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一次推拿干预后24小时内神经损伤大鼠疼痛变化特征

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DOI：

10.3791/65593

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2024年1月26日

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1School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Beijing Hospital

本文内容

摘要

我们介绍了一种利用推拿手法模拟器对轻度慢性缩窄性损伤大鼠实施“三法三穴”推拿治疗的实验方案，并通过行为学分析及酶联免疫吸附测定检测炎症因子表达的变化，以评估推拿在24小时内产生镇痛效果的有效时间点。

摘要

推拿作为中医的一种外治法，已在临床和基础研究中被证实对周围神经病理性疼痛（pNP）具有镇痛作用。然而，推拿镇痛效果的最佳时间点可能因不同的损伤感觉而异，这会影响对推拿镇痛起始机制的探索。

该研究采用轻度慢性压迫损伤（minor CCI）模型大鼠模拟神经病理性疼痛（pNP），并利用智能推拿手法模拟器模拟三种推拿手法（点按、拨法和揉法）以及三个穴位（殷门BL37、承山BL57和阳陵泉GB34）进行推拿治疗。通过检测冷敏感阈值（CST）、机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL），评估minor CCI模型大鼠在24小时内疼痛的变化及推拿镇痛效果的最佳时间点。此外，研究通过ELISA检测评估IL-10和TNF-α的表达变化。结果表明，推拿具有即时性和持续性的镇痛作用。对于CST、MWT、TWL这三种不同的损伤敏感性指标，以及IL-10和TNF-α两种细胞因子，推拿干预后24小时内的镇痛效果在不同时间点存在显著差异。

引言

周围神经病理性疼痛（pNP）是指由周围躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的疼痛，表现为一系列症状和体征，其中痛觉过敏是主要症状之一1,2。痛觉过敏是指有害刺激（包括针刺、冷刺激和热刺激）引发的疼痛感受增强3。多项大规模流行病学研究显示，pNP在神经病理性疼痛中最常见，患病率为6.9%-10%4。pNP可由多种疾病引起，包括神经损伤、带状疱疹后神经痛、疼痛性糖尿病多发性神经病变、多发性硬化、脑卒中、癌症等5。目前，治疗pNP的主要方法是药物治疗，但疗效并不理想，且副作用显著，这是造成个人和社会经济负担较高的主要原因6。

推拿是中医一种绿色、经济、安全且有效的外治方法7。大量临床研究已证实推拿对神经病理性疼痛（pNP）具有镇痛作用，基础研究也验证了推拿具有即时性和累积性镇痛效应8,9。推拿主要的累积性镇痛机制是降低炎症因子水平，并抑制胶质细胞的活化10,11。既往研究已确认推拿的累积性镇痛效果，并发现坐骨神经损伤大鼠在接受20次推拿治疗后，其背根神经节（DRG）和脊髓背角（SDH）中存在差异表达基因（DEGs），这些基因主要与蛋白质结合、压力应答及神经元投射相关12。近期研究表明，推拿具有即时镇痛效应，单次推拿干预即可缓解轻度CCI大鼠的痛觉过敏，尤其对热痛觉过敏的缓解效果更为显著13。然而，推拿镇痛效应的最佳时间点可能因伤害性刺激类型（冷、热、机械）的不同而有所差异，这影响了对推拿镇痛起始机制的深入探索。

炎症介质可致敏并激活痛觉感受器，导致放电阈值降低和异位放电，从而促进外周敏化14,15。外周神经损伤后，TNF-α 是炎症反应的启动因子，可促进 IL-10 和 IL-1β 等炎症因子的合成，引起直接的组织炎症性损伤，刺激局部神经末梢，导致疼痛16,17,18。推拿可通过降低 TNF-α、IL-10、IL-6 和 IL-1β 等炎症因子的表达水平实现镇痛作用19,20,21。本研究选用轻度 CCI 模型大鼠模拟临床神经病理性疼痛（pNP），在一次推拿干预后，选取不同时间点，通过冷敏感阈值（CST）、机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）进行冷、热及机械刺激疼痛的行为学检测，并采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中 IL-10 和 TNF-α 的含量，以筛选推拿镇痛效应显著的时间点，为后续研究推拿镇痛起始机制提供依据。

方案

北京中医药大学动物保护与使用委员会（BUCM-4-2022082605-3043）批准了本研究中使用的所有实验程序。

1. 动物与研究设计

  1. 取49只8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为200 ± 10 g。
  2. 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（n = 7）、模型组（n = 7）、推拿后即刻组（n = 7）、推拿后6 h组（n = 7）、推拿后12 h组（n = 7）、推拿后18 h组（n = 7）和推拿后24 h组（n = 7）。

2. 建立轻度 CCI 大鼠模型（图1）

注意：轻度慢性脑缺血（CCI）的建模方法如先前研究所述22,23,24。

  1. 让SD大鼠适应性喂养7天。造模前禁食2-3小时。
  2. 将大鼠置于含有3-5%异氟烷的麻醉箱中，通过麻醉机进行麻醉。麻醉后，于双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。
  3. 将大鼠俯卧位固定于操作台，剃除右侧髋关节区域的毛发，并用碘伏对该区域进行消毒（图1B）。
  4. 通过夹捏足趾确认麻醉深度。沿坐骨神经走行方向做长约0.5-1 cm的皮肤切口，钝性分离肌层，充分暴露梨状肌下缘（图1C）。
  5. 用可吸收铬制肠线（4-0型号）在不阻断神经外血管血流的前提下，松散地环绕结扎神经。假手术组大鼠仅暴露坐骨神经3分钟，不进行结扎（图1A、D、E）。
  6. 使用无针头注射器向坐骨神经滴加1滴0.9%氯化钠溶液，以助复位。逐层缝合，给予适量阿莫西林粉等抗炎药物，肌层缝合1针，皮肤缝合2针（图1F）。
    注意：从步骤2.3至2.6，持续向大鼠口鼻部位通入2%-3%异氟烷以维持麻醉状态。
  7. 保持大鼠体温，待其苏醒后送回饲养室。

3. 智能推拿手法模拟器干预（图2）

注意：治疗从第7天开始th 模型建立后的第二天。

  1. 在计算机操作界面上将仪器参数调节至刺激力4 N、刺激频率60次/分钟、温度36 °C。将大鼠置于大鼠固定器中，暴露后肢穴位位置。图2A，自制设备，专利号 ZL 2023 20511277.5）25.
  2. 启动仪器以执行点压、弹拨和揉捏手法（表1）。点击 点按、弹拨，以及 揉捏 显示在计算机屏幕上，依次作用于殷门（BL37）、承山（BL57）和阳陵泉（GB34）穴位表 2在推拿组大鼠的模型侧（图2B，C)26.
    1. 对于推拿组，每天进行一次干预，共干预1天，施加4 N的力，频率为60次/分钟，每种方法每个穴位持续9分钟。
    2. 对假手术组和模型组进行束缚，每次9分钟，次数与推拿组相同。

4. 行为学测量

注意：在干预后，分别对5个推拿亚组、模型组和假手术组进行冷觉敏感阈值（CST）、机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）的检测。模型组和假手术组的检测时间与推拿组相同（即24 h）。

  1. 冷敏感阈值（CST）
    1. 将大鼠置于智能冷热板疼痛检测仪上，调节板面温度为 4 ± 1 °C（点击 START > SET），并用透明塑料笼罩住大鼠。
    2. 观察大鼠探索性活动 5 分钟，直至其适应透明塑料笼环境。
    3. 随后 5 分钟内，观察并记录手术侧后肢足部抬举次数。
      注意：因大鼠活动或姿势改变引起的足部抬举不计入统计。
  2. 机械缩足阈值（MWT）
    1. 测试前将大鼠置于底部为网格（0.5 cm × 0.5 cm）的测试箱中，适应 15–30 分钟。
    2. 将疼痛测试仪（EVF 5 型）探针移至大鼠右侧后足底区域中心，手动线性增加压力，当大鼠出现抬足或舔足反应时，记录仪器屏幕上显示的阈值。连续测量 5 次，每次间隔 10 分钟。
  3. 热缩足潜伏期（TWL）
    1. 将大鼠放入底部为玻璃材质的测试箱中，测试开始前使其适应 15 分钟。
      注意：使用热刺激疼痛仪（PL200 型）检测热缩足反射潜伏期。
    2. 设置参数：最大测试时间为 30 秒，强度为 50%。点击 START 和方向按钮。
    3. 将红外探针移至大鼠右侧后足底区域中心，开始检测。
    4. 记录大鼠抬足并舔足时的缩足反射潜伏期。连续测量 5 次，每次间隔 10 分钟。

5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

  1. 在行为学测试后，以每100克体重35 mL的4%水合氯醛剂量进行腹腔注射麻醉。沿大鼠腹部正中纵向切开皮肤和肌肉，暴露其内脏器官。
  2. 使用持针器进行纯分离操作，辨认腹主动脉，采集新鲜血液并留取样本用于检测。使用分离管分离血清。血清样本可立即检测，或单独分装后于-80 °C冰箱中保存。
    注意：分离前需将血液样本静置凝固30分钟。
  3. 将大鼠血清样本置于室温（RT）环境中至少30分钟，以准备后续检测。
  4. 为待测样本设置空白孔和标准品孔。向酶标板中各标准品孔加入总量为50 µL的标准品溶液；在待测样本孔中，先加入40 µL稀释液，再加入10 µL样本。
    注意：加样时应将液体直接加至酶标孔底部，尽量避免接触孔壁，并轻轻振荡混匀。空白孔不加样本及酶标试剂，其余操作步骤相同。样本最终稀释倍数为5倍。
  5. 用封板膜密封酶标板后，置于37 °C恒温培养箱中孵育30分钟。
  6. 用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释30倍，备用。
  7. 撕去封板膜，弃去孔内液体，甩干。每孔加入洗涤液，静置30秒后弃去，重复此步骤5次，最后彻底甩干。
  8. 每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（100 µL/孔）。
  9. 每孔先加入显色剂A 50 µL，再加入显色剂B 50 µL，轻轻振荡混匀，于37 °C避光环境中反应10分钟。
  10. 每孔加入终止液50 µL，终止反应。
    注意：此时溶液颜色由蓝色变为黄色。
  11. 以空白孔调零，在450 nm波长下依次测定各孔的光密度（OD值）。

结果

CST: 与模型组相比，推拿后6 h组的抬足次数显著减少，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与假手术组相比，模型组的抬足次数显著增加，差异具有统计学意义（P < 0.05) (表3, 图3).

机械痛阈（MWT）：与模型组相比，除推拿后18小时外，各推拿亚组的MWT均显著高于模型组，且推拿后24小时的MWT显著高于模型组，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与假手术组相比，模型组的MWT显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）（表3，图4）。

经皮水分丢失（TWL）：
与模型组相比，推拿后即刻、推拿后6 h及推拿后18 h均显著升高，差异具有统计学意义。与假手术组相比，模型组显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）（表3，图5）

ELISA
IL-10： 与模型组相比，推拿干预后6 h和24 h IL-10水平显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）（表4，图6）。

TNF-α：与模型组相比，推拿后即刻（**P < 0.01）、推拿后6 h（**P < 0.01）和推拿后24 h（**P < 0.05）均显著降低，差异具有统计学意义（表4，图6）

伤口愈合过程、动物皮肤外科缝合、实验流程、兽医研究。
图 1：轻度坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）大鼠模型的建立。（A）铬制肠线（4-0）。（B）皮肤准备。（C）切口。（D）暴露坐骨神经。（E）在神经周围结扎可吸收铬制肠线（4-0 型）。（F）缝合肌肉层和皮肤。请点击此处查看该图的放大版本。

机器人辅助大鼠推拿按摩；显示机械装置设置和穴位位置的示意图。
图 2：智能推拿手法模拟仪治疗示意图。 （A）智能推拿手法模拟仪（专利号：ZL ZL 2023 20511277.5）。（B）殷门（BL37）、承山（BL57）和阳陵泉（GB34）穴位的位置。（C）刺激殷门穴（BL37）。请点击此处查看该图的放大版本。

各组大鼠冷敏感阈值（CST）随时间变化的柱状图；假手术组与模型组比较；标注统计学显著性。
图3：各组大鼠冷敏感阈值（CST）检测结果。 *P < 0.05，与模型组比较；#P < 0.05，与假手术组比较。 请点击此处查看该图的高清版本。

不同时间点和条件下机械缩足阈值（MWT）的柱状图比较。
图4：各组大鼠机械缩足阈值（MWT）的结果。 *P <0.05，与模型组比较；#P < 0.05，与假手术组比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

比较假手术组与模型组在多个时间点的TML(s)柱状图；治疗效果的数据分析。
图5：各组大鼠热缩足潜伏期（TWL）结果。 *P < 0.05，**P < 0.01，与模型组比较；#P < 0.05，##P < 0.01，与假手术组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

时间进程图；TNF-α、IL-10 细胞因子水平以 pg/mL 为单位测定；统计分析结果。
图6：各组大鼠血清中 IL-10 和 TNF-α 水平的变化（均值 ± 标准差，n = 7），“*P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

三种方法方法分类功能
点按法温通温经通络
弹拨法放松作用于神经干，治疗四肢麻木或疼痛
揉捏法放松缓解肌肉痉挛

表1：三种刺激方法。

三穴位穴位经络神经肌肉
殷门 (BL37)足太阳膀胱经坐骨神经主干股二头肌
承山 (BL57)胫神经腓肠肌
阳陵泉 (GB34)足少阳胆经腓总神经胫前肌

表2：本研究中使用的三个穴位。

假手术组模型组推拿组
0 小时6 小时12 小时18 小时24 小时
CST12.8 ± 2.3825 ± 5.15#19.6 ± 10.9913.2 ± 2.49*16.4 ± 8.4117 ± 5.5719 ± 8.34
MWT69.47 ± 10.3540.63 ± 9.65##44.19 ± 10.7246.58 ± 9.4742.83 ± 11.4140.1 ± 5.5948.33 ± 8.7*
TWL12.06 ± 3.458.16 ± 2.09##12.09 ± 3.86**10.07 ± 2.7*9.44 ± 2.5210.42 ± 2.49**9.72 ± 2.29

表3：各组大鼠的CST、MWT和TWL结果（均值 ± 标准差，n = 7）。*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；#P<0.05，##P<0.01，与假手术组比较。

假手术组模型组推拿组
0 小时6 小时12 小时18 小时24 小时
IL-1055.10 ± 1.37**70.27 ± 6.2267.28 ± 1.2861.41 ± 3.36**67.98 ± 1.8569.03 ± 6.2957.16 ± 1.30**
TNF-α311.52 ± 13.45**339.33 ± 24.50309.47 ± 8.37**309.99 ± 14.95**334.62 ± 21.85319.22 ± 10.38316.24 ± 8.72*

表4：各组大鼠血清IL-10和TNF-α水平的变化（均值 ± 标准差，n = 7，pg/mL）。*P < 0.05，**P < 0.01，与模型组比较（*P < 0.05，**P < 0.01）。

讨论

该研究采用轻度坐骨神经慢性压迫（minor CCI）模型，模拟临床坐骨神经损伤引起的神经病理性疼痛（pNP）。轻度CCI模型通过结扎对神经干造成持续性慢性压迫和束缚，结扎线逐渐膨胀，导致坐骨神经内部水肿，并在3至5天内形成稳定的慢性疼痛。27,28在初步研究中，研究团队发现，与经典模型组相比，轻度 CCI 模型组在第 7 天时更为稳定th 造模后一天，更适合短期实验设计，因此我们选择该时间点进行推拿干预。

先前的研究已证实，使用智能推拿手法模拟器（动物）对坐骨神经损伤大鼠进行20次推拿治疗后，可有效缓解其疼痛症状 "三法三穴"29,30,31此外，该研究团队发现，一次推拿即可有效缓解轻度坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）大鼠的疼痛过敏症状，尤其是热痛觉过敏。13本研究采用点压法、弹拨法和揉捏法作为三种治疗手法。点压法是一种温通手法，具有温经通络的功能。弹拨法是一种放松手法，作用于神经干，可治疗四肢麻木或疼痛。揉捏法是一种放松手法，能够缓解肌肉痉挛，消除疲劳，减轻损伤部位的疼痛。 (表1）。本研究选取阴陵泉（GB34）、承山（BL57）和阳陵泉（GB34）作为治疗的三个穴位（表2）。根据针灸学中循经取穴和局部取穴的原则，所选三个穴位属于足太阳膀胱经和足少阳胆经。根据解剖学神经定位，殷门（BL37）位于坐骨神经及其分支分布区域，承山（BL57）位于胫神经分布区域，阳陵泉（GB34）位于腓总神经分布区域。根据解剖学肌肉定位，这三个穴位分别位于股二头肌、腓肠肌和胫前肌周围。表 2因此，通过三种方法和三个穴位的干预，可刺激穴位-神经-肌肉的相关区域。本研究在建立稳定的慢性疼痛模型并进行一次推拿干预后，检测了疼痛相关的行为学变化，进一步验证了推拿具有即时镇痛效应，并对不同伤害性感受器具有不同的治疗意义时间点，为下一步研究推拿镇痛启动机制提供了治疗学支持。

本研究采用冷板试验（CST）、机械痛阈（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）作为指标，探讨推拿对不同损伤感觉的疗效。pNP中诱发性疼痛的临床表现主要包括痛觉过敏和触诱发痛，即冷热刺激诱发的疼痛和机械性触觉诱发的疼痛4。目前，针对这两种疼痛感觉的经典定量行为学研究指标为CST、MWT和TWL。在CST检测中，本实验所使用的ZH-6C型智能冷热板疼痛测试仪通过冷板试验进行测量，具有相对客观、受环境因素干扰小、温度恒定且精度高的特点32,33。在基础研究中，通常使用Von Frey纤维丝测定MWT，这是评估神经病理性疼痛的经典指标之一，主要用于评估机械刺激诱发的针刺样疼痛，以反映啮齿类动物机械性触诱发痛的情况34,35。Hargreaves试验则利用热痛刺激仪检测和评估啮齿类动物对热痛敏感性的反应，用于观察神经损伤后热痛敏感性或热痛反应的恢复情况，判断动物后肢是否因热刺激产生缩足反应。仪器通过检测动物后肢的运动36，控制器将自动关闭红外线并停止计时34，该时间即为TWL。实验表明，轻度CCI模型大鼠对TWL的敏感性最佳38。因此，本次对轻度CCI模型大鼠行为学的定量研究方法，采用冷板实验、电子机械刺痛仪和热刺痛仪进行检测。

早期推拿干预对不同伤害性感觉的治疗效应在显著时间点上存在差异。目前，推拿镇痛的临床疗效及其作用机制已开展初步探索。既往研究主要聚焦于一定疗程推拿后的镇痛机制。近2年来，研究逐步转向推拿初期阶段的镇痛机制，以探讨推拿镇痛是如何启动的。本研究采用"三种手法、三个穴位"对轻度坐骨神经慢性压迫（CCI）模型大鼠进行一次干预，随后选取5个时间点进行冷刺激阈值（CST）、机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）检测，观察轻度CCI模型大鼠温度觉及机械触觉的变化。本研究在行为学检测后采用ELISA法检测大鼠血清中IL-10和TNF-α水平的变化。结果显示，一次推拿干预后，与模型组相比，各项指标均立即改善，再次证实了推拿具有即时镇痛效应。然而，对于不同类型的疼痛感觉，其镇痛效应达到显著的时间点并不相同：在CST方面，推拿后6 h出现统计学差异；在MWT方面，推拿后24 h出现统计学差异；在TWL方面，推拿后6 h即出现显著统计学差异，且在干预后即刻及18 h均表现出显著的统计学差异；在血清IL-10水平方面，推拿后6 h和24 h均显著降低，差异具有统计学意义；在血清TNF-α水平方面，推拿后即刻、6 h及24 h均显著降低，差异具有统计学意义。结果提示，推拿镇痛效应虽可持续，但对于冷刺激诱发性疼痛和机械触觉诱发性疼痛，其疗效显著的时间点存在明显延迟；而对于热刺激诱发性疼痛，推拿则具有即时效应，且疗效更为显著且持久。本实验室正在进一步探究瞬时受体电位（TRP）相关蛋白与基因，以及与冷、热、机械敏感性相关的其他基因和TGF-β、IL-6等炎症因子的变化，以深入揭示推拿镇痛的启动机制。

综上所述，根据本研究的结果可以推断，推拿可能影响的蛋白质或通路发挥作用的时间点可能不同，从而导致镇痛效果显著的时间点也不同。需要进一步深入研究以探索推拿镇痛的启动机制，并为推拿临床疗效研究提供依据。

披露

作者声明不存在任何利益冲突，包括财务或其他方面的利益冲突。

致谢

作者的研究、撰写和发表本文工作得到了国家自然科学基金（编号：82074573 和 82274675）以及北京市自然科学基金（编号：7232278）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉机Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaR500动物呼吸麻醉相关设备
铬制肠线缝合线山东博达医疗用品股份有限公司，中国BD210903一种主要由健康幼山羊肠壁胶原蛋白加工制成的可吸收外科缝合线
电子Von Frey仪Bioseb, USABIO-EVF5用于检测机械缩足阈值的仪器
智能冷热板痛觉测定仪安徽正华生物仪器设备有限公司，中国ZH-6C用于检测冷敏感阈值的仪器
异氟烷Ruiwode Life Technology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaR510-22-10一种麻醉剂
多功能全波长酶标仪分子 Devices (上海) 有限公司SpectraMax M2用于检测光密度（OD）的仪器
热痛觉测定仪成都泰盟软件有限公司，中国PL-200用于检测热刺激缩足潜伏期的仪器

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