清醒小鼠的高血糖钳夹与低血糖钳夹技术

摘要

高血糖钳夹法用于在维持较高血糖浓度的条件下测定胰岛素的释放。低血糖钳夹法用于测定由反向调节反应诱导的葡萄糖生成。这两种方法采用相同的手术操作。本文中，我们介绍一种用于评估全身葡萄糖代谢的钳夹技术。

摘要

糖尿病（DM）是由于胰腺β细胞胰岛素分泌不足（1型DM）以及肌肉、肝脏和脂肪组织对胰岛素敏感性降低（2型DM）所致。胰岛素注射可用于治疗DM患者，但会导致低血糖这一副作用。为应对低血糖，机体释放皮质醇和儿茶酚胺，激活肝脏的葡萄糖生成，这一过程称为反调节反应（CRR）。在利用啮齿类动物模型进行的DM研究中，通常采用葡萄糖耐量试验和2-脱氧葡萄糖注射分别测量胰岛素分泌和CRR。然而，实验过程中血糖浓度持续变化，使得评估胰岛素净分泌量和CRR存在困难。本文介绍一种方法，可在清醒小鼠中将血糖分别维持在250 mg/dL或50 mg/dL，以分别比较胰岛素和CRR激素的释放情况。

将聚乙烯导管植入小鼠的颈动脉和颈静脉中，并让小鼠从手术中恢复。颈静脉导管连接至带有注射泵的汉密尔顿注射器，以实现胰岛素或葡萄糖以恒定或可变速率输注。颈动脉导管用于采集血液。在高血糖钳夹实验中，将30%葡萄糖溶液注入静脉，每5分钟或10分钟从动脉血中测定一次血糖水平。逐步增加30%葡萄糖的输注速率，直至血糖水平达到250 mg/dL。随后采集血液以测定胰岛素浓度。在低血糖钳夹实验中，以10 mU/kg/min的速率输注胰岛素，同时输注30%葡萄糖，其输注速率可调，以维持血糖水平在50 mg/dL。当葡萄糖输注速率和血糖水平均达到稳态时，采集血液以测定反调节激素水平。高血糖钳夹和低血糖钳夹实验采用相同的手术操作和实验装置。因此，该方法对系统性葡萄糖代谢研究的科研人员具有重要应用价值。

引言

葡萄糖是细胞的重要能量来源，缺乏葡萄糖可能导致多种症状和并发症。当血糖水平过低（即低血糖，通常空腹血糖水平低于 70 mg/dL，但不应仅凭单一数值判断¹）时，最常见的症状包括虚弱、意识混乱、出汗和头痛。低血糖还可能干扰大脑功能，并增加心血管事件和死亡风险²。相反，高血糖是一种医学状况，指血浆葡萄糖浓度超过正常水平（通常空腹血糖水平> 126 mg/dL³），常见于胰岛素分泌或利用存在缺陷的糖尿病患者。高血糖可导致糖尿病酮症酸中毒，即机体无法利用葡萄糖供能，转而分解脂肪酸作为能量来源。高血糖高渗状态也会增加死亡率⁴。长期高血糖可损害血管、神经和器官，导致多种慢性并发症的发生，如心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病。因此，血糖浓度必须维持在 100 mg/dL 至 120 mg/dL 的狭窄范围内。

血糖由单室模型中葡萄糖输入与输出之间的平衡来调节（图1A）。葡萄糖输入包括从食物中吸收的葡萄糖以及肝脏、肾脏和小肠产生的葡萄糖。葡萄糖输出则包括组织对葡萄糖的摄取以及肾脏对葡萄糖的排泄。葡萄糖输入和输出的量均受内分泌激素的调控。例如，当血糖水平降低时，胰高血糖素、皮质酮和儿茶酚胺等被称为反调节激素的激素会被释放

方案

所有实验程序均经熊本大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

注意：为缓解疼痛，将布洛芬以0.11 mg/mL浓度加入饮水中给予，持续48小时；并在手术前30分钟腹腔注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）。无菌操作条件包括佩戴手套、口罩，以及在动物间使用经环氧乙烷灭菌的器械并辅以高压灭菌器灭菌。手术在设定为37 °C的加热垫上进行，每只动物使用新的实验垫覆盖。术前用聚维酮碘 溶液和酒精清洁手术区域。所有手术器械均经高压灭菌（每套器械用于不超过两次手术）。在切口前，需检查小鼠以确认其已完全麻醉。每只小鼠的麻醉深度在手术前及手术过程中通过夹趾反射进行评估。 每次适应性停留时间不超过5分钟。请遵循所在机构IACUC的相关指导规定。

1. 颈静脉和颈动脉导管的制备

1. 对所有管路、聚丙烯制品（如移液器吸头）和缝合线使用高压灭菌器或环氧乙烷进行灭菌。对于颈静脉，连接8 cm的管路1（见 材料）以及使用胶水将3 cm长的管子2连接图2A将2 mm长的导管1置于顶部，因为导管2（聚乙烯）过硬，可能损伤血管（导管1.1）。
2. 用于颈静脉输注葡萄糖和胰岛素的延长管（Tubing1.2）
   1. 准备两根30 cm管子和一根10....

结果

低血糖钳夹实验在雄性C57BL/6N小鼠（8周龄，体重超过25 g）中进行，实验开始前小鼠禁食3小时（图4A，B）。初始血糖水平为136 mg/dL（t = -15 min）。如果初始血糖低于90 mg/dL，可能是由于手术操作不理想、动脉导管插入过深，或有血栓进入血液循环所致。术后小鼠的状态会影响其能量代谢。在健康状况不佳的情况下，无法准确测量生理性的葡萄糖代谢。C57BL小鼠术后较易发生血栓；而体重较大的小鼠（如FVB或ICR小鼠）在术后因冲洗血栓导致体重下降的风险较低。因此，初学者练习钳夹操作时，建议优先选用FVB小鼠。C57BL小鼠需要更精细的术后护理。将9 mm导管插入动脉后，即使在FVB和ICR小鼠中也未出现采血困难的情况。胰岛素输注从t = 0 min开始，血糖水平随之下降（图4A）。在t = 0 min至t = 70 min期间，葡萄糖输注速率（GIR）尚未稳定；此后自80 min起逐渐达到稳态。

在雄性C57BL.......

讨论

本文所述方法简便，可使用移液器吸头、注射器以及普通实验室中常见的其他物品完成。尽管研究人员可能需要额外购买一些管路和泵，但无需昂贵的设备。因此，与以往报道相比^12,13,14，该导管插入与夹闭方案更易于开展。

夹闭技术于20世纪70年代左右开发，已在小鼠和人类中得到应用¹⁵。该方法可用于精确测量葡萄糖代谢，被认为是金标准。然而，该技术并未被多数研究人员广泛采用。高胰岛素-正常血糖夹闭技术已在小鼠¹³和大鼠¹⁴中报道，但此处的导管插入方法有所不同，读者可根据实验需求选择更简便的方法。本文的目的之一是降低开展此类实验的门槛。因此，我们提供了自制导管材料、手术操作步骤以及实验时间进程示例的详细信息，这些内容对于首次尝试进行夹闭实验的研究人员具有重要参考价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粘合胶水	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA试剂盒（C肽）	莫林加生物科学研究所股份有限公司	M1304	小鼠C肽ELISA试剂盒
ELISA试剂盒（胰岛素）	富士胶片和光纯药株式会社	633-03411	LBIS 小鼠胰岛素 ELISA 试剂盒（U型）
便捷式血糖仪	尼普洛株式会社	11-777	Free Style Freedom Lite
胰岛素（100U/ml）	Eli Lilly & 公司	428021014	Humulin R（100U/ml）
小鼠	Japan SLC 公司	C57BL/6NCrSlc	C57BL
缝合	南津製作所	C-23S-560 第2号	灭菌的
注射泵	Pump Systems Inc.	NE-1000
合成缝合线	VÖMEL	HR-17
导管1	AS ONE 公司	9-869-01	LABORAN(R) 硅胶管
导管2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE 导管
导管3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	5号大小	聚乙烯管，规格5