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方法文章

应用针刀治疗兔膝骨关节炎模型

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DOI：

10.3791/65584

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2023年10月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Acupuncture and Moxibustion Department, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated with Capital Medical University, 3The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

在本实验方案中，采用改良的Videman方法制备膝骨关节炎模型，并详细描述了针刀操作的步骤及注意事项。通过检测股四头肌及其肌腱的力学特性，以及软骨的力学和形态学特性，验证了针刀治疗的有效性。

摘要

膝骨关节炎（KOA）是骨科门诊中最常见的疾病之一，严重影响患者的生存质量。在多种致病因素中，膝关节生物力学失衡是导致KOA的主要原因。针刀医学认为，恢复膝关节的力学平衡是治疗KOA的关键。临床研究表明，针刀治疗可通过松解膝关节周围软组织的粘连、挛缩以及肌肉和肌腱的应力集中点，有效缓解疼痛并改善膝关节活动度。

在本实验方案中，我们采用改良的Videman方法，通过将左侧后肢固定于伸直位来建立膝骨关节炎（KOA）模型。我们详细阐述了针刀操作的方法及相关注意事项，并结合“调筋以治骨”理论，通过检测股四头肌及肌腱的力学特性以及软骨的力学性能与形态学变化，评估针刀疗法的疗效。结果表明，针刀可通过调节膝关节周围软组织的力学特性，改善软骨的应力环境，延缓软骨退变，从而对软骨起到保护作用。

引言

膝骨关节炎（KOA）是最常见的骨关节炎类型，通常被认为是一种累及整个关节的疾病，其特征是关节软骨退变，临床表现为受累关节疼痛、肿胀和活动受限1。根据最新的流行病学统计数据，截至2020年，全球40岁及以上人群中约有6.541亿人患有KOA。KOA的患病率和发病率随年龄增长而上升，在中老年人群中最高，且女性发病率高于男性2。由于全球人口老龄化和肥胖流行趋势加剧，KOA的患病率可能进一步上升，对全球公共卫生构成日益严重的威胁。年龄、性别、肥胖、创伤以及其他与KOA相关的复杂危险因素均会直接影响膝关节不稳，导致膝关节生物力学失衡，成为KOA的主要病因之一3。

在正常的生理条件下，膝关节处于力学平衡状态，确保关节内的机械负荷均匀分布在软骨上。膝关节的任何力学失衡都可能导致软骨内出现异常应力，从而引起软骨退变及膝骨关节炎（KOA）的发生4。肌肉-肌腱系统是维持膝关节力学平衡的主要动力系统。伸肌与屈肌肌腱系统的协调运动可将运动产生的负荷均匀分布于软骨表面，避免局部软骨应力超出其生理负荷而导致代谢失衡和软骨丢失5。肌肉力量下降是导致关节内运动紊乱和软骨损伤的主要原因，这种情况可能在症状性KOA出现之前就已经发生。

膝骨关节炎（KOA）还可诱发关节源性肌肉抑制（AMI），表现为膝关节周围肌肉无力和肌力下降6。在这些肌肉中，股四头肌是唯一的膝关节伸肌，对维持膝关节稳定性具有重要作用。研究表明，股四头肌横截面积减小及肌力下降与KOA的进展呈显著正相关7。股四头肌肌力下降会影响步态模式、膝关节稳定性、运动模式及其他多种功能。此外，肌力下降还会损害肌腱功能，表现为肌腱刚度、弹性模量等生物力学特性的降低8。在长期的应力修复过程中，膝关节周围的肌肉和肌腱可能发生粘连、挛缩等改变，破坏其力学性能，导致关节不稳定，最终形成KOA病理变化的恶性循环。因此，改善肌腱-肌肉系统的力学性能，恢复关节力学平衡，对于KOA的治疗至关重要。

在膝骨关节炎（KOA）的致病因素中，生物力学失衡是导致膝关节疼痛、功能障碍、炎性病变及软骨退变的主要诱发因素9。因此，治疗KOA的关键在于恢复膝关节的生物力学平衡。针刀医学认为，KOA的病因病机在于“力学失衡”：当膝关节周围软组织的力学特性发生异常改变时，膝关节失去力学平衡，关节内异常的力学应力环境加速了退变过程，引发炎性刺激，进一步加重软组织粘连、挛缩，导致关节稳定性进一步下降。这一恶性循环最终发展为KOA。通过松解软组织粘连与挛缩，降低肌肉和肌腱的应力集中，针刀结合“调筋治骨”理论，改善软组织力学状态，实现“调筋”目的，从而平衡关节的力学应力，有效缓解软骨退变，达到“治骨”的效果10。在动物模型的选择方面，根据本研究目的，我们采用改良Videman法对左侧后肢进行伸直位固定，制备KOA模型。

本文详细介绍了采用改良Videman法对左后肢进行伸展固定建立膝骨关节炎（KOA）模型的方法，以及针刀操作的技术步骤与注意事项。我们通过检测股四头肌及肌腱的力学性能，以及关节软骨应力和形态学的变化，验证了针刀治疗的有效性。

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方案

所有动物实验均经北京中医药大学动物伦理委员会审查并批准（编号：BUCM-4-2022010101-1097）。在本实验方案中，24只6周龄雄性新西兰兔在特定条件下饲养，即温度20–25 °C、湿度50–60%、12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环环境，并可自由摄取常规饲料。兔子通过深度麻醉联合空气栓塞法进行麻醉和处死。疼痛是膝骨关节炎（KOA）典型的病理特征之一，也是评价KOA动物模型及干预方法的关键指标之一，因此在造模过程中不使用镇痛药物。

1. 骨关节炎兔模型

  1. 通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）对兔子进行麻醉。为确认麻醉程度是否合适，需观察角膜反射是否显著减弱或消失，并用止血钳夹住皮肤以确认无疼痛反应。麻醉期间，每隔15分钟向兔子眼睛滴加2-3滴润滑剂，防止眼睛干燥。
  2. 麻醉完成后，将每只兔子固定于仰卧位，并将左后肢拉直至完全伸展状态。
  3. 将每只兔子的左后肢固定在伸展位置。
    1. 第一层：使用医用胶带从腹股沟至踝关节覆盖兔子的皮肤。
    2. 第二层：在医用胶带外包裹一层36 mm宽的双面泡沫胶带，然后从腹股沟至踝关节缠绕聚合物绷带。确保膝关节呈180°伸直，踝关节背屈60°。
    3. 第三层：在膝关节和踝关节的前后方使用小夹板固定关节，并在最外层包裹钢丝网以防止咬伤。暴露兔子的脚趾，以便观察血液循环是否正常。
  4. 将动物固定6周以建立膝骨关节炎（KOA）模型（图1）。
    注意：1）造模期间，每隔一天检查一次固定装置。若发现任何装置松动或脱落，需对兔子重新麻醉，并将左后肢再次固定于伸展位置。2）在笼底铺设防护垫，防止兔子肢体卡住造成损伤。

2. 针刀干预

注意：在开始针刀干预之前，通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）对兔子进行麻醉。

  1. 确定治疗部位。
    1. 剃除兔左后肢膝关节处的毛发。
    2. 触诊兔膝关节内侧股骨肌腱止点、股直肌肌腱止点、股二头肌肌腱止点及鹅足滑囊。使用无菌皮肤标记笔标记局部肌肉的病理性结节。用医用碘伏和75%医用酒精交替消毒膝关节三次。
  2. 小针刀操作
    1. 保持小针刀刀刃方向与肌腱走向及肢体长轴平行。
    2. 用左手拇指按压进入标记点处的皮肤，并向侧方移动，使血管和神经位于拇指掌侧下方。
    3. 右手持小针刀柄，快速轻压，使小针刀刀刃瞬间穿透皮肤。缓慢推进小针刀至局部肌肉结节处，进行纵向切割并横向摆动。
    4. 小针刀操作完成后，再次消毒膝关节，并贴上创可贴。
  3. 每周操作一次，连续4周（图2）。
    ​注意事项：1）若在股内侧肌、股外侧肌、股直肌、股二头肌肌腱止点或鹅足滑囊处未触及结节或条索状组织，仍应使用小针刀直接松解上述肌腱止点。2）在小针刀干预过程中，切勿将小针刀组和模型组兔的左后肢固定于伸直位。

3. 股四头肌的弹性模量

注意：1）本实验采用实时剪切波弹性成像（SWE）超声诊断仪器，对各组家兔股四头肌的弹性模量进行活体测量。2）操作者应为具有超声检测经验的超声技师。测量时，超声探头应轻柔地放置于股四头肌皮肤表面，避免引起局部肌肉紧张。测量需在动物处于安静状态、无挣扎或活动时进行。若动物处于活动状态，应等待其安静后再进行检测。

  1. 剃除左后肢股四头肌区域的毛发，暴露皮肤。
  2. 使用常规二维超声定位股四头肌肌腹，并确定感兴趣区域（ROI），设置为1-2 cm的深度。
  3. 启动SWE模式进行检测。
    1. 将感兴趣区域统一设置为直径2 mm的圆形区域，且该区域位于皮肤表面下约0.5-1 cm深度处。
    2. 使用超声诊断仪器产生声辐射力脉冲，以刺激肌肉组织并获取组织弹性成像。
    3. 等待2-3秒使图像稳定，然后冻结图像。激活仪器的Q-BOX功能，测量股四头肌的杨氏模量。
    4. 等待系统自动计算感兴趣区域内杨氏模量的最大值、最小值和平均值（单位：KPa）。在同一深度选取三个感兴趣区域进行三次测量，并取平均值用于统计分析。
      注意：操作者应为具有超声检测经验的超声技师。测量时，超声探头应轻放在股四头肌皮肤表面，避免引起局部肌肉紧张。测量需在动物处于安静状态、无挣扎或活动时进行。若动物处于活跃状态，应等待其安静后再进行检测。

4. 测量股四头肌的收缩力

注意：测量股四头肌收缩力后，在麻醉状态下通过空气栓塞处死兔子。

  1. 通过耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠（30 mg/kg）对兔进行麻醉。为确认已达到适当的麻醉深度，需观察角膜反射是否显著减弱或消失，并用止血钳夹住皮肤以确认无疼痛反应。在麻醉过程中，每隔 15 分钟向兔眼内滴加 2–3 滴润滑剂，防止兔眼干燥。
  2. 暴露股四头肌并连接张力传感器。
    1. 从髌骨下方沿肢体纵轴向上切开皮肤至大腿根部，并继续向上延长切口 3–4 cm。仔细剥离皮肤和筋膜，暴露肌肉。切断髌韧带，并小心分离股四头肌与髂骨连接处，保持股四头肌与髂骨相连。
    2. 在髌骨与股四头肌腱连接处结扎手术缝线。将肌肉拉伸至其自然状态下的全长，然后将其连接至张力传感器。确保肌肉上的结扎线与力传感器上的结扎线保持在一条直线上。
    3. 将张力传感器固定在支架上。将张力传感器上的信号采集线连接至生物信号采集系统处理器。
  3. 测定股四头肌的收缩性能。
    1. 将电极平行插入股四头肌腹部，并避免电极之间相互接触。
    2. 按下示波器按钮。调节支架上力传感器的位置，使基线保持在零位。选择刺激器的刺激参数，设置脉冲宽度为5 ms，延迟时间为10 ms。
    3. 首先使用单次刺激，从零开始逐步增加刺激强度，每次递增 0.1 V。观察肌肉收缩曲线及收缩幅度的变化，直至确定股四头肌的最大单收缩幅度（Pt），记录该值以供后续统计分析。
    4. 使用串刺激，以引起最大单收缩幅度的刺激强度为基准，持续刺激肌肉并逐步增加刺激频率。观察肌肉收缩曲线的变化，直至确定股四头肌的最大收缩幅度（Pt），记录该值以供后续统计分析。
      ​注意：1）每次肌肉收缩后，应让肌肉休息 30 秒，期间持续向肌肉滴加缓冲液。2）操作过程中，通过监测兔的眼睑反射、呼吸节律、肌肉松弛程度以及皮肤夹捏反应来判断麻醉状态。

5. 股四头肌腱的力学性能

  1. 预处理：测试当天，使用游标卡尺测量股四头肌腱的长度、宽度和厚度，并在疲劳试验机上安装专用防滑夹具。进行15次重复加载和卸载以完成预处理。
  2. 应力松弛试验：使用量程为 0 N 至 100 N 的传感器，以 5 mm/min 的 速度 拉伸至目标长度后开始采集数据。设置计算机数据 采集时间 从 t (0) 开始，每 0.1 s 采集一次数据，持续 1,800 s。达到设定时间后，记录数据和曲线。
  3. 拉伸试验：使用量程为 0 N 至 100 N 的传感器，以 5 mm/min 的 速度 拉伸至试样断裂时的最大载荷。试验结束后，计算试样的最大位移、极限载荷和刚度。

6. 软骨的关节接触面压力及单位面积压力

  1. 将双侧股骨和胫骨标本固定在夹具上，保持伸直状态，并进行预加载测试。测量膝关节的大致范围，将压力感应纸裁剪成相同形状，并用塑料膜密封。
  2. 将密封好的压力感应纸置于胫骨与股骨关节之间，以5 mm/min的加载速度和50 N的最大压力对膝关节进行压力测试。当压力达到50 N且压力感应纸显色稳定后，持续加压2 min。
  3. 2分钟后，取出压力感应纸，将显色面固定在一张A4纸上，并在旁边放置标尺后采集图像。
  4. 将图像上传至计算机，使用参考软件对不规则图形进行面积测量和多段测量，分别测定股骨和胫骨关节内侧与外侧的压力，并记录结果。

7. 膝关节软骨的藏红O/快绿染色

  1. 针刀干预结束后，取软骨-软骨下骨复合组织，包埋于石蜡中。将制备好的组织蜡块切片并制备载玻片。用环保脱蜡液(I)和环保脱蜡液(II)分别脱蜡15分钟；随后依次浸入二甲苯与无水乙醇（1:1）、无水乙醇(I)、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中，每步2-5分钟；最后在蒸馏水中浸泡15分钟。
  2. 进行染色。
    1. 用快绿染液染色1分钟。在此过程中，将载玻片从溶液中取出并在显微镜下观察，直至组织染成深绿色。
    2. 分化处理：用超纯水冲洗掉多余的快绿染液。将载玻片迅速浸入1%醋酸溶液中5-10秒，再次用超纯水冲洗载玻片。
    3. 将载玻片置于番红O染液中染色10-15分钟，直至软骨染成红色。
  3. 脱水透明，封片，并在显微镜下观察。
    1. 将载玻片依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，每步3-5秒。
    2. 将载玻片依次浸入环保脱蜡液(I)和环保脱蜡液(II)中各10分钟。取出载玻片后，在其正面滴加中性树脂封片剂，避免接触组织。将盖玻片边缘置于载玻片上，然后缓慢放下以覆盖中性树胶。排除空气，避免产生气泡。擦去多余的二甲苯和中性树胶，室温下静置过夜。
    3. 在显微镜下观察载玻片并采集图像。每组选取6个兔膝关节软骨样本，对每个样本随机选择4个不同的视野进行评估。根据Mankin评分法（表1）对各组软骨组织学进行评分。

8. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准差（静态平衡，ΣFx=0 示意图；显示力的平衡，物理学教育概念。 ± s）表示数据。
  2. 采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD检验法，以确定多组间比较的统计学显著性。
  3. 当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

股四头肌及肌腱力学特性的实验结果
为评估针刀疗法对膝骨关节炎（KOA）兔模型股四头肌力学特性的影响，我们分别采用实时剪切波弹性超声成像和肌肉张力换能器进行检测。与对照组相比，KOA组股四头肌的杨氏模量降低（P < 0.05）。与KOA组相比，针刀组股四头肌的杨氏模量升高（P < 0.05，图3A）。在股四头肌收缩能力方面，与对照组相比，KOA组股四头肌的单收缩幅度和强直收缩幅度均显著降低（P < 0.05，P < 0.01）。与KOA组相比，针刀组股四头肌的单收缩幅度和强直收缩幅度均显著升高（P < 0.05，P < 0.01，图3B，C）。这些结果表明，针刀疗法可改善KOA兔模型股四头肌的杨氏模量和肌肉收缩力。

为了评估小针刀对膝骨关节炎（KOA...

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讨论

合适的动物模型是实现实验目标并阐明特定科学问题的关键因素之一。本研究基于以下理论： "宗筋主司骨骼运动并润滑关节" 和 "机械不平衡" 在针刀医学中，旨在阐释针刀治疗膝骨关节炎（KOA）背后的科学内涵 "通过调节肌肉和肌腱治疗骨骼疾病" 在针刀治疗中，换言之，针刀通过调节膝关节周围软组织的力学特性，改善软骨的异常力学环境，从而延缓软骨退变并保护软骨。膝骨关节炎（KOA）动物模型通常分为两类：自发性模型和诱导性模型。由于建模周期相对较长且存在较大局限性，自发性KOA模型应用较少。诱导性KOA模型可通过手术方法（如改良Hulth法、半月板切除术、前交叉韧带断裂、关节内注射及关节固定）建立。手术方法包括切断内侧副韧带、前交叉韧带，切除内侧半月板及其他结构，以造成膝关节不稳定，导致关节内部力学失衡及关节面之间的直接摩擦，进而诱发KOA。11这种模型更适合用于创伤性关节炎的研究。关节内注射将药物递送至膝关节腔，可诱导关节腔内软骨细胞的炎症反应、代谢紊乱及毒性反应，从而引发膝骨关节炎（KOA），同时对关节受力影响较小。...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（编号：82074523，82104996）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
针刀北京卓越华友医疗设备有限公司0.4 x 40 mm
Connect Cast 骨科固定绷带苏州康力医疗器械科技有限公司KCP0615.0 cm x 360 cm
双面泡沫胶带得力集团有限公司NO.3041636 mm x 5 码 x 2.5 mm
环保脱蜡液武汉赛维尔生物科技有限公司G1128
无水乙醇北京恒康达医药有限公司
快绿染液武汉赛维尔生物科技有限公司G1031
快绿 FCFSigma, America2353-45-9
疲劳试验机BOSE, AmericaBose Electro Force 3300
四通道生理记录仪成都仪器厂RM-6420
FPD-305EFuji, Japan
FPD-306EFuji, Japan
苏木精染液武汉赛维尔生物科技有限公司G1005
医用碘伏消毒剂山东利康医疗科技有限公司
医用胶带山东荣健卫生用品有限公司2004021.5 x 500 cm
肌肉张力换能器 成都仪器厂JH-2204005, 50 g
PrescaleFuji, Japan
实时剪切波弹性超声诊断仪SuperSonic Imagine SA, FranceSuperSonic Imagine AixPlorer
结冷胶武汉赛维尔生物科技有限公司WG10004160
沙黄 OSigma, America477-73-6
沙黄 O 染液武汉赛维尔生物科技有限公司G1015
社会科学统计软件包（SPSS）IBM, America

参考文献

  1. Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigolo, B. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 8 (11), 1305(2019).
  2. Cui, A. Y., et al. Global, regional prevalence, incidence and risk factors of knee osteoarthritis in population-based studies. EClinicalMedicine. 29-30, 100587(2020).
  3. Miyauchi, A., et al. Alleviation of murine osteoarthritis by deletion of the focal adhesion mechanosensitive adapter, Hic-5. Sci Rep. 9 (1), 15770(2019).
  4. Wright, T. Biomechanical factors in osteoarthritis: the effects of joint instability. HSS J. 8 (1), 15-17 (2012).
  5. Patsika, G., Kellis, E., Kofotolis, N., Salonikidis, K., Amiridis, I. G. Synergetic and antagonist muscle strength and activity in women with knee osteoarthritis. J Geriatr Phys Ther. 37 (1), 17-23 (2014).
  6. Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. X. Joint instability and osteoarthritis. Clin Med Insights. Arthritis and Musculoskelet Disord. 8, 15-23 (2015).
  7. Henriksen, M., Christensen, R., Danneskiold-Samsøe, B., Bliddal, H. Changes in lower extremity muscle mass and muscle strength after weight loss in obese patients with knee osteoarthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 64 (2), 438-442 (2012).
  8. Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55 (1), 44-51 (2013).
  9. Felson, D. T. Osteoarthritis as a disease of mechanics. Osteoarthr Cartil. 21 (1), 10-15 (2013).
  10. Ma, S. N., et al. Effect of acupotomy on FAK-PI3K signaling pathways in KOA rabbit articular cartilages. Evid Based Complement Alternat Med. 2017, 4535326(2017).
  11. Yu, P., et al. Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis. China Medical Herald. 16 (27), 41-44 (2019).
  12. Li, L. H., et al. Research progress of rabbit knee osteoarthritis model. Journal of Jiangxi University of Chinese Medicine. 31 (4), 108-113 (2019).
  13. Zhang, W., Gao, Y., Guo, C. Q., Khattab, I. Z. A., Mokhtari, F. Effect of acupotomy versus electroacupuncture on ethology and morphology in a rabbit model of knee osteoarthritis. J Tradit Chin Med. 39 (2), 229-236 (2019).
  14. An, X. Y., et al. Chondroprotective effects of combination therapy of acupotomy and human adipose mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis rabbits via the GSK3 beta-cyclin D1-CDK4/CDK6 signaling pathway. Aging Dis. 11 (5), 1116-1132 (2020).
  15. Guo, C. Q., Liu, N. G. Analysis on the distribution features of Ashi points in Jingjin disorders. Journal of Basic Chinese Medicine. 17 (8), 899-900 (2011).
  16. Guo, C. Q., et al. Effects of acupotomy therapy on tenderness point around knee joint in patients with knee osteoarthritis: a randomized controlled clinical trial. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. 33 (3), 3-5 (2010).
  17. Zhao, Y., Dong, F. H., Zhang, K. Analysis of soft tissues mechanical changes and treatment of meridian tendon pain. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. (9), 705-707 (2008).
  18. Zhang, L. P., Cheng, F., Liu, D. Y., Zhu, L. G. Application progress of biomechanics in knee osteoarthritis. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 34 (7), 1644-1647 (2016).
  19. Thomas, A. C., Sowers, M., Karvonen-Gutierrez, C., Palmieri-Smith, R. M. Lack of quadriceps dysfunction in women with early knee osteoarthritis. J Orthop Res. 28 (5), 595-599 (2010).
  20. Li, L., et al. Effects of unloaded muscle atrophy on contractile characteristics of hind-limb skeletal muscles in mice. Space Med Med Eng. 25 (5), 322-325 (2012).

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