勘误：通过切除眼柄促进泥蟹卵巢成熟

摘要

已发布更正：  通过切除眼柄促进泥蟹卵巢成熟。引言、实验方案、讨论和参考文献部分均已 更新。

摘要

已发布更正： 通过切除眼柄促进泥蟹卵巢成熟。引言、实验方案、讨论和参考文献部分已 更新。

第四句话在 引言部分的第三段已更新为：

本研究中的眼柄切除方案通过使用完全镇静的螃蟹，最大限度地减少了螃蟹的应激反应，同时降低了螃蟹咬伤对操作人员造成的物理伤害。 

至：

本研究中的眼柄切除方案通过使用完全麻醉的螃蟹，最大限度地减少了螃蟹的应激反应，同时降低了螃蟹咬伤对操作人员造成的物理伤害。 

方案的起始部分已从以下内容更新：

本方案遵循马来西亚实验动物科学协会（Laboratory Animal Science Association of Malaysia）发布的《用于科学目的动物的护理与使用马来西亚规范》。实验样本的处死操作依据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH Publications No. 8023，1978年修订版）进行。性未成熟的雌性泥蟹（橙色泥蟹 S. olivacea）采自马来西亚实兆远湿地（5°66′62′′N, 102°72′33′′E）的当地市场。泥蟹物种根据形态学特征进行鉴定¹。

至：

本方案遵循马来西亚实验动物科学协会（Laboratory Animal Science Association of Malaysia）发布的《实验用途动物护理与使用马来西亚规范》，并已获得马来西亚登嘉楼大学研究伦理委员会批准（动物伦理批准编号：UMT/JKEPHMK/2023/96）。实验样本的处死操作依据《动物安乐死美国兽医医学协会指南：2020年版》进行。性未成熟雌性泥蟹（橙色泥蟹 Scylla olivacea）采自马来西亚登嘉楼州实兆远湿地（Setiu Wetlands）当地市场（北纬5°66′62′′，东经102°72′33′′）。泥蟹物种的鉴定基于形态学特征¹。

方案的第4部分已从以下内容更新：

4. 冷休克麻醉

1. 选择性成熟的雌性个体，其腹部的深色椭圆形腹板的甲壳宽（CW）>86 mm（图1）。
2. 使用抄网捕获螃蟹，并将其单独放置于小型水族箱中进行低温休克麻醉。
3. 在透明塑料水族箱中准备2 L温度为4 °C至1 °C的海水（20 ppt），使用（−20 °C）冰袋维持温度以实现冷休克麻醉。
   注意：使用数字温度计监测水温。
4. 将螃蟹浸入4 °C海水中直至其进入镇静状态（约3−5分钟）。
5. 通过观察螃蟹是否缺乏自发运动来确认其已完全麻醉。用镊子触碰时，其步足和螯足关节仍可能出现轻微活动。

至：

4. 麻醉

1. 选择性成熟雌性个体，其腹部瓣膜呈深色椭圆形，头胸甲宽度（CW）>86 mm（图1）。
2. 使用抄网捕获螃蟹，并将其单独置于小型水族箱中以进行麻醉。
3. 经过5分钟的适应期后，向每个水族箱中加入浓度为2 mL/L的2-苯氧基乙醇（2-PE），进行15分钟的麻醉处理。
4. 通过观察螃蟹是否缺乏自发运动来确认其已完全麻醉。

方案的第5节已从以下内容更新：

5. 眼柄切除

1. 烧灼技术
   1. 所有操作均应在台面上并在开放区域进行。
   2. 取一根带木柄或塑料手柄的平头镍钢金属棒（例如螺丝刀），并将手柄部分用湿棉布包裹。
   3. 将两把不锈钢手术镊在高压灭菌器中灭菌。
   4. 准备一个装有70%乙醇的喷雾瓶，并备好纸巾以供使用。
      注意：乙醇高度易燃，请远离火源。
   5. 将喷灯安全连接至燃气罐（丁烷）。
      警告：请遵循喷灯和燃气罐上的使用说明。连接燃气罐时，务必确保喷灯处于关闭状态。仔细阅读并遵守燃气罐上注明的所有防火安全事项。
   6. 佩戴厚棉手套，以防被高温物体烫伤。
   7. 将金属棒的尖端置于喷灯火焰中加热，直至金属棒呈现明亮的红色。
   8. 用湿棉布覆盖已麻醉（镇静）的螃蟹。
      注意：应覆盖螃蟹的所有触手，以避免不必要的损伤。
   9. 用已灭菌的镊子夹住螃蟹的一只眼睛。
      注意：首次使用时，需将镊子在高压灭菌器中灭菌；后续对其他螃蟹操作时，可用70%乙醇进行消毒。
   10. 将烧至通红的金属平头端压在螃蟹的眼睛上，轻微施压约10−15秒，直至眼柄变为橙色或红橙色。
       注意：采用烧灼法进行眼柄消融时需要两人配合：一人固定螃蟹，另一人执行消融操作。
   11. 使用70%乙醇喷雾对镊子进行消毒，以确保螃蟹之间无交叉污染。
   12. 在完成所有螃蟹的眼柄消融后，将灼热的镍钢金属棒（螺丝刀）浸入自来水中冷却。
   13. 重复使用前应对毛巾进行消毒，可准备多块毛巾以节省时间。
       注意：先用自来水清洗毛巾，然后将其浸入30 ppm的含氯水中5分钟，再用自来水再次冲洗，最后浸入1 g/L硫代硫酸钠溶液中。
   14. 关闭喷灯后将其放置于安全位置，并等待其冷却至环境温度（约30分钟）后再行拆卸。
2. 手术 技术
   1. 在通风良好的环境中进行操作。
   2. 将两把手术剪刀和镊子在高压灭菌器中灭菌。
   3. 将50 mL 70%乙醇倒入100 mL玻璃烧杯中。
   4. 在滴瓶中准备好碘酊溶液。
      注意：碘酊（又称碘酒或弱碘溶液）由2%–7%的单质碘及碘化钾或碘化钠溶于乙醇和水制成。
   5. 佩戴厚棉手套。
   6. 握住已镇静的螃蟹，并用湿棉布覆盖其身体。
   7. 用已灭菌的镊子夹住螃蟹的一只眼睛。
   8. 迅速使用已灭菌的手术剪剪除眼柄。
      注意：螃蟹伤口处可能会流失血淋巴。
   9. 每次使用后，将剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒，并用纸巾擦干后方可再次使用。
   10. 剪除眼柄后，立即在伤口处滴加2至3滴碘酊。
       注意：碘酊用于促进愈合并预防感染。

至：

5. 眼柄消融

1. 烧灼技术
   1. 所有操作均应在桌面上并在开放区域进行。
   2. 取一根带木柄或塑料手柄的平头镍钢金属棒（例如螺丝刀），并将手柄部分用湿棉布包裹。
   3. 将两把不锈钢手术镊在高压灭菌器中灭菌。
   4. 准备一个装有70%乙醇的喷雾瓶，并将其远离任何与火源相关的设备，如喷灯和烧红的螺丝刀。准备好纸巾以备使用。
      注意：乙醇高度易燃。应与火源保持安全距离。
   5. 将喷灯牢固连接至燃气罐（丁烷）。
      警告：请遵循喷灯和燃气罐上的说明。连接燃气罐时，务必确保喷灯处于关闭状态。仔细阅读并遵守燃气罐上注明的所有防火安全注意事项。
   6. 佩戴厚棉手套，以防被高温物体烫伤。
   7. 将金属棒的尖端置于喷灯火焰中加热，直至金属棒变为亮红色。
   8. 用湿棉布覆盖已麻醉的 螃蟹。
      注意：应覆盖螃蟹的触角，以避免不必要的损伤。
   9. 用已灭菌的镊子夹住螃蟹的一只眼睛。
      注意：首次使用时，需将镊子在高压灭菌器中灭菌；后续对其他螃蟹操作时，可用70%乙醇进行消毒。
   10. 将烧红的金属平头端压在螃蟹的眼睛上，轻轻按压约10−15秒，直至眼柄变为橙色或红橙色。操作时需小心，避免损伤周围结构。 
       注意：采用烧灼法进行眼柄消融时需要两人配合：一人固定螃蟹，另一人执行消融操作。
   11. 使用70%乙醇喷雾对镊子进行消毒，以确保螃蟹之间无交叉污染。
       注意：眼柄消融操作完成后，至少等待5分钟，待镊子冷却后再用70%乙醇消毒，以防引发火灾危险。
   12. 完成所有螃蟹的眼柄消融后，将烧热的镍钢金属棒（螺丝刀）浸入自来水冷却。
   13. 重复使用前应对毛巾进行消毒。可准备多条毛巾以节省时间。
       注意：先用自来水清洗毛巾，然后将其浸入30 ppm含氯水中5分钟，再用自来水再次冲洗，最后浸入1 g/L硫代硫酸钠溶液中。
   14. 关闭喷灯后将其放置于安全位置，并等待其冷却至环境温度（约30分钟）后再行拆卸。
2. 手术 技术
   1. 在通风良好的环境中进行操作。
   2. 将两把手术剪刀和镊子在高压灭菌器中灭菌。
   3. 将50 mL 70%乙醇倒入100 mL玻璃烧杯中。
   4. 佩戴厚棉手套。
   5. 握住已麻醉的螃蟹，并用湿棉布覆盖其身体。
   6. 用已灭菌的镊子夹住螃蟹的一只眼睛。
   7. 迅速使用已灭菌的手术剪刀剪除眼柄。
      注意：螃蟹伤口处可能会流失血淋巴。
   8. 每次使用后，将剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒，并用纸巾擦干后方可再次使用。

方案第 7.2.2 步已更新为：

采用冷休克麻醉法对雌性个体进行单独麻醉。

至：

采用2-PE浸入麻醉法对雌性个体进行麻醉。

讨论部分已从以下内容更新：

本方案针对泥蟹（Scylla spp.）的切除眼柄操作而开发，可作为一种有效诱导性腺成熟的方法。该方案易于复制，适用于泥蟹商业化卵巢成熟生产，并可用于缩短泥蟹苗种生产中的潜伏期（即两次产卵之间的间隔时间）。

甲壳类动物（如淡水虾、海虾）的切除眼柄手术通常用于诱导性腺成熟和非繁殖季节产卵^11,12,13. 对短尾蟹类进行眼柄切除也用于研究蜕皮过程^25,32,33，激素调节¹⁸，性腺成熟³⁴，以及诱导繁殖与繁殖性能^{35,36,37,38,39}单侧或双侧眼柄消融会影响甲壳动物的生理状态。按照本研究所述方案进行眼柄消融后，也会影响泥蟹的卵巢成熟速率。在对照处理组（未进行眼柄消融）中，43.33% ± 5.77% 的雌蟹卵巢处于未成熟阶段（第1期）。然而，在相同的养殖周期（30天）内，经眼柄消融的雌蟹卵巢则进入前成熟阶段（第3期），其中电灼法和手术剪法处理组的比例分别为56.67% ± 11.55% 和53.33% ± 15.28% 技术），表明眼柄切除可促进泥蟹性腺的成熟。先前的研究也报道，完整蟹（未进行眼柄切除）的卵巢发育速度较眼柄切除蟹更慢^25,31由于完整甲壳类动物的性腺发育较慢，商业化的对虾和虾类育苗场普遍采用眼柄切除术。本方案中，经过眼柄切除处理的雌性螃蟹相较于未进行眼柄切除处理的雌性螃蟹，其卵巢成熟比例更高（图3).

梭子蟹性腺的成熟受激素调控^21,40,41。眼柄含有重要的内分泌腺体（即X器官-窦腺复合体），在梭子蟹性腺成熟过程中发挥关键作用^18,21。通过烧灼或手术进行单侧眼柄切除，会破坏合成和释放抑制性激素（如VIH）的主要内分泌腺体之一，从而导致促性腺激素（如VSH）水平升高。

通过肉眼观察Scylla spp. 卵巢组织的颜色，可区分其卵巢成熟阶段^29,30,42。透明或乳白色卵巢组织表明卵巢尚未成熟^29,30,42,43。本研究中，未进行眼柄切除的雌蟹组中仍发现存在未成熟卵巢（第1阶段），这是由于其卵巢成熟过程较慢所致。然而，经眼柄切除处理的各组雌蟹（包括采用灼烧法和手术法 的处理组）大多表现为卵巢即将成熟（第3阶段），部分个体已表现出完全成熟的卵巢（第4阶段）。因此，本文所述的眼柄切除方案可用于促进雌性泥蟹的卵巢成熟。该方案亦可直接应用于野外采集的成熟雌性泥蟹，以加速其苗种生产。为评估灼烧法与手术法 对泥蟹性腺成熟的影响，并确保准确估算蜕壳持续时间，本研究选用了性腺接近成熟但尚未完全成熟的雌蟹。在性腺接近成熟的雌蟹完成（诱导）蜕壳后，我们观察到其卵巢仍处于未成熟或早期发育阶段^29,44。在将新达到性成熟的雌蟹（无论是否进行眼柄切除）养殖30天后，根据卵巢组织的颜色判定其卵巢发育阶段（第1至第4阶段）。本方案推荐采用灼烧法对泥蟹实施眼柄切除，以避免血淋巴流失，并防止切除部位发生感染。灼烧法可立即封闭伤口，而手术法 则需额外使用碘液进行消毒处理。出于商业目的，应优先选择体型较大且卵巢成熟处于较晚阶段的成熟雌蟹进行眼柄切除，以缩短其达到完全成熟卵巢阶段所需时间，便于后续商业化养殖或亲本培育。除眼柄切除外，采用个体化养殖方式，提供砂质底物并充分投喂（最好使用活饵料），可提高圈养条件下泥蟹的性腺成熟率^30,35,45,46。

甲壳动物的血液称为血淋巴，在切除眼柄过程中可能会流失。血淋巴过度流失可能导致去眼柄螃蟹死亡，尤其是在进行切除眼柄手术时。伤口部位的血淋巴可发生凝固，从而防止进一步流失。使用碘酊可预防伤口感染。然而，与手术 技术相比，灼烧技术能立即封闭伤口，从而有效防止血淋巴流失及可能的感染。

在单侧眼柄切除术后7天内，无论采用电灼法还是手术法，均未发现泥蟹出现死亡。因此，单侧眼柄切除术具有较高的存活率。单侧眼柄切除不会影响蟹的存活率³³。

在蟹类操作和眼柄切除过程中产生的应激反应可能导致蟹死亡。为减少眼柄切除期间的操作应激，需要使用适当的麻醉方法。在甲壳类眼柄切除中，通常在眼柄基部使用化学麻醉剂（如利多卡因、盐酸利多卡因）进行局部麻醉^14,15,17,47。然而，由于泥蟹具有较强的攻击性和较大的体型，仅在眼柄基部进行麻醉效果不足，且注射过程可能给动物带来额外的应激。相比之下，通过降低水温使动物进入麻醉状态的方法更为经济且安全。在泥蟹中使用低温水进行麻醉较为常见，其他研究也已采用该方法，因其具有高效、简便以及对恢复和存活率影响小的优点^37,48,49。

尽管使用热灼法和手术法进行眼柄摘除 方法对蟹的存活影响较小，并能促进卵巢成熟，但进行眼柄消融需要熟练掌握相关技术。各操作步骤之间的时间间隔至关重要，因为任何延迟都会增加蟹的应激反应。与手术不同 技术，烧灼技术具有危险性，因其涉及使用易燃设备（即喷灯和丁烷气体）。因此，实施烧灼技术时需格外谨慎。

螃蟹具有天然的同类相食习性，它们会捕食刚刚完成蜕壳、仍处于软壳状态的个体^7,50,51。因此，将螃蟹进行单独养殖可避免因同类相食造成的不必要死亡。在泥蟹养殖中，无论是高密度养殖还是池塘养殖，为实现增肥或生产软壳蟹的目的，通常都采用个体单独养殖方式^8,52。本实验方案同样采用了个体养殖与维护。在螃蟹养殖或商业运输过程中，需将其螯足牢固绑扎（甚至进行自切处理），以防止争斗、不必要的伤害以及肢体丢失³⁴。

所述的切除眼柄操作应由多人共同完成。完成眼柄切除后，非一次性使用的设备（如水族箱、托盘、毛巾等）应使用30 ppm的氯进行消毒。必须每天至少两次监测蟹的状况。任何死亡的蟹、未食用的饲料、切除的附肢或蜕下的蟹壳都应迅速处理（例如，用漂白粉混合后掩埋于土壤中），以防止可能的疾病传播。

至：

本方案针对泥蟹（Scylla spp.）的切除眼柄操作而开发，可作为诱导性腺成熟的高效方法。该方案易于复制，适用于泥蟹商业化卵巢成熟生产，并可用于缩短泥蟹苗种生产中的潜伏期（即两次产卵之间的间隔时间）。

甲壳类动物（如淡水沼虾、海洋对虾）的眼柄切除通常用于诱导性腺成熟和反季节产卵^11,12,13。在短尾蟹类中，眼柄切除也被用于研究蜕皮^25,32,33、激素调控¹⁸、性腺成熟³⁴以及诱导繁殖和繁殖性能^{35,36,37,38,39}。本研究采用2-苯氧基乙醇浸泡法进行麻醉，因其在节肢动物中的效果与三卡因甲磺酸盐（MS-222）相当，但成本更低，且无需额外缓冲液⁴⁰。单侧或双侧眼柄切除会影响甲壳类动物的生理状态。根据本研究所述方案实施眼柄切除后，也影响了泥蟹的卵巢成熟速率。在对照处理组（未进行眼柄切除）中，43.33% ± 5.77%的雌性蟹处于卵巢未成熟阶段（阶段-1）。然而，在相同的养殖周期（30天）内，经眼柄切除的雌性蟹则表现出卵巢前成熟阶段（阶段-3；分别有56.67% ± 11.55%和53.33% ± 15.28%的个体采用电凝法和手术 技术），表明眼柄切除可促进泥蟹性腺的成熟。先前的研究也报道，未切除眼柄的蟹类卵巢发育速度慢于眼柄切除个体^25,31。由于完整甲壳类动物的性腺发育较慢，眼柄切除技术已广泛应用于商业化的沼虾和对虾育苗场。在本实验方案中，接受眼柄切除的雌性蟹卵巢成熟比例高于未接受该处理的雌性蟹（图3）。

泥蟹性腺的成熟受到激素的调控^21,41,42。其眼柄含有重要的内分泌腺体（即X器官-窦腺复合体），在泥蟹性腺成熟过程中发挥关键作用^18,21。通过烧灼或手术方式进行单侧眼柄切除，会破坏参与抑制性激素（如VIH）合成与释放的主要内分泌腺体之一，从而导致促性腺激素（即VSH）水平升高。

通过肉眼观察Scylla spp. 卵巢组织的颜色，可区分其卵巢成熟阶段^29,30,43。透明或乳白色卵巢组织表明卵巢尚未成熟^29,30,43,44。本研究中，未进行眼柄切除的雌蟹组中仍发现有未成熟卵巢（第1阶段），这是由于其卵巢成熟过程较慢所致。然而，经眼柄切除处理的各组雌蟹（包括采用灼烧法和手术法 的处理组）大多表现为卵巢即将成熟（第3阶段），部分个体已出现完全成熟的卵巢（第4阶段）。因此，本文所述的眼柄切除方案可用于促进雌性泥蟹的卵巢成熟。该方案也可直接应用于野外采集的成熟雌性泥蟹，以加速其苗种生产。为评估灼烧法与手术法 对泥蟹性腺成熟的影响，并确保准确估算蜕壳持续时间，本研究选用了性腺接近成熟但尚未完全成熟的雌蟹。在性腺接近成熟的雌蟹完成（诱导）蜕壳后，我们观察到其卵巢仍处于未成熟或早期发育阶段^29,45。在将新达到性成熟的雌蟹（无论是否进行眼柄切除）养殖30天后，根据卵巢组织的颜色判定其卵巢发育阶段（第1至第4阶段）。本方案推荐采用灼烧法对泥蟹实施眼柄切除，以避免血淋巴流失，并防止切除部位发生感染。灼烧法可立即封闭伤口，而手术法 则需要较长时间愈合，存在感染风险。出于商业目的，应选择体型较大且卵巢成熟度较高的成熟雌蟹进行眼柄切除，以缩短其达到完全成熟卵巢阶段所需时间，便于后续商业化养殖或亲本培育。除眼柄切除外，将个体单独饲养于含沙基质环境中，并提供充足饲料（最好使用活饵料），可提高圈养条件下泥蟹的性腺成熟率^30,35,46,47。

甲壳动物的血液称为血淋巴，在切除眼柄过程中可能会流失。血淋巴过度流失可能导致去眼柄螃蟹死亡，尤其是在进行切除眼柄手术时。伤口部位的血淋巴可发生凝固，从而防止进一步流失。 然而，与手术 技术相比，灼烧技术能够立即封闭伤口，有效防止血淋巴流失以及可能的感染。

在单侧眼柄切除术后7天内，无论采用电灼法还是手术法，均未发现泥蟹出现死亡。因此，单侧眼柄切除术可实现较高的存活率。单侧眼柄切除不会影响蟹的存活率³³。

在蟹类操作和眼柄切除过程中产生的应激反应可能导致蟹的死亡。为减少眼柄切除期间的操作应激，需要进行适当的麻醉。在甲壳类动物的眼柄切除中，通常在眼柄基部使用化学麻醉剂（如利多卡因、盐酸利多卡因）进行局部麻醉^14,15,17,48。然而，由于泥蟹具有较强的攻击性和较大的体型，仅在眼柄基部实施麻醉并不充分，且注射过程可能给动物带来额外的应激。相比之下，通过降低水温进行麻醉的方法更为经济且安全。使用冷水对泥蟹实施麻醉较为常见，其他研究也已采用该方法，因其具有高效、简便以及对恢复和存活影响较小的优点^37,49,50。 此外，建议未来开展关于泥蟹眼柄切除后疼痛评估的研究，以揭示与疼痛和应激相关的行为变化，这一点在淡水长臂虾 Macrobrachium americanum 中已有体现⁵¹。

尽管使用烧灼法和手术法进行眼柄切除 该方法对螃蟹存活率影响较小，并能促进卵巢成熟，但进行眼柄消融需要熟练掌握相关技术。各操作步骤之间的时间间隔至关重要，因为任何步骤间的延迟都会增加螃蟹的额外应激。与手术不同 该技术中，烧灼法因涉及使用易燃设备（即喷枪和丁烷气体）而具有危险性，因此在实施烧灼法时需格外谨慎。

螃蟹具有天然的同类相食习性，常会捕食刚刚完成蜕壳、仍处于软壳状态的个体^7,52,53。因此，将螃蟹进行单独培育可避免因同类相食导致的不必要死亡。在泥蟹养殖中，无论是高密度养殖还是池塘养殖，为实现增肥或生产软壳蟹的目的，通常都采用个体化培育方式^8,53。本实验方案同样采用了个体培育与维护。在螃蟹运输过程中（无论用于养殖或商业目的），需将蟹的螯足牢固绑扎（甚至进行自切处理），以防止争斗、不必要的损伤以及肢体丢失³⁴。

所述的眼柄切除操作应由多人共同完成。完成眼柄切除后，非一次性使用的器械（如水族箱、托盘、毛巾等）应使用30 ppm的氯进行消毒。必须每天至少监测蟹两次。任何死亡的蟹、未食用的饲料、切除的附肢或蜕下的蟹壳都应迅速处理（例如，用漂白粉混合后掩埋于土壤中），以防止可能的疾病传播。

参考文献已从以下内容更新：

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方案

已对以下文章发布更正： 通过切除眼柄促进泥蟹卵巢成熟。引言、实验方案、讨论和参考文献部分均已 更新。

第四句话在 引言部分的第三段已更新为：

本研究中的眼柄切除方案通过使用完全镇静的螃蟹，最大限度地减少了螃蟹的应激反应，同时降低了螃蟹咬伤对操作人员造成的物理伤害。 

至：

本研究中的眼柄消融方案通过使用完全麻醉的螃蟹，最大限度地减少螃蟹的应激反应，同时最大限度地降低螃蟹咬伤对操作人员造成的物理伤害。 

实验方案的起始部分已从以下内容更新：

本实验方案遵循马来西亚实验动物科学协会（Laboratory Animal Science Association of Malaysia）发布的《用于科学目的动物护理与使用的马来西亚规范指南》。实验样本的处死操作依据美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》（NIH Publications No. 8023，1978年修订版）进行。性未成熟的雌性泥蟹（橙色泥蟹 S. olivacea）采自马来西亚实兆伊湿地（Setiu Wetlands）当地市场（北纬5°66′62′′，东经102°72′33′′）。泥蟹物种的鉴定基于其形态学特征¹。

至：

本实验方案遵循马来西亚实验动物科学协会（Laboratory Animal Science Association of Malaysia）发布的《马来西亚实验动物使用与护理规范》，并已获得马来西亚登嘉楼大学研究伦理委员会批准（动物伦理批准编号：UMT/JKEPHMK/2023/96）。实验样本的安乐死操作依据《动物安乐死指南》（AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals）2020年版执行。性成熟前期的雌性泥蟹（橙色泥蟹 Scylla olivacea）采自马来西亚登嘉楼州实兆远湿地（Setiu Wetlands）当地市场（北纬5°66′62′′，东经102°72′33′′）。泥蟹物种的鉴定依据其形态学特征¹。

方案第4节已从以下内容更新：

4. 冷休克麻醉

1. 选择性成熟的雌性个体，其腹部呈深色、椭圆形的腹瓣，甲宽（CW）>86 mm（图1）。
2. 使用抄网捕获螃蟹，并将其单独置于小型水族箱中，进行低温休克麻醉。
3. 在透明塑料水族箱中准备2 L温度为4 °C至1 °C的海水（20 ppt），使用（−20 °C）冰袋维持低温以实现冷休克麻醉。
   注意：使用数字温度计监测水温。
4. 将螃蟹浸入4 °C海水中直至其进入镇静状态（约3−5分钟）。
5. 通过观察螃蟹是否无自发运动来确认其已完全麻醉。当用镊子触碰时，其腿部和螯足关节仍可能出现轻微活动。

至：

4. 麻醉

1. 选择性成熟的雌性个体，其腹部瓣呈深色、椭圆形，甲宽（CW）>86 mm（图1）。
2. 使用抄网捕获螃蟹，并将其单独置于小型水族箱中以进行麻醉。
3. 经过5分钟的适应期后，在每个水族箱中加入2-苯氧基乙醇（2-PE），浓度为2 mL/L，进行15分钟的麻醉处理。
4. 通过观察螃蟹是否缺乏自发运动来确认其已完全麻醉。

方案第5节已从以下内容更新：

5. 眼柄切除

1. 烧灼技术
   1. 所有操作均应在台面上并在开放区域进行。
   2. 取一根带木柄或塑料手柄的平头镍钢金属棒（例如螺丝刀），并将手柄部分用湿棉布包裹。
   3. 将两把不锈钢手术镊在高压灭菌器中灭菌。
   4. 准备一个装有70%乙醇的喷雾瓶，并备好纸巾以供使用。
      注意：乙醇高度易燃，请远离火源。
   5. 将喷灯牢固连接至燃气罐（丁烷）。
      警告：请遵循喷灯和燃气罐上的使用说明。连接燃气罐时务必确保喷灯处于关闭状态。仔细阅读并遵守燃气罐上注明的所有防火安全注意事项。
   6. 佩戴厚棉手套，以防被高温物体烫伤。
   7. 将金属棒的尖端置于喷灯火焰中加热，直至金属棒呈现明亮的红色。
   8. 用湿棉布覆盖已麻醉（镇静）的螃蟹。
      注意：应覆盖螃蟹的所有触手，以避免不必要的损伤。
   9. 用已灭菌的手术镊夹住螃蟹的一只眼睛。
      注意：首次使用时需将手术镊在高压灭菌器中灭菌，后续对其他螃蟹操作时可用70%乙醇进行消毒。
   10. 将烧红的金属平头端压在螃蟹的眼睛上，轻微施压约10−15秒，直至眼柄变为橙色或红橙色。
       注意：采用烧灼法进行眼柄消融时需要两人配合：一人固定螃蟹，另一人执行消融操作。
   11. 使用70%乙醇喷雾对镊子进行消毒，以确保螃蟹之间无交叉污染。
   12. 在完成所有螃蟹的眼柄消融后，将灼热的镍钢金属棒（螺丝刀）浸入自来水冷却。
   13. 重复使用前应对毛巾进行消毒，可准备多块毛巾以节省时间。
       注意：先用自来水清洗毛巾，然后将其浸入30 ppm含氯水中5分钟，再用自来水再次冲洗，并最后浸入1 g/L硫代硫酸钠溶液中。
   14. 关闭喷灯后将其放置于安全位置，并等待其冷却至环境温度（约30分钟）后再行拆卸。
2. 手术 技术
   1. 在通风良好的环境中进行操作。
   2. 将两把手术剪刀和镊子在高压灭菌器中灭菌。
   3. 将50 mL 70%乙醇倒入100 mL玻璃烧杯中。
   4. 在滴瓶中准备好碘酊溶液。
      注意：碘酊（又称碘酒或弱碘溶液）由2%–7%的单质碘及碘化钾或碘化钠溶解于乙醇和水中制成。
   5. 佩戴厚棉手套。
   6. 握住已镇静的螃蟹，并用湿棉布将其覆盖。
   7. 用已灭菌的手术镊夹住螃蟹的一只眼睛。
   8. 迅速使用已灭菌的手术剪剪除眼柄。
      注意：螃蟹伤口部位可能会流失血淋巴。
   9. 每次使用后，将剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒，并用纸巾擦干后方可再次使用。
   10. 剪除眼柄后，立即在伤口处滴加2至3滴碘酊。
       注意：碘酊用于促进愈合并预防感染。

至：

5. 剥除眼柄

1. 烧灼法
   1. 所有操作均应在桌面上且在通风开阔的区域进行。
   2. 取一根带木柄或塑料柄的平头镍钢金属棒（例如螺丝刀），并将手柄部分用湿棉布包裹。
   3. 将两把不锈钢手术镊在高压灭菌器中进行灭菌。
   4. 将70%乙醇装入喷雾瓶中，并远离任何与火源相关的设备，如喷灯或烧红的螺丝刀。准备好纸巾以备使用。
      注意：乙醇高度易燃，请与火源保持安全距离。
   5. 将喷灯牢固连接至燃气罐（丁烷）。
      警告：请遵循喷灯和燃气罐上的使用说明。连接燃气罐时务必确保喷灯处于关闭状态。仔细阅读并遵守燃气罐上标注的所有防火安全注意事项。
   6. 佩戴厚棉手套，以防被高温物体烫伤。
   7. 将金属棒的尖端置于喷灯火焰中加热，直至金属棒呈现明亮的红色。
   8. 用湿棉布覆盖已麻醉的 蟹。
      注意：应覆盖蟹的触角，以避免造成不必要的损伤。
   9. 用已灭菌的手术镊夹住蟹的一只眼睛。
      注意：首次使用时需将手术镊在高压灭菌器中灭菌；后续对其他蟹操作时，应使用70%乙醇进行消毒。
   10. 将烧至通红的金属平头端压在蟹的眼柄上，轻轻按压约10−15秒，直至眼柄变为橙色或红橙色。操作时需小心，避免损伤周围结构。 
       注意：采用烧灼法进行眼柄摘除需两人协作：一人固定蟹体，另一人执行摘除操作。
   11. 使用70%乙醇喷雾对镊子进行消毒，以防止蟹之间的交叉污染。
       注意：眼柄摘除操作完成后，至少等待5分钟，待镊子冷却后再进行乙醇消毒，以避免引发火灾风险。
   12. 完成所有蟹的眼柄摘除后，将高温的镍钢金属棒（螺丝刀）浸入自来水冷却。
   13. 重复使用前应对毛巾进行消毒。可准备多块毛巾以节省时间。
       注意：先用自来水清洗毛巾，再将其浸入含30 ppm有效氯的水溶液中5分钟，随后再次用自来水冲洗，最后放入1 g/L硫代硫酸钠溶液中浸泡。
   14. 关闭喷灯后将其放置于安全位置，并等待其冷却至环境温度（约30分钟）后再行拆卸。
2. 手术 法
   1. 在通风良好的环境中进行操作。
   2. 将两把手术剪刀和手术镊在高压灭菌器中进行灭菌。
   3. 将50 mL 70%乙醇倒入100 mL玻璃烧杯中。
   4. 佩戴厚棉手套。
   5. 握住已麻醉的蟹，并用湿棉布覆盖其身体。
   6. 用已灭菌的手术镊夹住蟹的一只眼睛。
   7. 迅速使用已灭菌的手术剪剪除眼柄。
      注意：蟹的伤口部位可能会流失血淋巴。
   8. 每次使用后，将剪刀和镊子浸入70%乙醇中消毒，并用纸巾擦干后方可再次使用。

方案第 7.2.2 步已从以下内容更新：

采用冷休克麻醉法对雌性个体进行单独麻醉。

至：

采用2-PE浸入麻醉法对雌性个体进行麻醉。

讨论部分已从以下内容更新：

本方案旨在为拟穴青蟹（Scylla spp.）的切除眼柄操作提供标准化流程，可作为一种有效诱导性腺成熟的方法。该方案可轻松复制，适用于泥蟹商业化卵巢成熟生产，并可用于缩短泥蟹苗种生产中的潜伏期（即从一次产卵到下一次产卵的时间间隔）。

甲壳类动物（例如淡水虾、海虾）的切除眼柄操作通常用于诱导性腺成熟和非季节性产卵^11,12,13。对短尾蟹类进行眼柄切除也已被用于研究蜕皮^25,32,33、激素调控¹⁸、性腺成熟³⁴以及诱导繁殖和繁殖性能^{35,36,37,38,39}。单侧或双侧眼柄切除会影响甲壳类动物的生理状态。按照本研究所述方案进行眼柄切除同样会影响泥蟹的卵巢成熟速率。在对照处理组（未进行眼柄切除）中，43.33% ± 5.77% 的雌蟹卵巢处于未成熟阶段（第1期）。然而，在相同的养殖周期（30天）内，进行眼柄切除的雌蟹卵巢则处于前成熟阶段（第3期；采用电灼法和手术 技术的占比分别为56.67% ± 11.55% 和 53.33% ± 15.28%），这表明眼柄切除可促进泥蟹性腺的成熟。先前的研究也报道过，未经眼柄切除的完整个体雌蟹其卵巢发育速度慢于眼柄切除个体^25,31。由于完整甲壳类动物的性腺发育较慢，眼柄切除技术已广泛应用于商业化的虾类和对虾育苗场。在本实验方案中，接受眼柄切除处理的雌蟹其卵巢成熟比例高于未接受眼柄切除处理的雌蟹（图3）。

泥蟹性腺的成熟受激素调控^21,40,41。眼柄含有重要的内分泌腺体（即X器官-窦腺复合体），在泥蟹性腺成熟过程中发挥关键作用^18,21。通过烧灼或手术方式进行单侧眼柄切除，会破坏合成和释放抑制性激素（如VIH）的主要内分泌腺体之一，从而导致促性腺激素（如VSH）水平升高。

Scylla 属物种的卵巢成熟阶段可通过肉眼观察卵巢组织的颜色进行区分^29,30,42。透明或乳白色卵巢组织表明卵巢尚未成熟^29,30,42,43。本研究中，未进行眼柄切除的雌蟹组中仍发现存在未成熟卵巢（第1阶段），这是由于其卵巢成熟过程较慢所致。然而，经眼柄切除处理的各组雌蟹（包括采用灼烧法和手术 技术的组别）大多表现为卵巢前成熟阶段（第3阶段），部分个体已表现出完全成熟的卵巢（第4阶段）。因此，本文所述的眼柄切除方案可用于促进雌性泥蟹的卵巢成熟。该方案也可直接应用于野外采集的成熟雌性泥蟹，以加速其苗种生产。为评估灼烧法与手术 方法对泥蟹性腺成熟的效果，并确保准确估算蜕壳持续时间，本研究选用了性腺前成熟的蟹类个体。在性腺前成熟的雌蟹完成（诱导）蜕壳后，我们观察到其卵巢仍处于未成熟或早期发育阶段^29,44。在将新成熟的雌蟹（无论是否进行眼柄切除）养殖30天后，根据卵巢组织的颜色判定其卵巢发育阶段（第1至第4阶段）。本方案推荐采用灼烧法对泥蟹实施眼柄切除，以避免血淋巴流失，并防止切除部位发生感染。灼烧法可立即封闭伤口，而手术 法则需额外使用碘液进行消毒处理。出于商业目的，应优先选择体型较大且卵巢成熟处于较晚阶段的成熟个体进行眼柄切除，以缩短其达到完全成熟卵巢阶段所需时间，便于后续商业化或亲本培育。除眼柄切除外，采用沙质底物进行单体养殖，并提供充足投喂（最好使用活饵料），可提高圈养条件下泥蟹的性腺成熟率^30,35,45,46。

甲壳动物的血液称为血淋巴，在切除眼柄过程中可能会流失。血淋巴过度流失可能导致去眼柄螃蟹死亡，尤其是在进行切除眼柄手术时。血淋巴可在伤口部位凝结，以防止流失。使用碘酊可预防伤口感染。然而，与手术 技术相比，灼烧技术能立即封闭伤口，从而防止血淋巴流失及可能的感染。

在单侧眼柄切除术后7天内，无论采用电灼法还是手术法，均未发现泥蟹死亡。因此，眼柄切除术可实现较高的存活率。单侧眼柄切除不会影响蟹的存活率³³。

在蟹类操作和眼柄切除过程中产生的应激反应可能导致蟹的死亡。为减少眼柄切除期间的操作应激，需要使用适当的麻醉方法。在甲壳类动物的眼柄切除中，通常在眼柄基部使用化学麻醉剂（如利多卡因、盐酸利多卡因）进行局部麻醉^14,15,17,47。然而，由于泥蟹具有较强的攻击性和较大的体型，仅在眼柄基部使用麻醉剂效果不足，且注射过程可能给动物带来额外的应激。相比之下，通过降低水温进行麻醉的方法更为经济且安全。使用冷水对泥蟹进行麻醉是常见做法，因其高效、简便，并对恢复和存活率影响较小，已在其他研究中广泛应用^37,48,49。

尽管使用热灼法和手术法进行眼柄摘除 该方法对螃蟹存活率影响较小，并能促进卵巢成熟，但进行眼柄消融术需要熟练掌握相关技术。各操作步骤之间的时间间隔至关重要，因为任何步骤间的延迟都会增加螃蟹的额外应激。与手术不同 该技术具有危险性，因为涉及使用易燃设备（即喷灯和丁烷气体）。因此，实施烧灼技术时需格外谨慎。

螃蟹具有天然的同类相食习性，已知它们会捕食刚刚完成蜕壳、仍处于软壳状态的个体^7,50,51。因此，将螃蟹单独饲养可避免因同类相食造成的不必要死亡。在高密度养殖和池塘养殖中，为育肥及软壳蟹生产目的，锯缘青蟹的养殖普遍采用个体化饲养方式^8,52。本实验方案同样采用了个体饲养与维护。在螃蟹运输过程中（无论是用于养殖还是商业目的），需将蟹的螯足牢固绑扎（或甚至进行自切处理），以防止打斗、不必要的损伤以及附肢脱落³⁴。

所述的眼柄切除操作应由多人共同完成。完成眼柄切除后，非一次性使用的器械（例如水族箱、托盘、毛巾等）应使用30 ppm的氯进行消毒。必须每天至少监测蟹两次。任何死亡的蟹、未食用的饲料、切除的附肢或蜕下的蟹壳都应迅速处理（例如，用漂白粉混合后掩埋于土壤中），以防止潜在的疾病传播。

至：

本方案旨在为拟穴青蟹（Scylla spp.）的切除眼柄操作提供标准化流程，可作为一种有效诱导性腺成熟的方法。该方案易于复制，适用于泥蟹商业化卵巢成熟生产，并可用于缩短泥蟹苗种生产中的潜伏期（即从一次产卵到下一次产卵的时间间隔）。

甲壳动物（例如淡水虾、海虾）的眼柄切除通常用于诱导性腺成熟和非季节性产卵^11,12,13。对短尾蟹类进行眼柄切除也已被用于研究蜕皮^25,32,33、激素调控¹⁸、性腺成熟³⁴以及诱导繁殖和繁殖性能^{35,36,37,38,39}。本研究采用2-苯氧基乙醇浸浴法进行麻醉，因其在节肢动物中的效果与三卡因甲磺酸盐（MS-222）相当，但成本更低，且无需额外缓冲液⁴⁰。单侧或双侧眼柄切除会影响甲壳动物的生理状态。按照本研究所述方案进行眼柄切除后， также 影响了泥蟹的卵巢成熟速率。在对照处理组（未进行眼柄切除）中，43.33% ± 5.77%的雌蟹卵巢处于未成熟阶段（第1期）。然而，在相同的养殖周期（30天）内，经眼柄切除的雌蟹卵巢则达到即将成熟阶段（第3期；采用电灼法和手术 技术的占比分别为56.67% ± 11.55%和53.33% ± 15.28%），表明眼柄切除可促进泥蟹性腺的成熟。先前的研究也报道，未经眼柄切除的完整个体雌蟹卵巢发育速度慢于眼柄切除个体^25,31。由于完整甲壳动物的性腺发育较慢，眼柄切除在商业化的虾类和对虾育苗场中被广泛应用。在本实验方案中，接受眼柄切除处理的雌蟹卵巢成熟比例显著高于未接受该处理的雌蟹（图3）。

泥蟹性腺的成熟受到激素的调控^21,41,42。眼柄含有重要的内分泌腺体（即X器官-窦腺复合体），在泥蟹性腺成熟过程中发挥关键作用^18,21。通过烧灼或手术方式进行单侧眼柄切除，会破坏合成和释放抑制性激素（如VIH）的主要内分泌腺体之一，从而导致促性腺激素（如VSH）水平升高。

Scylla 属物种的卵巢成熟阶段可通过肉眼观察卵巢组织的颜色进行区分^29,30,43。透明或乳白色的卵巢组织表明卵巢尚未成熟^29,30,43,44。在本研究中，未进行眼柄切除的雌蟹组中仍发现有未成熟卵巢（第1阶段），这是由于其卵巢成熟过程较慢所致。然而，经眼柄切除处理的各组雌蟹（包括采用灼烧法和手术法 的处理组）大多表现为卵巢即将成熟（第3阶段），部分个体已表现出完全成熟的卵巢（第4阶段）。因此，本文所述的眼柄切除方案可用于促进雌性泥蟹的卵巢成熟。该方案也可直接应用于野外采集的成熟雌性泥蟹，以加速其苗种生产。为了评估灼烧法与手术法 对泥蟹性腺成熟的效果，并确保准确估算蜕壳持续时间，本研究选用了性腺接近成熟但尚未完全成熟的雌蟹。在性腺接近成熟的雌蟹完成（诱导）蜕壳后，我们观察到其卵巢仍处于未成熟或早期发育阶段^29,45。在将新成熟的雌蟹（无论是否进行眼柄切除）养殖30天后，根据卵巢组织的颜色判定其卵巢发育阶段（第1至第4阶段）。本方案推荐采用灼烧法对泥蟹实施眼柄切除，以避免血淋巴流失，并防止切除部位发生感染。灼烧法可立即封闭伤口，而手术法 则需要较长时间愈合，存在感染风险。出于商业目的，应优先选择体型较大且卵巢成熟度较高的成熟雌蟹进行眼柄切除，以缩短达到完全成熟卵巢阶段所需时间，便于后续商业化养殖或亲本培育。除眼柄切除外，将个体单独饲养于含沙基质环境中，并提供充足饲料（最好使用活饵料），可提高圈养条件下泥蟹的性腺成熟率^30,35,46,47。

甲壳动物的血液称为血淋巴，在切除眼柄过程中可能会流失。血淋巴过度流失可能导致去眼柄螃蟹死亡，尤其是在进行切除眼柄手术时。伤口部位的血淋巴可发生凝固，从而防止流失。 然而，与手术 技术相比，灼烧技术可立即封闭伤口，有效防止血淋巴流失及可能的感染。

单侧眼柄切除术后7天内，采用电灼或手术方式处理的泥蟹均未出现死亡。因此，眼柄切除术可实现较高的存活率。单侧眼柄切除不会影响蟹的存活率³³。

在蟹类操作和眼柄切除过程中产生的应激反应可能导致蟹的死亡。在进行眼柄切除时，需要使用适当的麻醉方法以尽量减少操作带来的应激。在甲壳类动物的眼柄切除中，通常在眼柄基部使用化学麻醉剂（如利多卡因、盐酸利多卡因）进行局部麻醉^14,15,17,48。然而，由于泥蟹具有较强的攻击性和较大的体型，仅在眼柄基部实施麻醉并不充分，且注射过程可能给动物带来额外的应激。相比之下，通过降低水温使泥蟹进入麻醉状态的方法更为经济且安全。使用冷水对泥蟹进行麻醉在以往研究中较为常见，因其具有高效、简便以及对恢复和存活影响较小的优点^37,49,50。 此外，建议未来开展关于泥蟹眼柄切除后疼痛评估的研究，以揭示与疼痛和应激相关的行为变化，这一点在淡水长臂虾 Macrobrachium americanum 中已有体现⁵¹。

尽管使用烧灼法和手术法进行眼柄切除 方法对蟹的存活影响较小，并能促进卵巢成熟，但进行眼柄消融需要熟练掌握相关技术。各操作步骤之间的时间间隔至关重要，因为任何延迟都会增加蟹的应激反应。与手术不同 该技术中，烧灼法因涉及使用易燃设备（即喷枪和丁烷气体）而具有危险性，因此在实施烧灼法时需格外谨慎。

螃蟹具有天然的同类相食习性，已知它们会捕食刚完成蜕壳、仍处于软壳状态的个体^7,52,53。因此，将螃蟹进行单独培育可避免因同类相食造成的不必要死亡。在泥蟹养殖中，无论是高密度养殖还是池塘养殖，为实现增重或生产软壳蟹的目的，通常都采用个体单独培育方式^8,53。本实验方案同样采用了个体培育与维护。在螃蟹运输过程中（无论是用于养殖还是商业目的），需将其螯足牢固绑扎（有时甚至进行自切处理），以防止争斗、不必要的损伤以及肢体丢失³⁴。

所述的眼柄切除操作应由多人共同完成。完成眼柄切除后，非一次性使用的设备（如水族箱、托盘、毛巾等）应使用30 ppm的氯进行消毒。必须每天至少监测蟹两次。任何死亡的蟹、未食用的饲料、切除的附肢或蜕下的蟹壳都应迅速处理（例如，用漂白粉混合后掩埋于土壤中），以防止潜在的疾病传播。

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