利用禽类皮肤外植体研究组织模式形成与器官发生

摘要

本文介绍了三种禽类胚胎皮肤外植体培养的实验方案，可用于研究组织间的相互作用、4D成像延时电影（三维加时间）、分子功能的全局或局部干扰，以及系统生物学表征。

摘要

在胚胎发育过程中，鸟类皮肤的发育是一个独特的模型，可为组织模式形成提供宝贵的见解。本文介绍了三种用于研究皮肤发育不同方面的皮肤外植体培养方法。首先，ex vivo 器官培养与操作为研究人员提供了直接观察和研究羽芽发育的机会。皮肤外植体培养可维持7天，便于在此期间定期对细胞行为进行直接分析和4D成像。该方法还允许对培养条件进行物理和分子层面的干预，以可视化组织的响应。例如，可在局部施加生长因子包被的微珠，以诱导特定区域羽毛模式的改变；或者在培养基中全局性地引入病毒转导，以实现基因表达的上调或下调。其次，皮肤重组技术使研究人员能够探究来自不同皮肤区域、不同发育阶段或不同物种的表皮与间充质之间的组织相互作用。该方法为研究上皮组织在何种时间窗口内具备响应信号的能力，以及其在不同间充质来源信号作用下形成不同类型皮肤附属器的能力提供了实验平台。第三，利用解离的真皮细胞与完整的上皮层共同构建的皮肤重建体系，可重置皮肤发育过程，从而研究周期性模式形成的初始阶段。该方法还增强了我们在构建重建皮肤外植体前对解离细胞进行基因表达操控的能力。本文提供了上述三种培养方案及典型实验示例，以展示其应用价值。

引言

禽类胚胎皮肤发育是研究形态发生机制的优良模型，因其具有明显的模式特征，并且便于进行显微手术和操作^1,2。然而，由于多余组织的存在可能干扰显微观察，在完整组织中评估细胞和分子事件往往较为困难。此外，调控基因表达以验证其在皮肤形态发生中功能的能力并不总能轻易实现。我们发现，利用皮肤外植体模型结合逆转录病毒转导技术，可更高效地检测基因功能。本文将讨论已建立的三种皮肤外植体模型的优势。

禽类胚胎皮肤培养 是一种强大的系统，可用于评估细胞行为、基因调控及其在皮肤羽毛芽发育过程中的功能^3,4,5,6。通过在培养基中全局添加生长因子，或从包被生长因子的微珠中实现其局部释放，该系统可用于评价羽毛芽发育的分子机制。此外，还可利用病毒介导的基因转导技术，导入完整型或显性负性形式的发育调控基因，以开展功能研究，评估其在特定形态发生事件中的作用^7,8。

禽类上皮-间充质重组培养使研究者能够确定皮肤各组分在皮肤形态发生早期阶段的各自作用。Rawles 应用该方法揭示了间充质与上皮之间的相互作用对于皮肤附属结构的形成至关重要⁹。间充质可形成聚集结构，而上皮则需要诱导并维持这些间充质聚集结构的形成²。此后，该方法被用于探究无鳞鸡为何无法形成羽毛，研究发现其缺陷位于间充质¹⁰。Dhouailly 利用不同物种的胚胎开展了组织上皮-间充质重组研究，这些研究为促进皮肤形态发生的上皮-间充质间通讯提供了发育学和进化角度的深刻见解³。

本研究旨在深入理解调控羽毛生长的各种因素。该方法还能更好地展示皮肤模式形成过程中所涉及的细胞和分子事件，这些事件发生在羽毛起始、发育以及沿前后轴伸长的阶段。当上皮组织与间充质分离后再将这两个组分重新组合时，新的相互作用会重新建立皮肤的模式形成。这种方法使我们能够评估间充质诱导信号以及上皮细胞的响应能力分子，后者使表皮能够对间充质信号作出反应¹¹。同时，也可检测羽毛芽发育和模式形成所必需的下游分子表达情况。这些研究已证实，羽毛芽的位置由间充质控制。在与间充质重新组合之前，将上皮组织旋转90^o，结果表明羽毛芽伸长的方向由上皮组织决定。该方法对我们研究调控羽毛芽取向的分子机制至关重要¹²。

禽类皮肤重建培养是一种将皮肤间充质解离为单个细胞后以高密度接种，并覆盖完整上皮组织的培养方法，该过程可使真皮细胞重置至原始状态。随后，外植体能够自我组织，形成一种独立于先前信号线索的新周期性模式¹³。这种皮肤重建模型可用于研究羽毛周期性图式形成的初始过程。我们利用该方法探究了间充质细胞与单块上皮组织的比例变化如何影响羽毛芽的大小或数量。结果发现，随着间充质细胞比例的增加，羽毛芽的数量增多，但芽的大小并未改变。该方法的另一优势在于，间充质细胞的病毒转导效率高于其他两种培养条件，且能产生更明显的表型。

方案

1. 鸡皮肤外植体培养 (图1)

1. 将受精的鸡胚置于38 °C的湿润培养箱中孵育，并根据Hamburger和Hamilton分期法进行分期¹⁴。
   1. 28期（约E5.5）时，肢芽的第二指和第三趾长于其他指/趾；可清晰分辨出三个手指和四个脚趾。
   2. 29期（约E6）时，翼在肘部弯曲；第二指明显长于其他指。
   3. 30期（约E6.5）时，在臂部水平可见脊髓两侧各有两列背侧羽毛芽，在腿部水平可见三列。
   4. 31期（约E7）时，在胸腰骶部水平约有7列羽毛。
   5. 32期时，在腿部水平可见十一列或更多的羽毛芽。
2. 将28至32期的鸡胚置于含有Hanks平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）的60 mm培养皿中。
   1. 解剖取出从下颈部至尾部区域的胚胎背部皮肤。用剪刀将头部从颈部剪下。轻柔牵拉肢芽，使胚胎腹面朝下，附肢向外展开。
   2. 使用钟表匠镊子或尖头弹簧剪刀，沿胚胎身体两侧从头端至尾端做纵向切口。操作时需用镊子夹住肢芽纵向固定身体以保持稳定。使用钟表匠镊子从颈部向尾部或从尾部向颈部轻柔剥离皮肤。
3. 轻柔去除仍附着在剥离皮肤上的皮下组织，并用尖头弹簧剪刀修整皮肤边缘使其平滑。
4. 在6孔板的每个孔中加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素溶液（按1:100稀释）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。加入培养基和抗生素后，将无菌的组织培养小室放入孔中，使培养基位于培养小室外侧。
5. 用刮匙将皮肤转移至培养小室上，使表皮面朝上，间充质面朝下贴附于小室膜上。为确保皮肤平展无皱褶，可在HBSS中将皮肤拉至刮匙上，并借助液体将皮肤滑出刮匙，以避免折叠，便于转移。
6. 用200 µL移液器吸除培养小室中多余的HBSS。在培养小室内保留一层薄薄的HBSS，使外植体保持半湿润状态，形成气-液界面。
7. 将皮肤外植体培养物置于37 °C、5% CO₂和95%空气条件下培养，每2天更换一次培养基。
   ​注意：该实验方法已有发表⁴。此培养系统也可用于其他鸟类（如鹌鹑或雀类）的皮肤外植体培养。

2. 鸡皮肤上皮-间充质重组（图2）

1. 将受精的鸡卵置于38 °C的湿润化孵育箱中孵育，并根据Hamburger和Hamilton分期法对胚胎进行分期¹⁴ （第1.1节）
2. 配制含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的2倍浓度钙镁离子自由（CMF）盐溶液缓冲液。
   1. 配制10倍浓度CMF缓冲液（NaCl（1.37 M）80 g，KCl（0.04 M）3 g，NaH₂PO4 (0.004 M) 0.5 g，KH₂PO4 (2 M) 0.25 g，NaHCO₃₃ (0.12 M) 10 g 葡萄糖 (0.1 M) 20 g 溶于 1,000 mL 蒸馏水中，调节 pH 至 7.3。配制含 0.25% EDTA 的 100 mL 2x CMF 缓冲液时，应先将 EDTA 溶于 80 mL 蒸馏水中，然后加入 20 mL 10x CMF 缓冲液，得到含 0.25% EDTA 的 2x CMF 工作液。
3. 解剖30-32期鸡胚背部皮肤，方法如上文（第1.2节）所述，在HBSS中进行，并将其置于含0.25% EDTA的2x CMF盐溶液中，冰上孵育15-20分钟。
4. 使用钟表匠镊子仔细分离上皮和间充质。将分离的上皮和间充质转移至含有HBSS的洁净培养皿中。
5. 将间充质置于含有HBSS的培养皿中，然后将上皮组织放置在间充质上方，使上皮组织与间充质沿相同的前后轴对齐，或将上皮组织旋转90°^o 从间充质的前后轴确定哪个组分调控皮肤形态发生的不同方面。
6. 将重组皮肤转移至6孔培养板中的培养插件中进行培养，并去除重组皮肤周围的过量HBSS。
7. 在插入物外的孔中加入2 mL含10% FBS的DMEM培养基。在插入物腔内加入一层薄薄的DMEM，以保持组织块处于半湿润状态，形成气-液界面。
8. 在37 °C、5% CO₂混合气体环境中孵育皮肤重组体₂ 以及95%的空气。每2天更换一次培养基。使用安装在体视显微镜上的相机，通过延时摄影记录皮肤发育初始阶段的表型变化。
   注意：本实验步骤已有发表¹¹.

3. 鸡皮重建 (图3)

1. 将受精的鸡卵置于38 °C的加湿孵育器中孵育，并根据Hamburger和Hamilton分期法对胚胎进行分期。¹⁴ （第1.1节）
2. 解剖30-33期鸡胚的背部皮肤，置于HBSS中。如上文（第2.3节）所述，将皮肤在含0.25% EDTA的2x CMF盐溶液中冰上孵育15-20分钟。
3. 使用钟表匠镊子小心分离上皮和间充质。将分离的上皮和间充质转移至冰上的HBSS中。
   注意：在分离上皮与间充质时，需小心避免损伤上皮的基底层。
4. 将分离的间充质收集至15 mL离心管中，加入用PBS配制的0.1%胶原酶/胰蛋白酶溶液，在37 °C水浴中孵育10–15分钟。
5. 用巴斯德吸管将皮肤间充质组织解离，制备单细胞悬液。加入含10%胎牛血清的DMEM以终止消化。
6. 离心细胞，233 × g g 5分钟。用培养基重悬细胞，浓度为2 × 10⁷ 细胞/毫升
   注意：在此步骤中，间充质细胞也可用含有病毒的培养基在冰上重悬 2-3 小时，以进行基因转导。
7. 将一个细胞培养小室放入6孔板的一个孔中。加入10 µL浓度为2 × 10⁷ 每毫升间充质细胞接种于组织培养插件中。在插件外的孔中加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。将接种的间充质细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育₂ 在95%空气培养箱中孵育1小时，使细胞沉降到插入膜上。
8. 使用1 mL移液器将完整的上皮组织转移至培养皿中的间充质液滴上方，使上皮组织的基底细胞层朝向间充质细胞。
   注意：将上皮组织转移至间充质液滴时，不应扰动间充质细胞。
9. 将完整的上皮层平整覆盖于间充质之上，以制备重建皮肤外植体。在插入物表面保留一层薄薄的培养基，使重建皮肤外植体保持半湿润状态，以形成气-液界面。将重建皮肤外植体于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 并置于95%空气的培养箱中培养，每2天更换一次培养基。
   注意：本实验步骤已有发表¹³.

结果

皮肤外植体培养
羽毛芽的发育过程 离体 皮肤器官培养物可直接在显微镜下观察。利用鸡胚胎第30期背部皮肤的皮肤外植体培养模型，可见羽板沿中线排列。随后，形态发生前沿逐渐向皮肤外周侧向扩展，形成新的羽毛原基。这些羽毛原基在培养2天后发育为短羽毛芽，培养4天后发育为长羽毛芽。图1).

皮肤重组培养
进行皮肤重组时，当上皮与间充质重新组合后，原有的羽板会消失。重组后不久将出现新的羽板，并在培养2天和4天后分别发育形成短羽芽和长羽芽。如果上皮相对于间充质旋转90°，则伸长的芽体方向将由上皮决定（图2）。

皮肤重建培养
在皮肤重建过程中，ex vivo 器官培养最初呈现均一状态，培养1天后则同时形成间距均匀的真皮凝聚结构。需要注意的是，羽毛芽的数量取决于间充质细...

讨论

组织重组提供了一种实验方法，用于探究上皮和间充质各自的独特作用。在鸡中，羽毛从胚胎第7天（E7）开始发育，而鳞片则从E9开始发育。当将E9鳞片间充质与E7羽毛上皮重组时，重组组织会形成鳞片；而将E7羽毛间充质与E9鳞片上皮重组时，则会形成羽毛¹¹。这些研究表明，间充质控制着模式形成的间距以及器官的身份。当然，上皮必须具备一定的感受性，才能适当地接收并解读间充质信号。这种感受性仅在上皮中短暂存在。与上述结果相反，令人意外的是，当将鸡的口内黏膜和反口侧E5上皮分别与E8体干部间充质重组时，反口侧上皮会形成羽毛，而口内黏膜则形成多个类似牙齿的附属结构¹⁵。这表明，尽管体干部皮肤间充质能够引导反口侧上皮形成羽毛，但口腔上皮不具备形成羽毛的能力，只能形成牙齿。本研究中的口腔上皮可能在E5时已决定向牙齿方向分化。原位杂交、RNAscope以及免疫染色可用于确认重组外植体中的分子表达，以验证所形成组织的身份。利用该实验方法，可特异性地对上皮或间充质进行干预。

组织重建可使间充质中的细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔培养皿	Falcon	REF 353502	气液界面（ALI）培养
细胞培养插件	Falcon	REF 353090.	0.4 µ透明PET膜
I型胶原酶	沃辛顿生物化学	LS004196
杜尔贝科’改良型伊格尔’s 培养基	康宁	10-013-CV	4.5 g/L 葡萄糖
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma-Aldrich	E5134
胎牛血清	ThermoFisher	16140-071
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
汉克斯’s 缓冲盐溶液	Gibco	14170-112	无钙，无镁
青霉素/链霉素	Gibco	15-140-122
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9333
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)	Sigma-Aldrich	S6014
氯化钠（NaCl）	EMD	CAS 7647-14-5
磷酸二氢钠（NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
胰蛋白酶	Gibco	27250-042