元中的相应通道输入相对应。

2. 微透析探针的放置

1. 在前臂掌侧皮肤上辨认出明显可见的较大血管，并用永久性记号笔标记（必要时可使用止血带以帮助观察血管；对于色素较深的皮肤，可能需要更多依赖触诊来识别血管）。
2. 用碘伏棉签擦拭标记区域及其周围较大范围的皮肤，再用酒精棉签擦去碘伏。用无菌洞巾覆盖已消毒的皮肤区域，并敷冰约5分钟以使该区域麻木。
3. 移除冰块，将套管针（23 G，25 mm 长）斜面朝上插入皮肤真皮层，深度为 2–3 mm（根据个体皮肤厚度而定）。推进针头时注意保持在真皮层内，从距离进针点约 20 mm 处穿出皮肤。
   注意：为确认针头在皮肤内放置的深度是否合适，应能观察到针头的形状并可轻易触知，但针头的颜色应被遮盖。若实验需要使用多个微透析探针，则任意两个引导针的植入位置应相距至少2.5 cm，并在插入微透析探针前完成定位。探针不应沿同一条主要血管放置。
4. 保持针头位置不变，连接探头（通过 将鲁尔锁接头连接至含有乳酸林格液的注射器。将探针的另一端穿过套管针，直至探针的半透膜接近但仍在套管针开口外部。缓慢灌注少量林格液通过纤维，直至可见液体经膜孔渗出，以确认膜的完整性。
5. 若使用哈佛大学生物科学公司（Harvard Bioscience）的微透析探针及导入针，请执行步骤 2.5.1–2.5.2。
   1. 确认探针功能正常后，继续将探针经导入针推进，直至膜完全位于导入针内的皮肤真皮层中。
   2. 用手指将探针固定在靠近针头的近端位置，然后朝与插入方向相反的方向拔出针头。用胶带将光纤外露部分固定在皮肤上，以防止实验过程中半透膜发生移位。
6. 若使用Bioanalytical Systems微透析探针及导入针，请执行步骤2.6.1-2.6.2。
   1. 确认探针功能正常后，用一只手握住套管针的针座和微透析探针的远端部分，同时将套管针沿与插入方向相反的方向撤出，使微透析探针就位。
   2. 根据需要调整探头，确保半透膜完全埋入皮肤内。用胶带将外部光纤固定在皮肤上，以防止实验过程中半透膜发生移位。

3. 充血

1. 在等待针头插入后引起的充血反应消退期间（约60–90分钟），将一次性注射器放入微量输注泵的注射器架托盘中。在充血阶段，以2 µL/min的流速灌注乳酸林格液、生理盐水或溶剂溶液（即实验性药理学试剂所溶解的溶液）。
   注意：在此约60至90分钟的阶段内，微透析探针不得移除，但受试者可调整身体姿势或移动手部；也可将探针的鲁尔锁从注射器上取下，并用胶带将其固定于受试者手臂，以便其短暂站立并自由活动。一旦安装局部加热器和激光多普勒血流仪（LDF）探针并开始数据采集，LDF探针即不可移动。
2. 当皮肤发红（针刺创伤后充血反应的指标）消退后，将局部加热装置连接到覆盖半透膜的皮肤上 通过 确保加热器的中心与微透析探针的路径对齐，固定探针粘附盘。
3. 将LDF探头放入局部加热器中央的开口处，使激光垂直于皮肤表面。放置并固定好LDF探头后，点击 开始 在数据采集软件上持续记录并显示红细胞流量值（RBC flux；灌注单位，PUs）。若充血已完全消退，红细胞流量将稳定在约5–20 PU（激光多普勒血流监测探头下方血管的搏动性可能表现为PU值轻微升高，并与心跳同步）。
4. 在未进行仪器连接的受试者手臂上佩戴自动血压袖带。
5. 将局部加热器设置为 33 °C，以将皮肤温度维持在热中性范围内²⁵，从而消除热刺激影响的任何变异。要在数据采集软件的连续记录中添加注释以标记实验中的事件，可点击屏幕右上角的文本框，输入注释内容，选择应接收该注释的通道，然后点击 添加.

4. 乙酰胆碱剂量-反应方案

1. 当红细胞流量在33 °C局部加热作用下趋于稳定后，开始采集基线数据，并在数据采集软件文件中以注释begin baseline加以标记。数据分析至少需要5-10分钟的稳定基线；若在此阶段数据采集过程中需要，可随时重新开始基线采集，并在LabChart文件中予以标注。在基线期的最后1分钟内，采集一次血压测量值，并将数值作为注释输入LabChart文件中。
2. 在完成5-10分钟的基线数据采集后，测量并记录基线血压值，并在数据采集软件中输入注释end baseline。
3. 关闭微灌注泵，将装有乳酸林格液的注射器更换为含有最低浓度乙酰胆碱（ACh）（10⁻¹⁰ M）的注射器。
4. 将新的注射器固定到位，并在重新开启微灌注泵前，确认液体已从探针末端正常灌注。在数据采集软件记录中输入注释begin −10。
5. 每种浓度的ACh将以2 µL/min的速度灌注5-10分钟。在每次灌注的最后1分钟内，均需测量并记录血压值。当某一浓度灌注结束后，按照步骤4.2-4.4所述方法，将注射器更换为下一较高浓度（例如，将10⁻¹⁰ M ACh溶液更换为10⁻⁹ M ACh溶液）。
6. 在完成最终浓度ACh（10⁻¹ M）的灌注后，立即将ACh注射器更换为含有林格液的注射器，并将局部加热器温度升至43 °C。待红细胞流量稳定后，再将林格液更换为硝普钠（28 mM），以诱导产生热刺激和药物刺激共同作用下的最大局部血管扩张。在此最大血管扩张阶段，每隔约3分钟测量并记录一次血压。
7. 当红细胞流量达到最大平台期（约5分钟稳定的PU值）后，结束实验。在数据采集软件右下角选择stop，以终止连续数据采集。

5. 局部加热方案

1. 在充血后红细胞流量稳定时，开始基线数据采集，并在数据采集软件文件中添加注释予以标明。在基线期的最后1分钟内，采集一次血压测量值，并将数值作为注释输入数据采集软件文件中。
2. 根据实验方案需求，将局部加热器温度升至39 °C或42 °C（详见讨论部分说明）。
3. 当红细胞流量在局部加热作用下达到平台期（加热约40–60分钟）后，通过微透析探针灌注N^G-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME；15 mM溶于林格氏液；2 µL/min；一种NO 合酶抑制剂）。
4. 当红细胞流量在L-NAME灌注后达到平台期（灌注约15–25分钟）时，将局部加热器温度升至43 °C。
5. 当红细胞流量在43 °C作用下再次达到平台期（加热约20–45分钟后出现持续约2–5分钟的平台）时，通过微透析探针灌注硝普钠（28 mM溶于林格氏液）。
6. 当红细胞流量达到最大平台期（约5分钟稳定的PU值）后，结束实验。在数据采集软件右下角选择停止，以终止数据采集。

6. 移除微透析探针

1. 实验结束后，使用一把手术剪刀剪断微透析探针。小心地将激光多普勒血流仪（LDF）探针从加热器上取下，并将加热器从皮肤上移除。轻柔地撕下固定探针于皮肤上的胶带。
2. 肉眼观察探针两侧穿刺部位中哪一个形成的血凝块最小。在血凝块较小的一侧附近剪断探针，保留约1英寸长的探针未剪断部分留在皮肤外。
3. 使用酒精棉片清洁探针进出部位周围的皮肤，以及血凝较少一侧所保留的大约1英寸长的探针部分。
4. 待酒精在皮肤上自然干燥后，捏住血凝块较大一侧穿刺点伸出的探针部分（与血凝较少端保留的约1英寸探针相对），缓慢地将探针向血凝块较大的方向拉出。
5. 探针取出后如有出血，立即覆盖无菌纱布并施加压力止血。

结果

乙酰胆碱剂量-反应实验方案

图1A展示了乙酰胆碱（ACh）剂量-反应实验方案的示意图。图1B显示了一名受试者在标准化ACh剂量-反应实验过程中红细胞流量值（灌注单位，PU；30秒平均值）随时间变化的代表性曲线图。图1C展示了一份ACh剂量-反应实验的原始数据文件。原始数据文件中保留了额外的基线测量值，但数据分析仅使用了约10分钟的基线数据。

在充血消退且红细胞流速稳定持续5分钟后，可开始进行10分钟的基线数据采集。基线表现为相对稳定的水平红细胞流速线，任何导致偏离的因素（如运动伪影、探头调整）均应作为数据采集软件中的注释记录下来，以供后续分析使用。基线期结束后进入剂量-反应实验流程，每次更换剂量时均需更换注射器，乙酰胆碱（ACh）浓度依次从10⁻¹⁰ M递增至10⁻¹ M。...

讨论

皮内微透析技术是人类血管研究中一种多用途的工具。研究者可对方案进行修改，以进一步拓展其应用范围。例如，本文描述了一种乙酰胆碱（ACh）剂量-反应方案，但其他关于血管收缩或血管运动张力机制的研究，而非仅限于血管舒张，已采用去甲肾上腺素或硝普钠的剂量-反应方法^{26,27,28,29,30,31}。其他血管舒张介质，如薄荷醇或甲氯化物（metachlorine chloride），也已在剂量-反应方案中被使用^31,32。相较于局部加热方案，剂量-反应方案作为一种评估血管功能的药理学手段，更具靶向性，能够更精确地分离特定的信号通路机制，因为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD Syringes	302100
乙酰胆碱	United States Pharmacopeia	1424511	本实验室的预实验数据表明，干燥乙酰胆碱会增加CVC反应的变异性；请勿干燥，应存放于干燥器中
酒精棉片	Mckesson	191089
Baby Bee 注射泵驱动装置	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1001	本研究中使用了可选的三注射器支架（目录号 MD-1002）
CMA 30 线性微透析探针	Harvard Apparatus	CMA8010460
Connex Spot 监护仪	WelchAllyn	74CT-B	自动血压监测仪
Hive 注射泵控制器	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1020	可控制最多4个Baby Bee注射泵驱动装置
LabChart 8	AD Instruments		**PowerLab硬件与LabChart软件必须为兼容版本
乳酸林格氏液	Avantor (VWR)	76313-478
激光多普勒血流仪	Moor Instruments	MoorVMS-LDF
激光多普勒探针校准套件	Moor Instruments	CAL
激光多普勒VP12探针	Moor Instruments	VP12
线性微透析探针	Bioanalytical Systems, Inc.	MD-2000
NG-硝基-L-精氨酸甲酯	Sigma Aldrich	483125-M	L-NAME
聚维酮碘 / 贝塔碘	Dynarex	1202
PowerLab C 数据采集设备	AD Instruments	PLC01	**
PowerLab C 仪器接口	AD Instruments	PLCI1	**
探针粘贴圆盘	Moor Instruments		用于将局部加热装置固定于皮肤
皮肤加热控制器	Moor Instruments	moorVMS-HEAT 1.3
小型加热探针	Moor Instruments	VHP2
无菌手术单	Halyard	89731
无菌纱布	Dukal Corporation	2085
无菌外科手套	Esteem Cardinal Health	8856N	目录号后接手套尺寸的首字母缩写，再加字母 "B"（例如，中号为8856NMB）
手术剪	Cole-Parmer	UX-06287-26