本文详细描述了在实验小鼠强直性脊柱炎治疗过程中进行督灸的操作步骤及注意事项。
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摘要
摘要
强直性脊柱炎（AS）是一种进行性加重且致残性的关节炎，主要累及中轴骨骼。该疾病主要侵犯脊柱和骶髂关节。在疾病后期，脊柱和骶髂关节可能发生融合，导致脊柱僵硬和驼背，以及行走困难，严重影响患者的工作能力和日常生活质量，给患者、家庭和社会带来沉重负担。近年来，非药物疗法作为强直性脊柱炎的替代治疗手段日益受到关注。艾灸是中医（TCM）中一种古老的治疗技术。督灸疗法是在普通艾灸基础上发展起来的一种独特而创新的外治法，对强直性脊柱炎具有明确的治疗效果。督灸巧妙结合了中医的多种相容技术，融合了经络、穴位、中草药与艾灸的作用。本文详细描述了在实验小鼠中实施督灸的操作步骤及注意事项，旨在为研究督灸治疗强直性脊柱炎的作用机制提供实验依据。
引言
强直性脊柱炎（AS）是一种进行性加重且致残性的关节炎，主要累及中轴骨骼。根据最新的流行病学调查，全球约有0.01%至1.8%的人口患有此病1，其中大多数为年轻男性（男女比例约为2-3:1）2。中国人群中AS的发病率为0.2%至0.4%。该疾病主要累及脊柱和骶髂关节。在疾病晚期，可能出现脊柱和骶髂关节融合，导致脊柱僵硬和驼背，以及行走困难，严重影响患者的工作能力和日常生活质量，给患者、家庭和社会带来沉重负担1。目前尚无根治AS的方法，现有的药物和非药物治疗手段主要集中在缓解疼痛、延缓疾病进展以及提高生活质量。近年来，由于药物治疗选择十分有限3，非药物治疗日益受到关注，已成为AS的一种替代疗法。在中国，患者通常更倾向于接受副作用较小、治疗过程方便的中医外治法。
艾灸是中医使用的一种古老治疗技术。督灸是一种外治技术，包括 "泡沫辅助药物艾灸" 位于督脉的脊柱节段。主要用于强直性脊柱炎（AS）的治疗，已显示出安全性和有效性。与普通艾灸相比，督灸具有艾灸面积广、艾炷大、火力强、温度高的特点4一项系统评价和荟萃分析表明，艾灸是强直性脊柱炎的有效辅助治疗方法5最近一项研究证实，艾灸可改善强直性脊柱炎患者的临床症状及部分炎症因子6研究表明，督灸可增加脑内β-内啡肽含量，产生中枢性镇痛作用7，下调该基因的表达水平 HLA-B27 基因8，并延缓强直性脊柱炎（AS）的复发率。督灸还可通过降低炎症指标红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、I型胶原C端肽（CTX-I）以及Dickkopf1蛋白（DKK1）水平，对AS的病情进展产生改善作用。9,10.
另一项临床研究表明，督灸可进一步调节紊乱的T细胞亚群、免疫球蛋白（Ig）及补体C3，从而平衡免疫机制11。在骨代谢方面，艾灸可抑制血清碱性磷酸酶（ALP）和血清磷（S-P）的升高，增加血清钙（S-Ca）、骨密度（BMD）和骨强度12。此外，督灸可通过多靶点修复脊柱功能，缓解强直性脊柱炎（AS）患者的疲劳症状13。一些动物研究揭示了艾灸治疗AS的潜在机制。一项研究表明，艾灸显著改善了整体健康状况，降低了足跖厚度，并减少了脊柱韧带组织样本中IL-1β、PGE2、IL-6和TNF-α的水平。代谢通路分析将鉴定出的代谢物与三羧酸（TCA）循环以及脂质、氨基酸、肠道菌群和嘌呤代谢相关联14。另一项研究表明，艾灸抑制了促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17和IL-6的表达；降低了RANKL, RANK, ALP和OCN的mRNA水平；并改善了AS小鼠的组织病理学特征15。
尽管这些研究表明艾灸可能对强直性脊柱炎（AS）的治疗有效，但仍需更多研究来证实这些发现，并确定艾灸治疗AS患者的最优治疗方案。我们的团队基于传统中医艾灸的基本理论和实际操作，创建并改进了艾灸疗法，该疗法在中国临床实践中已广泛应用超过35年。尽管目前关于督脉艾灸治疗AS的高质量研究较少，但其用于治疗AS的适应证已有证据支持。然而，督脉艾灸治疗AS的作用机制仍值得进一步研究。动物实验是探索督脉艾灸治疗AS机制的重要方法。督脉艾灸的临床操作相对成熟，但在动物实验机制研究中的应用却较少。本文详细描述了在AS实验小鼠治疗过程中进行督脉艾灸的操作步骤及注意事项。
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方案
所有动物实验均经山东中医药大学实验动物福利伦理审查委员会批准（编号：SDUTCM20230831301）。
1. 动物准备
- 预先确定实验分组及每组动物数量。
- 选用雄性 BALb/c 小鼠，在温度恒定为 22 ± 1 °C、湿度恒定为 60 ± 5%、光照周期为 12 小时昼夜循环的环境中饲养。
2. AS 小鼠模型的建立
注意：AS 模型通过软骨蛋白聚糖（PG）诱导建立，这是一种经典的建模方法16,17,18,19,20,21。采用 BALB/c 品系小鼠，通过反复免疫 PG 以诱导肌腱炎和脊柱炎。有关本实验方案中所用材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
- 使用200 µL移液器吸取200 µL PG和CFA（或IFA）至1.5 mL离心管中。轻轻振荡离心管以混匀液体。
- 将离心管放入组织研磨器中进行均质化处理，随后在冰上孵育4分钟。重复此步骤5次。在组织研磨器中设置以下参数：60 Hz，研磨30 s，间隔10 s，共进行6个循环。
- 用1 mL注射器从离心管中吸取0.2 mL乳化的PG蛋白。
- 用左手抓取并固定小鼠，使其呈仰卧位，头部低于尾部，以防止注射时损伤腹腔器官。
- 用右手使用酒精棉片对腹部进行消毒。
- 右手持注射器，在腹部下半部中线（linea alba ventralis）稍偏左或偏右的位置，将针头以皮下注射方式刺入皮肤。
- 将针头在皮下平行于腹部中线推进3-5 mm，然后以45°角刺入腹腔。
- 穿透腹膜后，回抽针芯，缓慢注入乳化的PG蛋白。
3. 督脉灸
注意：提前准备好督灸所需的三种最重要的原材料（图1）。
- 制备艾炷。用手取艾绒，两手掌心相对，向相反方向施加扭转力，将艾绒搓成纺锤形（图2）
- 将生姜切成小块，放入榨汁机中打成姜泥（图3）。用棉纱布过滤姜泥，分离出姜汁和姜泥，以备后续步骤使用。
- 取10 g姜泥和20 mL姜汁，分别置于纸杯中备用。
- 称取0.1 g中药粉末（肉桂粉、丁香粉、羌活粉、斑蝥粉和人工麝香的混合物）22，在研钵中研磨。
- 将小鼠放入动物麻醉机的麻醉诱导箱中，使用2–3%异氟烷与氧气的混合气体进行麻醉，气体流速为2 L/min 。
- 通过观察小鼠是否无惊跳反射初步评估麻醉深度，并通过轻捏脚趾检查是否存在足底反射，以确认手术麻醉水平。
- 当小鼠达到手术麻醉阶段后，将其从诱导箱中取出，俯卧位固定于手术台上，使小鼠口鼻对准麻醉气体出口。
- 通过连接在麻醉机上的面罩输送异氟烷和氧气，采用无重复呼吸回路维持麻醉。在整个操作过程中，将小鼠置于37 °C加热垫上，并在眼部涂抹润滑剂以防止角膜干燥。
- 定位穴位，确定刺激区域（图4）。
- 剃除小鼠背部毛发，直至露出肉色皮肤。确保脱毛区域宽度约为1.5 cm，长度从第七颈椎延伸至尾椎（图5A）。
- 用棉纱布将制备好的姜汁涂抹于剃毛区域（图3）。
- 用毛笔将中药粉末均匀撒在小鼠背部正中线上，并覆盖桑皮纸（图5B-D）。
- 用姜泥制作一个长6 cm、宽1.5 cm、厚3 mm的梯形姜柱，将其固定在桑皮纸上（图5E）。
- 在姜柱正中线上方切出一条凹槽，并将艾炷置于姜柱之上（图3）。
- 点燃艾炷，前一艾炷燃尽后更换新的艾炷，共施灸三壮。注意检查姜柱的稳固性，防止灼伤小鼠 （图5F）。
- 艾炷燃尽后，擦去姜片和中药粉末，清洁小鼠背部，并停止麻醉。
- 将小鼠转移至新的笼盒中，自由摄食饮水，恢复意识。将笼盒置于加热垫上以促进恢复，持续观察动物直至其意识充分恢复。
- 待小鼠完全恢复后，确认其翻正反射存在，再将其送回常规饲养环境。
注意：操作过程中需密切监测小鼠精神状态，避免呼吸微弱；防止烫伤的同时注意保温，避免爪部和尾部挫伤。
4. 关节炎指数（AI）的评估
- 在建模前、建模后和治疗后三个时间点评估关节炎指数（AI）评分：0分，无红肿；1分，少数脚趾轻微红肿；2分，多数脚趾及趾间关节红肿；3分，足部及踝关节以下出现严重红肿；4分，足部及踝关节均出现红肿23。
- 计算四只足爪的AI评分总和，最高分为16分。
5. 旋转棒实验
注意：转棒实验通过记录小鼠在旋转鼓上停留的时间来评估其运动协调性和平衡能力。本实验共包含三次试验，每次间隔20分钟。正式实验数据取自第三次试验，前两次试验作为训练练习。
- 将小鼠置于旋转滚筒上，滚筒在300秒内以4至40 rpm的连续加速度旋转24。
- 测量潜伏时间（即小鼠从开始到从滚筒上跌落所需的时间）。当小鼠跌落时，应提供缓冲垫以防止受伤。
6. 开放旷场实验（OFT）
注意：开放旷场实验（OFT）用于评估自主运动状态，旨在识别病理性行为。将四个方形开放旷场区域（50 cm × 50 cm × 40 cm）并置组成实验装置。箱体底部被划分为九个相等的方格。
- 将实验室的背景噪音控制在 65 dB 以下。
- 每次试验前用 75% 乙醇擦拭整个装置。
- 在测试前 1 小时将所有小鼠放入测试室，使其适应环境。
- 将小鼠放入方形开阔场地中，让其自由探索 10 分钟。
- 记录 10 分钟内的总移动距离和运动速度。
7. 安乐死与标本采集
- 将小鼠放入麻醉诱导箱中，使用2-3%异氟烷与氧气的混合气体进行麻醉，氧流量为2 L/min。当小鼠因深麻醉状态而出现足底反射消失时，将其转移至手术台进行维持麻醉。
- 用非优势手抓握并固定小鼠。
- 轻压眼部区域，使眼球充血并突出。
- 使用剪刀修剪小鼠的胡须，以防止毛发引起的溶血。
- 通过夹捏脚趾检查是否缺乏足底反射，以确认麻醉深度。用镊子夹住眼球并迅速摘除，使血液从眼眶流入微量离心管中。
注意：也可采用其他采血方法，如心脏穿刺。 - 当血液滴速减慢时，轻轻按压小鼠心脏区域以加快血液泵出，从而获取更多血液。随后通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 用非优势手中的镊子夹住踝关节上方的腿部，然后用剪刀在踝关节上方切断腿部。
8. 组织学分析
- 将踝关节标本浸入4%多聚甲醛中固定超过24小时，随后用10% EDTA（pH = 7.4）脱钙1个月。
- 将标本在4%多聚甲醛中浸泡2小时。
- 然后将标本依次浸入浓度递增的乙醇梯度溶液（70%、80%、90%、100%、100%、100%）中，每种浓度各浸泡1小时。
- 将标本在二甲苯中浸泡3小时。
- 将踝关节标本浸入石蜡中7小时，然后将石蜡块置于4 °C冰箱中保存。
- 使用半自动石蜡切片机将石蜡块切成6 µm厚度的切片。
- 将切片在二甲苯中浸泡4次，每次5分钟，以彻底脱蜡。
- 将切片依次浸入浓度递减的乙醇梯度溶液（100%、100%、95%、75%）中，每种浓度各2分钟；随后在蒸馏水中浸泡2分钟。
- 用苏木精染色10分钟，并用蒸馏水冲洗5秒。
- 将切片在分化液中浸泡30秒，再用蒸馏水冲洗5秒。
- 用伊红染色1分钟，并用蒸馏水冲洗3分钟。
- 将切片依次浸入浓度递增的乙醇梯度溶液（80%、95%、100%、100%）中，每种浓度各1分钟；然后在二甲苯中浸泡3次，每次3分钟，最后封片25。
9. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
- 根据制造商说明书，使用相应的试剂盒检测血浆中IL-17和TNF-α的浓度。
10. 统计分析
- 以均值 ± 均值标准误（SEM）表示数据。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）或双因素重复测量方差分析（ANOVA），随后进行 Bonferroni 或 Tamhane T2 事后检验，以确定显著性。
- 认为 P < 0.05 具有统计学显著性。
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结果
PG诱导的小鼠模型出现了外周关节炎症状，表现为四肢末端和脚趾发红肿胀，并在第14周时即逐渐出现中轴性关节炎，这与强直性脊柱炎（AS）的临床表现非常相似。因此，若小鼠在末次注射后14周的关节炎指数（AI）超过3分，则认为AS小鼠模型构建成功22。当小鼠足部出现肿胀时，每周进行一次督灸治疗，共治疗3次。治疗结束后，在异氟烷深度麻醉下通过颈椎脱位处死小鼠，采集血液并切除踝关节组织。
督灸对运动协调性与自主运动的影响
采用牛痘病毒前列腺素诱导的关节炎模型，观察督灸作用于督脉对运动协调性的影响。首先采用关节肿胀评分评估模型是否成功建立，并通过转棒实验和开放场地实验（OFT）评估运动协调性和自主运动能力。
采用关节炎指数（AI）评估外周性关节炎的严重程度。建模后，双向重复测量方差分析显示，在督灸治疗前，模型组和督灸组的关节肿胀评分均较对照组显著升高（P < 0.01；图6A）。督灸治疗...
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讨论
强直性脊柱炎的临床表现为背部、腰部及关节肿痛，严重时可出现脊柱畸形和关节强直26早期诊断和治疗可提高强直性脊柱炎（AS）患者的生活质量，降低致残率，并改善预后。根据中医理论，AS被认为是由于肾阳和督脉阳气不足，以及寒邪内积所致。中医认为，基于经络理论的艾灸能够产生温煦体表的气，此气继而沿经络和穴位向下传导。在 黄帝内经 （一部非常经典且重要的中医典籍），其中记载了 "治疗病变的督脉。" 由于强直性脊柱炎（AS）位于督脉，因此刺激督脉被用作治疗穴位。督脉被认为是阳经之海，阳气在此达到顶峰。对督脉进行艾灸可补益阳气，激发督脉功能，并调节肾阳的温煦作用，即增强西医的免疫调节功能。
从西医角度来看，脊髓在传递神经信息方面起着重要作用。督灸作用于脊神经根的进出部位，可通过调节神经递质来影响神经系统的功能与调控机制。20世纪90年代的研究证实，督灸可增加大鼠下丘脑中β-内啡肽的含量，从而产生中枢性镇痛效应7。此外，附着点炎是强直性脊柱炎（AS）常见的并发症，其特征为...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金面上项目（No.82174491）和齐鲁中医药学术流派传承项目（鲁卫函〔2020〕132号）的资助。感谢山东中医药大学实验动物中心为我们提供实验条件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% EDTA | 中国上海麦克林生化有限公司，中国上海 | ||
| 酒精棉片 | HYNAUT，青岛海诺生物工程有限公司，中国青岛 | ||
| 麻醉机 | 医疗用品 & Services INT. LTD，英国基斯利 | ||
| 离心管 | Axygen，Corning，纽约，UAS | ||
| 完全弗氏佐剂（CFA） | 中国上海阿拉丁 | F393378 | |
| 棉球 | 河南瑞科医疗器械有限公司，新乡，中国 | ||
| 棉纱布 | 中国河南瑞科医疗器械有限公司，新乡，中国 | ||
| 砧板 | 自备 | ||
| 来自牛关节软骨的decorin | Sigma-Aldrich，密苏里州，美国 | D8428 | |
| 脱毛膏 | Veet，利洁时（中国）投资有限公司，中国上海 | ||
| 电子天平 | 中国上海雅金电子科技有限公司，中国上海 | ||
| Eppendorf管 | Axygen, Corning, 纽约, UAS | ||
| 眼润滑剂 | 中国北京双吉制药有限公司，中国北京 | ||
| 姜 | 自备 | ||
| GraphPad Prism 7 软件 | GraphPad 软件，美国波士顿 | ||
| 理发剪 | 中国金华，Super human Group CO LTD | ||
| 加热垫 | 中国深圳乐硕科技有限公司，中国深圳 | ||
| 不完全弗氏佐剂’不完全弗氏佐剂（IFA） | 阿拉丁，中国上海 | F393371 | |
| 注射 注射器 | 中国山东新华安德医疗器械有限公司，淄博，中国 | ||
| 异氟烷 | 中国深圳 Rayward 生命科技有限公司，中国深圳 | R510-22-10 | |
| 香薰棒 | 中国石家庄利都香业有限公司，中国石家庄 | ||
| 榨汁机 | 博朗（上海）有限公司，中国上海 | ||
| 刀 | 自备 | ||
| 较轻的 | 浙江虎牌打火机有限公司 | ||
| 研钵 | 中国洛阳，洛阳伊奈陶瓷科技有限公司 | ||
| 小鼠 IL-17 ELISA 试剂盒 | 中国上海，absin | abs520009-96T | |
| 小鼠 TNF-αα ELISA试剂盒 | 中国武汉 中国武汉三赢 | KE10002 | |
| 桑皮纸 | 中国临沂市沂水县穆林桑纸业有限公司 | ||
| OFT | 中国上海 Xinruan | XR-XZ301 | |
| 纸杯 | 自组装 | ||
| 移液器 | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.，英国牛津 | ||
| 精制艾绒 | 自备 | ||
| 转棒实验 | 中国上海 Xinruan | XR-6C | |
| scientz-48L 冷冻高通量组织研磨仪 | 宁波新芝生物科技股份有限公司 | ||
| 剪刀 | 中国山东嘉仁医疗用品有限公司，淄博，中国 | ||
| 半自动石蜡切片机 | 徕卡相机股份公司，德国瓦岑纳赫 | ||
| SPSS 25.0 软件 | 国际商业机器公司，纽约，美国 | ||
| 中药粉末 | 自备 | ||
| 提示 | Biosharp，Labgic，中国北京 | ||
| 毛笔 | 中国临沂市沂水县穆林桑纸业有限公司 |
参考文献
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