LTE的制备与优化 Leishmania tarentolae 衍生的无细胞蛋白表达系统用于重组蛋白生产

摘要

利什曼原虫翻译提取物（LTE）是一种源自单细胞寄生虫Leishmania tarentolae的真核无细胞蛋白表达系统。该优化方案使LTE的制备过程简便且成本低廉，适用于多种研究复杂真核蛋白及其相互作用的多平行表达与分析应用。

摘要

本方案概述了源自单细胞鞭毛虫Leishmania tarentolae的真核无细胞蛋白表达系统（CFPS）的制备与优化过程，该系统被称为利什曼虫翻译提取物（Leishmania Translational Extract，简称LTE）。尽管该生物最初是壁虎的寄生虫，但其可在摇瓶或生物反应器中轻松且低成本地培养。与Leishmania major不同，它对人类无致病性，无需特殊的实验室防护措施。使用利什曼虫进行无细胞蛋白表达的另一优势在于：只需向CFPS中添加一条靶向所有蛋白编码RNA 5'端保守剪接前导序列的反义寡核苷酸，即可抑制内源性蛋白的表达。我们提供了细胞裂解和裂解液处理的操作流程，相较于先前版本已进一步简化并优化，且整个流程从简单的摇瓶培养开始。此外，我们还阐述了如何使用含有物种非依赖性翻译起始位点（SITS）的载体引入遗传信息，以及如何开展简便的批次优化和质量控制，以确保蛋白表达质量的一致性。

引言

20世纪60年代，无细胞蛋白表达系统在破译遗传密码的过程中发挥了关键作用¹。然而，目前基于原核生物（主要是大肠杆菌 E. coli）的无细胞蛋白表达系统在实验室和商业应用中仍占主导地位。尽管基于 E. coli 的系统具有成本低、可扩展性强和表达产量高等优势，但在产生活性形式的多结构域蛋白以及促进蛋白复合物组装方面仍面临挑战^2,3。目前常用的真核无细胞蛋白合成（CFPS）系统主要包括小麦胚芽提取物（WGE）、兔网织红细胞裂解液（RRL）和昆虫细胞裂解液（ICL）^4,5,6。本研究介绍了一种替代性的真核无细胞表达系统，该系统基于单细胞鞭毛虫寄生虫 Leishmania tarentolae，具有操作简便且可扩展的特点。

Leishmania tarentolae 可在烧瓶中使用低成本培养基轻松培养，并可在生物反应器中扩大培养以获得更高的细胞密度。通过使用靶向利什曼原虫mRNA剪接前导序列保守区的反义寡核苷酸，可中和细胞裂解液中内源性mRNA，从而避免其与外源引入的mRNA发生竞争⁷。与可引起人类疾病的近缘种Leishmania major不同，L. tarentolae感染摩尔壁虎（Tarentolae mauritanica），因此可在PC2级实验室环境中培养，无需采取特殊防护措施。该生物此前已被用作转基因宿主，用于体内蛋白表达⁸。

为了促进无细胞系统中的模板引物结合，已基于增强翻译起始的聚合RNA结构设计了通用序列⁹。这些物种无关的翻译序列（SITS）适用于原核和真核无细胞系统，并可用于向LTE系统中引入遗传信息。尽管本实验方案未详细说明用于LTE无细胞蛋白表达的载体构建方法，但优化和质量控制需要合适的载体，这些载体应在SITS位点下游包含目标蛋白的荧光蛋白融合序列。为此，合适的LTE载体已存入Addgene基因库，例如pCellFree_G03载体，该载体利用Gateway克隆位点编码目标蛋白N端的eGFP融合蛋白。

LTE 已在需要蛋白质表达的多种应用中证明了其价值，包括蛋白质自组装分析^10,16、人源整合膜蛋白的生产¹⁷、抗病毒药物候选物的研究¹⁸、具有生物技术应用价值的酶的开发¹⁹、蛋白质生物传感器的原型设计^20,21，以及钩虫来源生物制剂的研究²²。LTE 还在病毒学和细胞结构领域中用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络，发挥了重要作用^21,32。在表达全长、单一分散且非聚集状态的蛋白质方面，LTE 的性能已与其他真核无细胞系统相当³³，同时在生产成本和可扩展性方面更具优势。

本方案提供了培养和裂解宿主生物体、制备裂解液以及配制用于偶联转录/翻译蛋白表达的喂养溶液（FS）的技术。此外，还包括优化生产批次的方案。在利什曼原虫无细胞系统的初始版本中，蛋白表达水平、全长蛋白比例以及蛋白聚集体的存在表现出不期望的批间差异，导致部分批次被弃用³⁴。后续对方案进行了改进以解决该问题²⁵。当前方案在此基础上进一步优化，使各个批次均可实现蛋白表达量和蛋白大小的峰值表现。该目标通过严格控制细胞破碎仪的加样量（以600 nm处的光密度，即OD_600nm衡量），并利用280 nm处的吸光度（Abs_280nm）对所得裂解液进行标准化来实现。此外，本方案还引入了一种在生产过程中部分补充rNTP和镁离子的方法，并在测试表达期间进一步优化这些喂养溶液组分。尽管该优化步骤在方案中被列为可选步骤，但作者强烈推荐使用。

方案

本方案包含详细的培养基配方以及涉及细胞培养、离心、使用多功能酶标仪测量GFP荧光、测量培养物OD_600nm和检测裂解液Abs_280nm的操作步骤。此外，还涵盖了SDS-PAGE蛋白凝胶的制备与成像。本方案所需或建议使用的材料列于“材料”电子表格中。需要注意的是，除非另有说明，常规实验室资源（如培养基组分、离心机、离心管、分光光度计和凝胶电泳装置）通常可互换使用。图1概述了LTE的制造流程。

图1：LTE制备流程概览。 本示意图简要总结了LTE的制备流程。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 利什曼原虫（Leishmania tarentolae）培养物的培养

1. 准备至少 3 L 的 TBGG 培养基（Bactotryptone 12 g/L，Yeast extract 24 g/L，甘油 8 mL/L，葡萄糖 1 g/L，KH₂PO₄ 2.3 g/L，K₂HPO₄ 2.5 g/L，参见 材料表使用0.22 µm滤膜在真空条件下或类似装置中对培养基进行除菌。
2. 将培养基在室温（RT）保存，并在接种前立即加入终浓度的血红素和抗生素 L. tarentolae加入0.2%（v/v）的血红素（0.25% v/v 溶于50%三乙醇胺中），以及0.5%（v/v）的青霉素（10,000单位/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）混合液。
   注意：本实验方案的起始材料为培养好的 2 × 10 mL 野生型菌液 L. tarentolae维持培养物在27 °C条件下，于标准50 mL组织培养瓶中以低速振荡（75 rpm）培养。此类10 mL培养物可通过每隔2–3天用无菌TBGG（含血红素、青霉素、链霉素）以约1/20比例传代，长期维持培养。建议在二级生物安全柜内的PC2级实验室中操作；然而，由于添加了抗生素，通常可防止细菌污染，而真菌污染一般会被快速生长的培养物所抑制。 L. tarentolae.
3. 两天内，扩增 L. tarentolae 将维持培养物分别加至200 mL（第1天）和2 L（第2天） 通过 每天用体积递增的TBGG + 血红素/抗生素进行1:10稀释。两种稀释均在经高压灭菌的带挡板5 L玻璃烧瓶中进行（最大装液量为1 L）。第二次稀释必须在下午3至6点之间完成，以便于次日上午8至11点开始进行裂解物的制备。
   注意：本方案采用LTE生产的最小起始体积（2 × 1 L培养物）。也可通过增加一次扩增步骤，将培养规模扩大至10 L用于LTE生产（例如，第1天：100 mL；第2天：1 L；第3天：10 L）。尽管本方案使用带挡板的锥形瓶（参见 材料表) 以生长 L. tarentolae可选地，可使用专为细菌培养设计并配备鲁什顿搅拌器的传统生物反应器，前提是搅拌速度保持在100 rpm以下。生物反应器中更优的通气和pH控制通常可延长对数生长期 L. tarentolae 培养物，从而实现更高的收获光密度_{600 nm} 用于步骤1.4的10个
4. 记录 OD_{600 nm} 三份平行培养 通过 分光光度计比色皿中用TBGG直接进行1:10稀释。制备裂解液的适宜起始浓度范围为OD_{600 nm} = 4.0-8.0.
5. 如果 OD 值未达到预期，可适当延长孵育时间。_{600 nm} < 4.0. OD值为_{600 nm} > 8 可用，可产生更大量的无细胞表达裂解液，但由于进入对数后期生长阶段，质量较低。将培养瓶置于冰上，等待后续操作。
   注意：准确测量最终培养物的OD_{600 nm} 至关重要，因为它用于在细胞裂解前计算浓缩细胞的最终体积。该计算方法取代了早期LTE制备过程中采用的细胞沉淀物称重法，以校准裂解前的细胞浓度。³⁴，以简化实验步骤。确保使用TBGG稀释以测定OD_{600 nm} 测量时需避免渗透压休克导致细胞形态改变，从而引起测量误差。用移液器混匀1:10稀释液以测定OD_{600 nm} 在进行分光光度读数前几秒（直接在比色皿中）进行测量，作为 L. tarentolae 细胞会迅速沉淀，呈现明显的浑浊外观。如果表达培养物的终体积仅为估算值，建议在收获时称量锥形瓶（扣除相应空瓶皮重），以获得更准确的体积估算值（按1 g = 1 mL计算）。最大OD_{600 nm} 尽可能从 L. tarentolae 在带挡板的烧瓶中培养时，OD600值可达15-20，但由于会进入稳定期，因此不适用于裂解液的制备。

2. 浓缩L. tarentolae 培养物

1. 在裂解前，必须将Leishmania细胞洗涤并浓缩约60倍。根据最终浓缩液的OD_600nm = 300计算细胞浓缩的目标体积。计算公式为：V = 收获体积（mL）×（收获时OD_600nm / 300）。例如，使用2 L培养物且收获时OD₆₀₀ = 5，则目标体积为33 mL。
   注意：OD_600nm = 300的目标值可进行调整；以往的LTE制备中曾使用150–350范围内的数值。细胞浓度越高，裂解后所得无细胞表达反应体系的蛋白产量通常越高，但易感蛋白发生聚集的风险也相应增加。OD_600nm = 300是LTE制备中一个合适的默认目标值。
2. 将收获的培养物转移至适当的离心瓶中，在4 °C条件下以2500 × g离心10分钟。小心将上清液倾入培养废液容器中。
   注意：应尽量减少细胞随弃去的上清液流失，因为这会影响裂解加样量的计算。在以往的LTE制备方案中，L. tarentolae细胞用于裂解前的浓度校准是通过将浓缩细胞在测试微量离心管中离心，并测定沉淀重量与总重量之比来完成的³⁴。本简化方案则基于测得的收获OD_600nm，采用理论上的浓缩液OD_600nm目标值，并假设在细胞浓缩和洗涤过程中细胞损失极小。
3. 用SEB缓冲液（45 mM HEPES-KOH pH 7.6，250 mM蔗糖，100 mM KOAc，3 mM Mg(OAc)₂，冰上保存）将细胞沉淀洗涤三次，每次在4 °C条件下以2500 × g离心10分钟。第一次洗涤时，每1 L沉淀培养物用100 mL SEB缓冲液重悬，然后合并至同一个离心瓶中。第二次洗涤时，同样每1 L原始培养物使用100 mL SEB缓冲液。
   注意：在最后一次沉淀重悬时，加入SEB缓冲液至最终目标重悬体积的50%（步骤2.1）。这样可在步骤2.4中精确地将合并后的浓缩液补足至最终目标体积。每次重悬操作应尽可能轻柔，以避免L. tarentolae细胞过早裂解，例如可通过轻轻晃动使加入的SEB缓冲液覆盖倾去上清后的沉淀，或将SEB缓冲液沿附着于离心管壁的沉淀处缓慢滴加。为便于操作，最后一步可将上清液转移至较小的离心管中进行。
4. 将重悬后的浓缩液倒入经预冷的适当玻璃量筒中，再用额外的冷SEB缓冲液补足至目标体积（步骤2.1），并轻轻混匀。

3. 裂解L. tarentolae浓缩物

1. 将细胞浓缩液转移至预冷至 4 °C 的氮气破壁装置（见材料表），用氮气加压至 70 bar，并在冰上孵育 45 分钟。
   注意：尽管氮气破壁装置并非常见实验室设备，但推荐用于 LTE 体系的制备。已尝试过其他替代方法，如细胞冻融法和法兰式压裂装置；然而，与氮气破壁法相比，蛋白表达活性低于<50%。氮气破壁装置在使用前及每次运行之间必须彻底清洗，所有后续步骤中会接触细胞裂解液的可重复使用容器（如接收瓶）亦需如此处理。合适的清洗程序包括使用实验室洗涤剂清洗，随后用去离子水充分冲洗。
2. 打开氮气破壁装置的排气阀，将所得裂解液排入足够坚固的容器中，例如置于冰上的真空接收瓶。倾斜接收瓶，确保所有裂解液充分沉降，以便用移液器转移至新的离心管或其他类似容器中。
   ​警告：氮气破壁装置依赖于细胞浓缩液从 70 bar 氮气压力突然降至常压的过程，该过程通过液体先流出、随后氮气快速通过装置出口阀实现。排气操作必须在化学安全通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行。存在目标容器破裂和裂解液损失的风险，因此我们使用坚固的真空接收瓶而非普通烧瓶。若装置出口阀连接有管路，避免将管路直接插入接收瓶内部，以防排气点压力积聚过高。

4. 细胞裂解物的离心

1. 将裂解液转移至适合承受相应 g 力的离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 15 分钟。将上清液转移至新的、相同的离心管中。
2. 在 4 °C 条件下以 30,000 × g 将裂解液离心 15 分钟，然后将最终的上清液转移至预冷的离心管或其他类似的容器中，并置于冰上。估算总体积。

5. 细胞裂解液的凝胶过滤

注意：使用凝胶过滤去除SEB缓冲液中包含的蔗糖。尽管蔗糖在细胞破碎过程中有助于稳定细胞内机制，但如果在蛋白表达反应中保留蔗糖，则会降低产量。

1. 将足够数量的PD-10重力驱动凝胶过滤柱（参见材料表）安装在支架上，确保每根柱子的流出液可滴入下方的收集盘或其他类似容器中，以便以每根柱子2.5 mL的处理量完成全部裂解液体积的过滤。在使用前，先让10 mL的4 °C EB缓冲液（45 mM HEPES-KOH pH 7.6，100 mM KOAc，3 mM Mg(OAc)₂）流经各柱，以进行预平衡。
   注意：从本步骤起的所有操作最好在4 °C冷室中进行。然而，也可将所有裂解液和试剂置于实验台上的冰盒中保存。唯一例外是凝胶过滤步骤，作者在此步骤中将一排柱子放置于4 °C冰箱内进行缓冲液置换。在本方案的早期版本中，新的凝胶过滤柱首次使用时需先用缓冲液处理裂解液，并弃去最初的流出液（即“封闭”步骤）。尽管目前认为此步骤并非必需，但在不同批次裂解液处理之间，必须用EB缓冲液冲洗柱子，并将其在4 °C下保存。由于新柱子可能对裂解液组分存在一定的非特异性吸附，最初收集的裂解液其蛋白表达活性可能低于后续收集的样品。
2. 向每根柱子中加入2.5 mL裂解液，待其完全进入柱体后，再加入额外0.5 mL EB缓冲液以使裂解液充分沉降至柱中，同时弃去此阶段的洗脱液。
3. 通过向每根柱子中再加入2.5 mL EB缓冲液，洗脱经凝胶过滤后的裂解液，并在柱子下方放置新的洁净托盘或其它接收容器以收集洗脱产物。

6. 细胞裂解液的补充

1. 使用纳米滴度分光光度计（见材料表）测定凝胶过滤裂解液在280 nm处的吸光度（Abs_280nm）。如果吸光度超过60，则用额外的4 °C EB缓冲液稀释至Abs_280nm = 60。
   注意：虽然通过OD_600nm控制加入破碎步骤的细胞密度可大致确定裂解液的浓度，但在裂解和后续处理后对Abs_280nm进行标准化可进一步提高裂解液批次间性能的一致性。裂解液的Abs_280nm可以上调或下调，这会影响蛋白表达产量和聚集情况（参见讨论部分）。如果未添加补充成分的裂解液显示Abs_280nm < 60，则可能需要在破碎步骤中加入更多的利什曼原虫生物量，即在步骤2.1中将细胞破碎仪的加载量提高至OD_600nm > 300。
2. 按2:5的比例向裂解液中加入5倍浓缩喂养溶液（5x FS，表1），并充分涡旋混匀。分装至合适的容器中（例如1.5 mL微量离心管），并在液氮中快速冷冻。如果后续将执行下方可选步骤7.1–7.3以优化LTE表达，则应使用表1中提供的降低浓度的rNTP.Mg 5x FS，而非默认的5x FS。请额外准备5份每份100 µL的分装样品用于冷冻，以供优化实验使用。
   ​注意：以2:5比例加入默认的5x FS并冷冻后，即可得到可直接用于表达的补充型LTE，其在表达反应中的使用量为每10 µL反应体系加入7 µL（因此，5x FS在最终反应体系中被稀释为1x FS）。然而，作者建议采用进一步的可选步骤，即在5x FS中提供默认量0.6倍的rNTPs和镁离子。随后通过优化步骤，向测试反应中加入等摩尔混合的这两种成分（称为rNTP.Mg），将其补充至优化浓度。这种部分浓度的5x FS还包含一条寡核苷酸序列，用于抑制内源性mRNA的表达（参见引言部分）。该寡核苷酸的序列为CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT。

7. 最终补充型LTE的质控与优化

注意：确定在降低的 rNTP 和镁补充裂解液中适当“补加”rNTP·Mg 所需的最少必要步骤，包括表达无融合伴侣的 eGFP 或类似荧光蛋白（例如 sfGFP）。通过向反应体系中添加 increasingly 浓度的 rNTP·Mg，以确定表达水平（以 eGFP 相对荧光单位，RFU 表示）达到稳定的临界点 通过 多功能酶标仪）进行优化。过高的rNTP·Mg浓度会导致eGFP提前终止，由于这些截短产物不具荧光性，表现为eGFP相对荧光单位（RFU）下降。然而，液相翻译表达系统（LTE）在表达较大蛋白质时，更易频繁出现短产物相关的功能异常。>50 kDa）。因此，可以使用比eGFP更大的模板进行此优化，特别是当该模板已存在于合适的表达载体中时，可为特定应用或研究提供所需的荧光蛋白融合体，用于LTE表达（参见代表性结果部分）。

1. 解冻100 µL分装样品，并设置六个10 µL的表达反应体系，每个体系包含6.2步骤中部分补充的裂解液7 µL、按表2配制的补加溶液1 µL，以及含有足够DNA对照模板的超纯水2 µL，使反应体系中DNA终浓度达到50 ng/µL。
2. 在25 °C下孵育反应体系2小时，并使用多功能酶标仪监测GFP荧光强度的增加。
   注意：GFP检测的合适配置参数为激发波长485 nm（带宽5 nm），发射波长516 nm（带宽5 nm），每1分钟读数一次，持续2小时。
3. 根据最终表达值进行排序，确定对应最高eGFP相对荧光单位（RFU）的rNTP.Mg浓度。若有动力学数据，2小时表达期间eGFP RFU呈现双相上升趋势也可提示rNTP.Mg过量（见代表性结果部分）。
4. 确定优化后的补加rNTP.Mg浓度后，将其加入后续使用该批次部分补充LTE裂解液的所有蛋白表达反应中。
   注意：若在步骤6.2中分装时精确控制体积，则可在不重新解冻的情况下将补加溶液回加至各分装样品中（例如将分装样品置于干冰上操作）。这些分装样品此时即为完全补充状态，因为在解冻并混匀用于实验时，正确的rNTP.Mg补加量将均匀混合至每个反应中。

结果

无细胞蛋白表达的目的是生产具有完整长度、正确折叠且具有活性的蛋白质，适用于多种应用。此前，LTE（Leishmania tarentolae 提取物）已与其他原核和真核无细胞表达系统进行过比较，结果表明，在最佳条件下操作时，LTE 具有较强的能力避免蛋白截短和聚集，尤其相较于基于 E. coli 的无细胞表达系统表现更优³³。然而，此前该系统存在批次间输出质量差异显著的问题。本方法通过在将 LTE 分装后初始冷冻前，对必要的补料溶液进行部分预添加，进一步改进了工艺，以确保输出质量的一致性。随后，通过优化转录所需的 rNTP·Mg 添加量，并将其配制成补充溶液，可直接用于每轮后续反应，或用于补足已冷冻的分装样品。值得注意的是，优化反应本身也代表了 LTE 在实际蛋白表达中的典型使用方式，即在 25 °C 下反应 2 小时。

通过优化无细胞反应中 rNTP·Mg 浓度所获得的数据提供了一个代表性数据集。随着转录输入（rNTP·Mg）的增加，表达水平通常上升，表明表达成功。然而，当达到某一阈值后，系统倾向于产生无功能的截短产物，尤其是在较大蛋白质（>50 kDa）的情况下。这种次优表达导致随着 rNTP·Mg 浓度升高，荧光信号减弱，这在C端荧光蛋白融合蛋白中尤为明显，因为多肽链的翻译未能延伸至荧光基团本身。对于N端融合蛋白，尽管过量的 rNTP·Mg 不一定导致整体相对荧光单位（RFU）下降，但在 SDS-PAGE 凝胶上可明显观察到多个大小递减的荧光条带，提示表达失败。该方法利用了绿色荧光蛋白（GFP）的特性，即只要样品在混合后不加热，即使在常规 SDS-PAGE 凝胶上也能保持荧光。相反，样品应直接与上样缓冲液混合后立即上样。虽然 SDS-PAGE 凝胶材料和设备通常可互换使用，但凝胶成像系统必须具备检测 GFP 荧光的能力。典型的 GFP 检测配置为：激发波长 485 nm（带宽 5 nm），发射波长 516 nm（带宽 5 nm），每分钟读取一次，持续 2 小时。

仅通过eGFP的表达来优化系统是可行的。图2A、B（插图）展示了两个LTE批次优化反应的典型表达结果，其中eGFP的相对荧光单位（RFU）随rNTP.Mg浓度的升高而增加，在+0.6x rNTP.Mg（图2A）和+0.3x rNTP.Mg（图2B）时达到最大RFU值。所用的减量rNTP补加溶液包含0.6x rNTP.Mg，从而使这两个LTE批次中rNTP.Mg的总浓度分别达到默认量的1.2x和0.9x。图2C展示了图2B中LTE批次在反应过程中RFU随时间变化的动力学曲线，显示反应呈双相特征，在整个反应过程中存在两个明显的阶段。

图 2：在 rNTP 5x FS 减量条件下优化 LTE 中 rNTP·Mg 的补加量。 （A）在无细胞表达反应中，使用对照质粒表达 140 分钟后，eGFP 在不同 rNTP·Mg 补加水平下的表达水平（n = 3，数据为均值 ± 标准差）。 （B）另一批 LTE 生产批次的优化结果，显示当 rNTP·Mg 补加量超过某一阈值后表达量下降。 （C）与（B）相同的反应体系中 eGFP 积累的动力学曲线，rNTP·Mg 补加量逐步增加。该数据也代表了 LTE 批次表达中蛋白质积累的典型动力学特征。 请点击此处查看该图的放大版本。

然而需要注意的是，eGFP 是一种较小且易于折叠的蛋白质（27 kDa），无论使用何种无细胞表达系统，都较容易实现表达、正确折叠和成熟。当表达较大的目标蛋白时，系统失败的可能性更高，且在输入蛋白大小超过 70 kDa 时，截短产物会更加明显³³。因此，使用实际目标蛋白对系统进行优化更为理想，此时仍可保留 eGFP 用于定量，但应将其作为与目标蛋白的N端融合蛋白进行表达。

图3 展示了在使用易产生截短产物的较大蛋白质模板（eGFP-Sox18）时，对rNTP·Mg补充水平进行典型优化的结果。采用半天然凝胶SDS-PAGE格式（即样品不加热），可以观察到表达逐步失败的过程。当rNTP·Mg添加量为+0.1x时（与部分补料溶液中的0.6x rNTP·Mg相结合，总量为0.7x），全长蛋白条带在总荧光表达产物中所占比例明显下降，表明过量添加rNTP·Mg会导致系统功能异常。

如方案中所述，可以跳过rNTP·Mg优化步骤，在第6.2步凝胶过滤后补充时，直接将全部量的rNTP·Mg加入“默认”补料溶液中。通过这种方式，该方案实质上回归到最初发表的LTE³⁴构建方法。然而，作者认为，如图3（从泳道D到泳道E）所示，对系统进行优化以实现最佳性能，其优势超过了额外增加的方案复杂性，并提升了LTE作为蛋白质表达工具的价值。

图3：在部分补充的LTE体系中增加rNTP.Mg补加量对eGFP-Sox18表达的影响。 本图显示通过半天然SDS-PAGE凝胶分析rNTP.Mg补加量增加对eGFP-Sox18表达的影响。泳道A：+0.1x (rNTP.Mg)补加，泳道B：+0.2x (rNTP.Mg)，泳道C：+0.3x (rNTP.Mg)，泳道D：+0.4x (rNTP.Mg)。通过凝胶荧光扫描检测N端eGFP融合蛋白的表达情况。泳道A中的主条带代表全长eGFP-Sox18蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	储存浓度	5x 喂养溶液	每毫升 5x 喂养溶液所需储存液的微升数
		默认值（降低的 rNTP）	默认值（降低的 rNTP）
Spermidine	100 mM	1.25 mM	12
DTT	500 mM	10 mM	20
Creatine Phosphate	1000 mM	200 mM	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 mM	100 mM	40
PEG3000	0.5 v/v	0.05 v/v	100
Protease Inhibitor Cocktail	120x	5x	43
氨基酸	3.6 mM (每种)	0.68 mM (每种)	190
ATP	100 mM	8.5 (5.1) mM	85 (51)
GTP	100 mM	3.2 (1.9) mM	32 (19)
UTP	100 mM	2.5 (1.5) mM	25 (15)
CTP	100 mM	2.5 (1.5) mM	25 (15)
Mg(OAc)2	1M	16.7 (10) mM	16.7 (10)
Anti-splice leader oligo	1mM	0.05 mM	50
T7 RNA polymerase	5 mg/mL	0.5 mg/mL	100
Creatine Phosphokinase	5 units/µL	0.2 units/µL	42
超纯水			19 (93)

表1：LTE用5倍浓缩补料溶液（5x FS）的组成。 每2.5 mL凝胶过滤后的未补充裂解液需要1 mL的5x FS。使用默认配方的5x FS进行补充后，可制得适用于表达反应的即用型LTE，使用比例为7 µL/10 µL。推荐用于LTE表达优化的降低浓度rNTP·Mg配方（斜体表示的用量）含有默认浓度0.6倍的rNTPs和镁。在后续优化实验中，可根据表2中列出的添加方案将这些组分调整至不同浓度水平（0.6至1.1倍）。

rNTP 补充液	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 M)	超纯水
(每 10 µL 反应体系加入 1 µL)	µL/200 µL	µL/200 µL	µL/200 µL	µL/200 µL	µL/200 µL
+0x	0	0	0	0	0	200
+0.1x	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0.2x	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0.3x	10.2	3.8	3	3	2	178
+0.4x	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0.5x	17	6.4	5	5	3.3	163

表2：用于LTE优化的（rNTP.Mg）补加溶液组成。 这些溶液通过每10 µL蛋白质表达反应添加1 µL补加溶液来优化LTE。一旦在优化实验中确定了补加量，即可在后续所有使用相同LTE批次分装样品的蛋白质表达反应中一致地添加该补加量。或者，也可直接将补加溶液以每7 µL分装样品添加1 µL的方式加入分装样品中（无需解冻）。解冻并混匀后，每10 µL蛋白质表达反应使用8 µL LTE，以维持优化过程中确定的rNTP.Mg补加水平。

讨论

过去十年中已发表多种构建LTE的方案⁷，并经历了周期性的更新^25,34。然而，初学者在采用该技术时常面临陡峭的学习曲线，导致难以快速实现高质量、高产量的蛋白质表达。其他从事LTE研究的课题组也报告了类似的挑战³⁵，尤其是批次间存在显著差异的问题。基于视频的方案形式可能提供额外的、不易察觉的实验设置细节，有助于潜在用户更好地掌握技术要点³⁴。本文对原有方案进行了多项改进，旨在提高实验成功率、简化操作流程、缩短耗时，并减少因操作复杂性导致的错误。

在细胞破碎过程中，精确控制将细胞加载到氮气空化细胞破碎仪中的操作至关重要³⁴。由于细胞浓缩和洗涤后细胞密度较高，实现这一控制可能具有挑战性。在原始方案中，曾采用多种方法，例如离心少量最终浓缩的培养物并测定细胞沉淀所占比例。然而，在本方案中采用了一种更简便的方法。通过测量收获培养物的体积和 OD_600nm，利用这些测量值计算出目标细胞浓缩液体积（以毫升为单位），旨在达到目标终浓度 OD_600nm = 300。该计算假设在洗涤过程中无显著的细胞损失。如果怀疑存在细胞损失，则采用另一种方法：对洗涤后的浓缩细胞进行三次重复的1/10倍系列稀释，最终获得1/1000倍稀释液。由此可测定浓缩液实际的 OD_600nm，确保在将其装入破碎仪前达到目标 OD_600nm = 300。

即使严格控制细胞破碎仪的加样量，破碎后裂解液的蛋白质含量仍可能存在显著差异，如吸光度（Abs）所示。_{280 nm} 未添加补充物的凝胶过滤裂解液³⁴因此，需测定吸光度（Abs）_{280 nm} 在加入裂解液补充物之前，将裂解液稀释以达到指定的吸光度（Abs）_{280 nm} 60. 由于蛋白质表达反应最终包含0.5 v/v的裂解液，这将得到标准化的反应裂解液，其吸光度为Abs_{280 nm} = 30. 裂解液性能配置低于吸光度值_{280 nm} 30 时，往往产生持续时间长但表达水平低的反应，而高于 Abs_{280 nm} 30 时往往能获得更高的表达量，但目标蛋白聚集的倾向也会增加。

裂解液性能优化涉及调整补充到裂解液中的喂养溶液中的转录输入成分，特别是在可选的反应步骤7.0-7.3中调整rNTP和镁的含量。需要注意的是，在像LTE²⁵这样的偶联转录-翻译系统中，rNTP和镁具有复杂且多重的作用。然而，研究表明，LTE系统的镁浓度表达最优点大约为rNTP（mM）+ 1.5。由于裂解液本身会向最终反应体系贡献1.5 mM的Mg，因此可以通过等摩尔调整rNTP与Mg的比例，简便地调节和优化rNTP的输入，而无需同时对Mg进行协同优化。

当增加rNTP·Mg浓度时，裂解液的性能表现出显著差异，蛋白表达水平通常随其增加而上升，直至达到某一阈值；超过该阈值后，优化效果发生逆转，导致表达异常，产生短截产物而非全长蛋白²⁵。因此，对系统进行最终优化以确定该阈值是有益的。原始的LTE方案采用固定的补料溶液配方，并建议进行一定程度的镁离子优化³⁴。此后该方法被进一步改进，引入了更全面的rNTP优化策略。然而，该方法要求将未添加补料溶液的裂解液迅速冷冻，以便在分装样品上进行优化，但这种操作往往导致裂解液最终的表达水平下降。这种下降被认为是在凝胶过滤步骤后立即对未补充补料溶液的裂解液进行速冻时，丧失了补料溶液中所含的冷冻保护作用所致。当前方案通过在冷冻前预先加入含有较低浓度rNTP·Mg的补料溶液，实现了平衡，随后在表达时再补充至优化浓度。

这些实验方案的改进有望通过减少主要的变异来源并提高蛋白质表达结果的一致性，从而增强LTE系统对新手用户的实用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PD-10 SuperDex 25 层析柱	Cytiva	17085101	凝胶过滤层析柱
氮气破碎细胞仪	Parr Industries	4635 或 4639	细胞破碎仪
牛源血红素	Sigma-Aldrich	H5533	培养添加剂
青霉素/链霉素 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	抗生素混合液
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	适用于 10 µl 表达反应的多孔板
寡核苷酸	IDT 合成		序列 CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT 的寡核苷酸
磷酸肌酸激酶	Sigma-Aldrich	9001-15-4	酶
Tecan Spark	Tecan		或类似多功能酶标仪
Chemidoc MP 成像系统	Biorad		或类似的 SDS-PAGE 凝胶成像系统
4-12% Bis-Tris 凝胶	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE 凝胶
Biophotometer	Eppendorf		或类似的比色皿分光光度计
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop 分光光度计
Avanti JXN-26 离心机	Beckman Coulter		或类似的离心机，配备可耐受 10,000 ×g 和 50,000 ×g 的转子和离心管
5424R 微型离心机	Eppendorf		或类似的微型离心机，配备 1.5 ml 微量离心管
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		或类似的适用于 5 L 三角瓶的培养摇床
5 L 玻璃培养瓶			带挡板的玻璃培养瓶，用于培养扩增
胰蛋白胨	BD	211705	生长培养基组分
酵母提取物	Merck	VM930053	生长培养基组分
甘油			任意分析纯级别
葡萄糖			任意分析纯级别
KH2PO4			任意分析纯级别
K2HPO4			任意分析纯级别
UltraPure 水	Invitrogen	10977-015	或任意 MilliQ 类型纯水系统的出水