慢性非特异性下腰痛大鼠模型的手法治疗

摘要

本研究提出了一种针对慢性腰背痛模型大鼠的推拿治疗标准化操作流程，可为今后推拿治疗的实验研究提供参考价值。

摘要

慢性下背痛（CLBP）是全球范围内高度流行的疾病，也是导致残疾的主要原因。大多数CLBP患者由于病因不明，被诊断为慢性非特异性下背痛（CNLBP）。手法治疗（MT）是传统中医的重要组成部分，在中国被称为推拿。其技术包括正骨和肌肉放松手法等。尽管手法治疗在治疗CNLBP方面具有临床疗效，但其作用机制尚不明确。在旨在研究这些机制的动物实验中，主要挑战之一是如何在CNLBP模型大鼠上实现规范化的手法治疗。提高手指力度的稳定性是手法治疗中的关键问题。为解决这一技术局限，本研究提出了一种针对CNLBP模型大鼠的手法治疗标准化操作流程。该流程显著提升了手法操作的稳定性，并缓解了手法治疗过程中固定大鼠时常见的问题。本研究的结果对未来开展手法治疗相关实验研究具有参考价值。

引言

慢性下背痛（CLBP）的特点是持续性下背痛，持续时间超过3个月，通常位于肋骨下缘与髋部横线之间，可伴有或不伴有下肢疼痛^1,2。该病患病率极高，全球年患病率估计为38%，终生患病率为39%，是常见的公共卫生问题^3,4。大多数CLBP患者（超过90-95%）无法获得明确的病理学和解剖学诊断（如肿瘤、骨折或感染），因此被归类为慢性非特异性下背痛（CNLBP）^5,6。由于其病理机制的非特异性，西医主要采用阿片类镇痛药和非甾体抗炎药（NSAIDs）进行治疗，但存在安全性方面的担忧^7,8。因此，对安全且有效的补充和替代疗法的需求日益增加。

手法治疗（MT）在中国通常被称为推拿，是中医（TCM）的重要组成部分，包括正骨和肌肉放松操作等技术。其在中国的广泛应用归因于临床疗效显著、安全性高且具有非侵入性⁹。在慢性非特异性腰痛（CNLBP）的治疗中，推拿已被证实是一种有效的补充和替代医学，既往研究已证明其疗效^10,11,12。中医认为，气滞血瘀是慢性疼痛的核心病因，推拿通过促进气血运行，改善肌肉及软组织的气血供应来缓解疼痛。然而，尽管其疗效明确，其治疗作用的具体机制仍不明确。

在针对推拿疗法（MT）的实验研究领域，动物模型干预措施的实施方式存在差异。目前，大多数研究者选择基于仪器的推拿疗法，而少数研究者则采用手法推拿^13,14,15,16。尽管基于仪器的推拿疗法更具标准化，但手法推拿在临床上更具相关性，并能产生更具代表性的数据。然而，由于手指力度不稳定，实验动物的手法推拿受到限制，这成为动物实验中的关键挑战，并影响了实验结果的可比性。为克服这一技术难题，本研究提出了一种可行的解决方案，可增强慢性非特异性腰痛（CNLBP）模型大鼠推拿过程中手指力度的稳定性。该方案的可行性已得到验证，为今后推拿疗法的实验研究提供了有价值的指导。

方案

本实验方案经浙江中医药大学动物护理与使用委员会批准，所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。研究采用成年雄性SD大鼠（见材料表），体重范围为330 g至350 g。所有大鼠均饲养于标准动物设施中，光照-黑暗周期为12小时，温度为24 ± 2 °C，湿度为50 ± 5%。大鼠可自由获取食物和饮水。以下方案详细描述了慢性非特异性下背痛（CNLBP）模型的建立及手法治疗操作步骤。

1. 按照以下步骤建立腰痛模型（图1）

1. 喂养大鼠至体重达330–350 g，称重后经腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）进行麻醉（参见材料表）。等待2分钟后，用镊子轻轻夹捏后肢的四个脚趾，并用镊子触碰大鼠角膜，检查是否无回缩或眨眼反应，以确认麻醉成功。
   注意：所有用于大鼠造模的手术器械应提前进行高压灭菌，对剃毛器、外固定系统（ELFS）设备和恒温台等不可高压灭菌的器械则需用酒精消毒。操作者应穿戴洁净实验服、一次性无菌手套、口罩、手术帽和面罩。
2. 向大鼠眼部涂抹适量兽用眼膏，以防止麻醉后长时间无法闭眼导致角膜干燥。
3. 将大鼠置于恒温台上呈胸卧位，定位其L4–6节段，剃除该节段毛发，并用碘伏消毒3次，随后铺放一次性手术洞巾。
4. 使用手术剪切开L4–6节段的皮肤和筋膜，再用手术刀分离该节段腰椎棘突两侧的肌肉。
   注意：确保肌肉完全与棘突分离，棘突上无残留肌纤维；此外，分离深度应达到腰椎横突水平。
5. 用5 mL注射器针头在L4–6棘突中部钻孔，然后将外固定系统（ELFS）（参见材料表）安装至L4–6棘突上。
6. 碘伏消毒后，在伤口两侧肌肉注射青霉素10万单位（参见材料表），然后缝合伤口。
   注意：缝合前应将ELFS装置向前推动以降低其高度，随后在皮下缝合，以预防感染。
7. 在大鼠苏醒前拍摄X光片，以确认ELFS装置是否成功固定于L4–6棘突（图2）。
   注意：拍摄X光片后，将大鼠置于恒温台上呈胸卧位（参见材料表），待其完全苏醒后再放回笼中，期间不得无人看护。
8. 根据既往报道¹⁷，将每只造模大鼠单独饲养2周；若2周结束时ELFS装置未脱落，则视为慢性非特异性下背痛（CNLBP）造模成功。
   注意：术后恢复期间，少数大鼠可能因感染而在腰部出现脓肿；此时可用2.5 mL注射器抽吸脓液，随后用生理盐水冲洗伤口，最后用棉球按压伤口数秒钟。
9. 为防止大鼠相互损坏ELFS装置，2周恢复期后仍需将每只造模大鼠单独饲养。
   ​注意：为避免单笼饲养引起大鼠心理抑郁，可在笼内放置一个塑料球形玩具（参见材料表）。

2. 中国台湾非特异性下背痛模型大鼠的手法治疗操作步骤（图3）

1. 在进行推拿治疗（MT）前，先在电子秤（见材料表）上进行为期2周的手指力量稳定性训练。训练期间，保持约600 g的可控指压力度，频率为每秒2次，每日进行1次，每次持续10分钟。
2. 在进行推拿治疗（MT）前，将模型大鼠适应鼠袋环境1周。将大鼠上半身放入鼠袋中，使其腰部及下肢暴露在外。同时，轻柔抚摸大鼠腰部区域，以帮助其接受手指与腰部区域的接触。
   注：将一块布料裁剪成扇形，顶角为90°，半径为12 cm，然后将扇形布料的两侧缝合，制成鼠袋（见补充图S1）。
3. 将大鼠放入鼠袋中，此时其上半身被鼠袋覆盖，仅腰部和下肢暴露。用非优势手以"C"形固定大鼠上半身，同时用优势手对大鼠腰部区域进行推拿治疗（MT）。
   注：使用非优势手固定大鼠时，切勿握得过紧，否则会压迫胸腔，影响呼吸，并导致大鼠产生强烈抗拒反应。
4. 准确定位夹脊（EX-B2）穴位。首先确定大鼠L4-6棘突的位置。夹脊穴位于L4-6棘突两侧，距椎体棘突0.5 cm处，共6个穴位。
   注：在大鼠中，L6棘突位于两侧髂前上棘连线水平，L4和L5的位置可通过从L6棘突向上计数确定。
5. 将拇指置于大鼠L4-6节段的夹脊穴上，逐渐增加揉捏力度。当模型大鼠在安静状态下出现肢体扭动、大声尖叫或剧烈挣扎等抗拒行为时，此时的揉捏力度即为最大耐受压力值。应确保最适宜的压力略低于该最大压力值，即大鼠在无抗拒行为下所能耐受的最大压力。
6. 从L6左侧的夹脊穴开始。确定大鼠夹脊穴的最适宜压力后，以该压力水平持续按压拇指，同时以每秒2次的频率进行揉捏操作，持续1分钟。随后依次对剩余5个夹脊穴重复相同操作。
7. 若在揉捏过程中观察到大鼠出现抗拒行为，应立即停止拇指按压，待大鼠恢复平静后再继续操作。确保每个穴位的揉捏过程总时长达到1分钟，即使过程中出现中断也需补足时间。

3. 爪退缩阈值（PWT）

1. 将大鼠置于带有金属丝网的透明有机玻璃箱中，适应环境30分钟，然后开始正式实验。
2. 待大鼠停止探索和理毛行为后，使用不同规格的von Frey纤维丝（0.6、1、2、4、6、8、15、26 g）（参见材料表），垂直刺激其左后足掌中部，缓慢施加压力直至纤维丝轻微弯曲，随后停止加压并维持该压力值5秒。
   注意：使用纤维丝刺激后足时，应避开后足掌中部皮肤较厚的区域。
3. 若大鼠出现腿部回缩或舔足反应，则记录为X，并给予较低强度的刺激纤维丝；若未出现阳性反应，则记录为O，并给予较高强度的刺激纤维丝。
   注意：两次相邻刺激之间的间隔应大于30秒。
4. 当连续出现4次X，随后出现连续的X O序列时，停止检测，并根据Chaplan¹⁸的方法将该序列转换为相应的PWT值。

4. 爪回缩潜伏期（PWL）

1. 将大鼠放入 Hargreaves 装置（参见材料表）中，适应环境 30 分钟后再进行正式测试。
2. 设置仪器参数如下：最大光照时间 20 s；光照强度 50%（参见补充图 S2）。
   注意：最大光照时间不应超过 20 秒，以避免灼伤大鼠足底，影响后续测试结果的准确性。
3. 待大鼠停止探索和理毛行为后，将热刺激器上的+符号对准大鼠左后足底中心。点击开始，当大鼠出现抬足反应且仪器自动停止计时时，记录所得的时间值。每只大鼠共进行五次测试。
   注意：同一动物每次测试之间的间隔至少为 5 分钟，以避免灼伤后足皮肤。
4. 对每只大鼠测得的五个数值，去除最大值和最小值后，取剩余三个数值的平均值作为该大鼠的 PWL 值。

5. 苏木精和伊红（H&E）染色

1. 在甲硫氨酸处理2周结束时，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并在大鼠完全麻醉后通过心脏灌注法处死所有大鼠。
2. 去除大鼠L5左侧腰大肌，并浸入4%多聚甲醛中（参见 材料表48 小时固定。
3. 将组织修剪至适当大小，并放入包埋盒中（参见 材料表），然后使用自动脱水机（参见 材料表）用于脱水。
4. 使用石蜡包埋组织，然后将组织切成5 µm厚的切片。
5. 将切片置于载玻片上，于烘箱中烘烤4小时。
6. 将组织置于自动染色机中（参见 材料表）用于后续脱蜡、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水和透明¹⁹.
7. 用中性树脂封片（参见 材料表）并在通风处放置24小时。
8. 使用数字切片扫描仪扫描切片（参见 材料表).

结果

本研究旨在探讨MT对慢性非特异性下背痛（CNLBP）模型大鼠的镇痛作用。为此，将24只大鼠随机分为四组，分别为空白组、假手术组、模型组和MT组，每组6只大鼠。空白组不接受任何干预；假手术组仅接受手术操作，即分离并缝合L4-6棘突两侧的腰背部肌肉，术后不进行其他干预。模型组按照既定方法建立CNLBP模型，建模成功后不给予任何干预。MT组在成功建模后，接受为期2周的MT治疗。所有大鼠均单独饲养于笼中，并配有塑料球玩具。在建模后第15、17、21、24和28天，对各组大鼠进行足缩回阈值（PWT）和足缩回潜伏期（PWL）的检测（图4）。数据以均值±标准差表示，并进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较在方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett T3检验。以p < 0.05为差异具有统计学意义。图5展示了各组大鼠PWT和PWL的变化情况。各组大鼠的PWT和PWL基线值相近。在建模结束后第15至28天期间，空白组与假手术组大鼠的PWT和PWL未见显著波动。然而，模型组...

讨论

目前，尚无一种能够准确模拟慢性非特异性下背痛（CNLBP）的动物模型达成共识。已有的多种CNLBP动物模型包括椎间盘源性、神经源性、骨关节源性和肌肉源性模型²³。然而，由于临床上CNLBP具有高度异质性，这些模型均存在局限性。本研究中所采用的CNLBP模型是在Henderson的"external link"模型²⁴基础上改进而来的，该模型属于骨关节源性CNLBP模型。既往研究中，X线显示腰椎长期固定会导致固定节段椎体关节出现骨赘形成，即椎体与关节的轻微错位²⁵。根据中医理论，维持腰部软组织结构（筋）与骨性结构（骨）之间的生物力学平衡，对腰部健康至关重要。椎体与关节的轻微错位可导致腰部“骨”生物力学失衡，若未及时纠正，可能进一步引发“筋-骨”生物力学失衡，最终发展为CNLBP。传统骨关节源性CNLBP模型通常通过注射诱发骨关节炎相关炎症的化学物质来建立^26,27。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动脱水机	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
自动染色机	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
恒温台	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	加热式小型动物手术台，通常在 37 °C–38 °C 下运行
数字切片扫描仪	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
外部固定系统	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	定制
包埋盒	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves 仪器	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
中性树脂	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
多聚甲醛	Macklin Co.,Ltd	P804536
青霉素	杭州正博生物科技有限公司	ZSQ-100-160A
塑料球状玩具	上海华科工业有限公司	HK11029-35503
SD 大鼠	上海斯莱克实验动物有限责任公司	SCXK (沪) 2022-0004	雄性，330–350 g
戊巴比妥钠	杭州大成生物技术有限公司	P3761
Von Frey 纤维丝	Stoelting Co., Ltd.	NC12775
电子天平台	上海立晨邦西仪器科技有限公司	YP20002B