"Avatar"，一种使用体内菌株和激活的改良离体工作循环实验

摘要

本文详细介绍了在离体工作循环实验中使用来自实验室啮齿动物的"化身"肌肉模拟体内肌肉力产生的方法，以评估应变瞬变和激活对肌肉力反应的贡献。

摘要

运动行为是动态系统的新兴特征，由肌肉力量的产生和工作输出产生。神经系统和机械系统之间的相互作用同时发生在生物组织的各个层面，从跑步时腿部肌肉特性的调整到四肢与地面相互作用的动力学。了解动物在控制层次结构中将其神经控制策略转向内在肌肉力学（"前屈"）的条件，将使肌肉模型能够更准确地预测体内肌肉力量并工作。为了了解体内肌肉力学，需要在类似于体内运动的动态变化应变和负载条件下对肌肉力量和功进行离体研究。体内应变轨迹通常表现出突变（即应变和速度瞬变），这是由神经激活、肌肉骨骼运动学和环境施加的载荷之间的相互作用引起的。我们的"化身"技术的主要目标是研究在应变率和负荷的突然变化期间肌肉如何运作，此时内在机械特性对肌肉力产生的贡献可能最大。在"化身"技术中，使用测量的体内应变轨迹和动物在动态运动期间的肌电图 （EMG） 信号修改了传统的工作回路方法，以驱动离体肌肉通过多个拉伸缩短周期。这种方法类似于工作回路技术，不同之处在于体内应变轨迹被适当缩放并施加在连接到伺服电机的离体小鼠肌肉上。该技术允许人们：（1） 模拟体内应变、激活、步幅频率和工作回路模式;（2） 改变这些模式以最准确地匹配体内力响应;（3） 在受控组合中改变应变和/或激活的特定特征以检验机制假设。

引言

移动的动物在复杂环境中取得了令人印象深刻的耐力、速度和敏捷性的运动壮举。与人类设计的机器相比，动物的运动尤其令人印象深刻——与动物相比，当前腿机器人、假肢和外骨骼的稳定性和敏捷性仍然很差。在自然地形中，腿式运动需要精确控制和快速调整，以改变速度和纵环境特征，这些特征会起到意外扰动的作用^{1，2，3，4}。然而，理解非稳态运动本身就具有挑战性，因为动力学取决于物理环境、肌肉骨骼力学和感觉运动控制之间的复杂交互^1，2。腿部运动需要通过对感觉信息进行快速的多模态处理以及肢体和关节的协调驱动来响应意外的扰动^1，5。最终，运动是通过肌肉骨骼系统的内在机械特性以及神经控制产生力来实现的^{1，5，6，7}。神经力学的一个突出问题是这些因素如何相互作用以产生协调运动以响应意外的扰动。以下技术利用肌肉对变形的固有机械响应，在对"化身"肌肉进行可控的离体实验期间，使用体内应变轨迹。

肌肉工作循环技术为理解周期性运动中的内在肌肉力学提供了一个重要的框架^8，9，10.传统的工作回路技术使用在体内实验中测量的频率和激活模式来驱动肌肉通过预定义的、通常是正弦的应变轨迹^{2，8，9，11}。在动物由于与环境和肌肉骨骼运动学的相互作用而不会发生应变轨迹快速变化的条件下，使用正弦长度轨迹可以真实地估计飞行¹² 和 swimming^{2 期间的功和功率输出}。然而，腿部运动过程中的体内肌肉拉伤轨迹是由神经激活、肌肉骨骼运动学和环境施加的载荷之间的相互作用动态产生的^{5，7，13，14}。需要一种更逼真的工作循环技术来模拟与体内肌肉肌腱动力学相对应的负载、应变轨迹和力的产生，并深入了解内在肌肉力学和神经控制如何相互作用以在面对扰动时产生协调运动。

在这里，我们提出了一种新颖的方法，通过在受控离体实验中使用来自实验室啮齿动物的"化身"肌肉来模拟跑步机运动期间的体内肌肉力，其体内应变轨迹代表时变的体内负荷。在受控离体实验期间，使用来自实验动物肌肉的目标肌肉测量的体内应变轨迹将模拟运动过程中所经历的负荷。在此处描述的实验中，离体小鼠趾长伸肌 （EDL） 肌肉在跑步机上行走、小跑和疾驰时用作体内大鼠内侧腓肠肌 （MG） 肌肉的"化身"¹³。这种方法类似于工作回路技术，不同之处在于体内应变轨迹被适当缩放并施加在连接到伺服电机的离体小鼠肌肉上。虽然与大鼠 MG 相比，小鼠 EDL 肌肉的大小、纤维类型和结构不同，但可以控制这些差异。"头像"技术允许人们：（1） 模拟体内应变、激活、步幅频率和工作循环模式;（2） 改变这些模式以最准确地匹配体内力响应;（3） 在受控组合中改变应变和/或激活的特定特征以检验机制假设。

方案

所有动物研究均已获得北亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用来自 60-280 日龄的雄性和雌性野生型小鼠 （菌株 B6C3Fe a/a-Ttn^mdm/J） 的趾长伸肌 （EDL）。这些动物是从商业来源获得的（见材料表），并在北亚利桑那大学的一个群体中建立。

1. 选择体内应变轨迹并准备在离体工作循环实验中使用

注意：在该协议中，直接提供给作者（Nicolai Konow，马萨诸塞大学洛厄尔分校，个人通信）的体内动态运动的先前测量值用于离体实验。原始数据是为 Wakeling 等人收集的¹⁵。需要时间、长度或应变、EMG/激活和力数据来复制协议。

1. 使用任何编程平台（补充编码文件 1 中提供的 MATLab 代码）将整个体内试验分割为单独的步幅。
   1. 绘制整个体内试验的长度变化与时间的关系图。这用于可视化单个步幅（站姿到站姿）并评估步幅变化（图 1）。
   2. 计算整个试验的应变（长度 （L） /最佳长度 L₀ 时的最大等长力）。
   3. 从整个试验中选择一个代表所有步幅的步幅，并且该步幅的开始和结束时间相似。这可以通过将长度相互叠加以比较每个步幅来直观地完成。
   4. 选择代表性步幅后，使用任何编程平台从整个试验中分割出应变、肌电图/激活和力数据（有关 MATLab^{16 中使用的代码，请参阅补充编码文件 1}）。
   5. 如果应变、EMG/激活或力的采样频率不同，请对数据点进行插值，以便以相同的频率对所有数据点进行采样。
      注意：研究人员可以根据整个试验中采样的每个点之间的时间间隔来确定捕获频率。如果以相同的频率捕获变量，则采样时间将相同。
2. 计算分段步幅的频率。
   1. 通过确定分段步幅的持续时间（以秒为单位）并将 1（秒）除以持续时间（1/持续时间 = # 步数/秒）来计算频率。
   2. 手动确定在离体实验中必须采集多少数据点才能匹配频率。
   3. 计算两个步幅所需的时间。至少重复一次步幅以估计肌肉测量误差，这将是后续统计分析所必需的。
3. 使用测量的 EMG 活动确定相对于应变输入的刺激阶段，以确定离体工作循环刺激的开始和持续时间。可以使用任何编程平台（有关本研究中使用的代码，请参见补充编码文件 1）。
   1. 查看与应变变化相同的 x 轴范围（时间）上的 EMG 信号（图 1）。放大 EMG 信号以使其可见;这可以通过将 EMG 信号乘以任意数字，将应变和 EMG 重新缩放为相同的刻度，和/或将 EMG 信号添加到应变中来完成><。 注意：作者使用 MATLab 中的"rescale"函数将应变和 EMG 重新缩放为相同的刻度（参见补充图 1）。
   2. 查找 EMG 活动开始和停止的位置，如两个标准差的强度变化所示^17，18.
      注意：根据动物和肌肉的不同，肌电图的发作可能与足部接触相对应，也可能不相符（Monica Daley，加州大学欧文分校，个人通信）（见讨论部分）。
   3. 计算 EMG 激活开始发生的应变周期百分比（例如，40%）以及刺激将发生多长时间（例如，222 毫秒><）。 注意：研究人员需要考虑兴奋-收缩耦合 （ECC） 延迟，该延迟在体内运动和离体工作循环之间有所不同，并且可能因每种动物和肌肉而异（例如，大鼠 MG 的体内 ECC 为 24.5 毫秒，小鼠 EDL 的离体 ECC 为 ~5 毫秒）。
4. 为工作回路控制器程序准备代表性应变输入。任何可以捕获力输出以及应变和刺激输入的程序都可以用于工作回路控制器程序（参见讨论部分）。
   1. 采用选定的步幅并插值到必要的适当点数，以便在体内频率捕获步骤两个周期（参见步骤 1.2）。
   2. 通过预先确定的长度偏移拉伸后，重新调整步幅以在"零应变"（例如，L₀ 或 95% L₀）开始和停止（参见步骤 3.3）。
   3. 如有必要，"缩放"选定的步幅，用作鼠标 EDL 中应变变化的输入（参见讨论部分）。要进行缩放，请选择小鼠 EDL 可以拉伸而不会损坏的长度偏移（例如，我们通常将小鼠 EDL 拉伸 10% L₀，而不管体内物种如何）。这可能需要根据初步结果进行更改（请参阅步骤 3.3）。

图 1：体内整个试验的长度随时间的变化。 长度 （mm） 与大鼠 MG 的时间的关系。步幅由圆圈划定，从最短长度到最短长度，被认为是单步幅。请点击这里查看此图的较大版本。

2. 评估小鼠肌肉离体的最大等长力

1. 设置设备和手术。
   注意：有关离体工作循环所需设备的解释，请参阅讨论部分。
   1. 通过将 oxytube 针阀插入水套组织浴来制备组织器官浴（参见材料表）。将氧气管连接到含有 95% 0_2-5% CO₂ 的气瓶上。允许 20 psi 填充水套组织浴。
   2. 通过在手术区域附近将额外的氧气管从气体管线连接到装满 Krebs-Henseleit 溶液（步骤 2.1.3）的结晶皿来准备手术区域。这将用于在手术期间和手术后保持肌肉通气和水分。
      注意：如果一次从鼠标中取出多块肌肉，肌肉也可以在这种充气溶液中储存长达 4 小时。
   3. 准备 1 L Krebs-Henseleit 溶液，其中含有（以 mmol ^l-1 为单位）：NaCl （118）;氯化钾 （4.75）;硫酸镁₄ （1.18）;KH₂PO₄ （1.18）;CaCl₂ （2.54）;在室温和 pH 值为 7.4 下使用 HCl 和 NaOH 测定葡萄糖 （10.0）（参见材料表）。处理 HCl 和 NaOH 时，请佩戴适当的护目镜和手套等个人防护装备。
   4. 在室温和 pH 值为 7.4 下用 Krebs-Henseleit 溶液填充浴液。将肌肉和钩子完全浸入溶液中。
   5. 打开所有设备;双模式肌肉杠杆系统、刺激器和信号接口（DAQ 板）（参见材料表）。
2. EDL 肌肉解剖。
   1. 对小鼠进行深度麻醉，然后通过颈椎脱位进行安乐死。将鼠标置于右侧或左侧卧位，伸展上后肢，脚趾接触解剖板。去除从脚踝到膝关节上方的毛皮。
   2. 用镊子将皮肤搭成帐篷，从踝关节到臀部区域切割。一旦肌肉暴露出来，就像裤子的"下摆"一样切开脚踝。向上拉动皮肤，使腿部肌肉更清晰。
   3. 找到分隔胫骨前肌 （TA） 和腓肠肌的筋膜线，使用解剖剪刀分开以露出膝肌腱。在两条裸露的膝关节肌腱之间放置解剖剪刀。剪刀会"卡住"裸露的膝肌腱下方的口袋。Blunt 解剖一个"口袋"，同时将剪刀从腿上拉开，直到剪刀到达脚踝以露出 EDL。
   4. 使用 4-0 号丝绸手术缝合线的预打环结（见材料表），将缝合线的一端系在最靠近膝盖的肌腱下方。在近端肌肉-肌腱交界处上方打一个双方结，不要将其放在肌肉上或包括肌腱。剪开打结。轻轻拉动绑在肌腱上的环，EDL 就会从"口袋"中出来。
   5. 将环粘在解剖区域以在 EDL 中产生张力。在远端肌肉-肌腱交界处使用另一个预先打结的环结打一个双方结，不要将其放在肌肉上或包括肌腱。剪掉靠近鼠标腿的一侧的结，以从鼠标上移除整个 EDL。从肌肉近端和远端的双方结上剪下额外的缝合线，并将肌肉放入手术区域旁边的充气浴中><。 注意：如果将肌肉置于充气浴中，请务必注意哪一侧是近端和/或远端。
   6. 要放置在伺服电机杠杆装置上，请将 EDL 垂直连接到悬挂的铂电极之间。将远端环结连接到固定钩上，并将近端环结连接到连接到伺服电机臂的钩子上。抬起组织浴，将肌肉浸入充气的 Krebs-Henseleit 溶液中。
      注意：浸入水中时，曝气不应干扰肌肉。如果是这样，请降低气体的压力。在开始刺激之前，让肌肉平衡 10 分钟。
3. 测量 EDL 肌肉的最大等长力。
   注意： 有关如何使用 twitch 和 tetanus 测量最大等长力的协议，请参阅表 1。参见补充图 1 以获取作者使用的程序的插图。
   1. 用超最大抽搐刺激肌肉，以确保肌肉在手术过程中没有受损（80 V，1 pps，1ms;表 1;见补充图 2）。如果没有发生损伤，使用肌肉杠杆系统上的长度旋钮找到使用抽搐刺激的肌肉长度，其中主动张力为 ~1V / 0.1271 N，被动张力小于 ~0.1V / 0.01271N。
   2. 以伏特和毫米为单位记录从缝合结到缝合结的肌肉起始长度。将测量值输入程序的校准部分以获取起始长度（参见补充图 1）。
   3. 在 EDL 的最佳长度 （L₀） 处找到超最大抽搐最大等长力（表 1）。从技术上讲不需要休息时间，但在两次刺激之间等待 1 分钟可以稳定被动紧张。记录超最大抽搐的最大长度（以伏特为单位）。这是抽搐的最佳肌肉长度 （L₀）。
   4. 用卡尺测量这个长度的肌肉。测量从缝合结到缝合结的肌肉。一旦找到 L₀，将肌肉缩短回起始长度（主动张力 ~1V / 0.1271 N）。
   5. 找到 EDL 的最大破伤风最大等长力（80 V，180 pps，500 ms;表 1）。记录 L₀ 处超最大破伤风力的长度（以伏特和毫米为单位），并再次用卡尺测量从缝合结到缝合结的纤维。
      注意：以 0.5 V/0.65 mm 的步长增加肌肉长度将导致抽搐和破伤风的 L₀ 更准确。
   6. 求 EDL 的次最大等长力（45 V，110 pps，500ms;表 1）在实验前后为 L₀，以确保刺激方案不会发生疲劳。力量减少 10% 被认为是"疲劳"肌肉。

<表格border="1" fo：keep-together.within-page="1" fo：keep-with-next.within-page="always"> 实验 模拟强度 （V） 脉冲频率 （pps / Hz） 刺激持续时间 （ms） 评论 1. "热身" 80 1 1 将长度增加或减少 0.50 V，以找到 1 V 的无源张力 2. 最佳肌肉长度抽搐 （L0） 80 1 1 增加或减少长度 0.50 V，以找到 ~1 V 的无源张力 3. 最佳肌肉长度破伤风 （L0） 80 180 500 在 0.50 V 更改长度之间休息 3 分钟 4. 实验前次最大值 L0 45 110 500 长度为 L0 时 6. Avatar 实验 45 110 循环使用鼠标 EDL 的代表性长度变化 7. 实验后次最大值 L0 45 110 500 实验后返回 L0 并测量 L0

表 1：刺激协议。 用于寻找超最大和次最大抽搐和破伤风最佳长度的刺激方案。协议因刺激强度、时间和每秒脉冲数而异。

3. 使用选定的体内应变轨迹完成"化身"工作循环技术

1. 设置完成"头像"工作循环技术所需的软件（参见材料表）
   注意：需要一个输入文件（.csv 或类似文件），用于指定每个时间步的肌肉长度（请参阅步骤 1.4）。刺激开始的周期百分比和刺激持续时间的输入是必要的（例如，参见补充图 3）。
2. 完成"头像"工作循环技术。
   注意：虽然我们使用自定义 LabView 程序，但研究人员可以使用任何程序，该程序允许控制伺服电机杆上鼠标 EDL 的长度变化，控制指定时间刺激的开始（% 周期）和持续时间 （ms），以及测量肌肉力量。有关作者使用的程序的说明，请参见补充图 3。
   1. 从步骤 1.4 开始，将具有缩放长度偏移的缩放应变变化上传到程序中。有关"缩放应变变化"的更多信息，请参见步骤 1.4、3.3 和讨论部分。
   2. 如果需要，调整肌肉的起始长度（参见第 3.3 节）。以 V 和 mm 为单位输入起始长度以校准结果（参见补充图 3）。
   3. 使用步骤 1.3 中计算的刺激开始和持续时间。
   4. 以确定的长度偏移运行肌肉，持续两个周期。
   5. 保存数据。如果在同一块肌肉上收集了多个刺激方案，则在每次刺激之间等待 3 分钟。
   6. 使用次极大激活以最佳长度 （L₀） 刺激以确定是否发生了疲劳。如果力量减少超过 10%，则认为肌肉疲劳。刺激方案见表 1。
   7. 从浴缸中取出肌肉。从肌肉上剪掉打结的环，然后将多余的溶液从肌肉上轻拍。称量肌肉。使用标准公式确定生理横截面积：肌肉质量/（L₀*1.06）¹⁹。
3. 调整 "avatar" 工作循环技术的参数（参见 讨论 部分）。
   1. 通过将离体被动张力上升与体内观察到的被动张力上升相匹配来确定起始长度和长度偏移（图 2）.
      注：本研究使用百分比 L₀ 来缩放起始长度 （mm） 和偏移（% L₀;参见步骤 1.4 和讨论部分）。为了将离体小鼠 EDL 的张力升高与体内大鼠 MG 的张力升高相匹配，作者发现 L₀ 的起始长度产生了最佳拟合（图 2）。
   2. 选择三种起始长度（例如，-5% L_{0、L 0} 和 +5% L₀）。以指定的长度偏移（例如，10% L₀）在每个起始长度处执行"avatar"工作循环><。 注意：在目前使用小鼠 EDL 的"头像"实验中，使用了 10% L₀ 的长度偏移。
   3. 以新的起始长度和/或偏移重复，直到离体被动张力上升的速率与体内被动张力上升的速率相似（参见图 2B）。
   4. 根据所用肌肉的纤维类型和激活动力学，增加或减少刺激的持续时间，以优化离体和体内力之间的匹配。因此，可能需要改变刺激的开始和/或持续时间，以最好地匹配"头像"实验期间体内力的产生。
   5. 为了确定这是否必要（参见讨论部分），绘制"头像"和体内肌肉随时间的变化力（图 3），并通过平方目标和"头像"肌肉力量之间的比例相关性来计算决定系数 R²（参见代表结果）。

图 2：匹配的被动张力上升。 显示被动张力的体内和离体上升的工作循环（箭头）。大鼠 MG（黑色）以 2.9 Hz 行走的体内缩放工作循环（数据来自 Wakeling 等人¹⁵）。小鼠 EDL（绿色）以 2.9 Hz 的频率进行离体缩放的工作循环。（A） 小鼠 EDL 肌肉的起始长度为 +5% L₀。（B） 小鼠 EDL 肌肉的起始长度为 L₀。请注意，离体被动张力上升与 A 中的体内张力上升相匹配，但与 B 中的体内张力上升不匹配。较粗的线条表示刺激。请点击这里查看此图的较大版本。

图 3：优化小鼠 EDL 的刺激持续时间以匹配大鼠 MG 的体内力（黑线）。 小鼠 EDL 使用基于 EMG 的刺激（绿色虚线）产生的力比体内力更早减小，这可能是由于与大鼠 MG 相比，小鼠 EDL 的失活速度更快。为了优化体内和离体力之间的拟合，小鼠 EDL 被刺激了更长的时间（绿色实线）。基于 EMG 的刺激 R² = 0.55，优化刺激 R² = 0.91。请点击这里查看此图的较大版本。

结果

"化身"实验的目标是在离体工作循环实验期间尽可能接近地复制体内力的产生和工作输出。本研究选择使用小鼠 EDL 作为大鼠 MG 的"头像"，因为小鼠 EDL 和大鼠 MG 都主要由快肌组成^20，21。两块肌肉都是踝关节 （EDL 踝背屈肌，MG 踝跖屈肌） 的主要移动者，具有相似的笔下角 （小鼠 EDL 12.4 + 2.12°²²，本研究中使用的大鼠 MG 20°¹⁵）。使用两种不同的刺激方案（一种来自测量的 EMG 活动，另一种来自步骤 3.3 中优化），将大鼠 MG^{15 的缩放代表性工作循环与离体"头像"实验（图 4）进行比较。此处提供的 R2 值是使用整个缩放的拉伸缩短周期（2 个周期/条件）计算的，每个周期都有超过 2000 个对应于运动速度的点（步...}

讨论

虽然生物体在景观中无缝移动，但肌肉所经历的潜在负荷和应变却有很大差异 ^1,6,23。在体内运动^1,24和“化身”实验中，肌肉在周期性、非稳定条件下受到次最大刺激。等长力-长度和等渗力-速度关系不太适合预测这些条件下的肌肉力²。了解非稳态应变（即瞬态）和载荷的影响对于预测体内运动过程中的力产生至关重要，因此是开发这些“化身”实验的主要理由²。“阿凡达”实验使我们能够在测量力输出的同时控制肌肉负荷和应变轨迹。“化身”技术研究了肌肉在类似体内条件下的力反应，而不考虑神经控制和肌腱顺应性的混杂因素。为了进行“化身”实验，研究人员需要一个程序，允许肌肉经历规定的长度变化，并能够以不同的起始长度和不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
编织非吸收丝线缝合线 4-0	Mersilk （梅尔丝）	734H
氯化钙二水合物 （CaCl2）	Sigma-Aldrich	1086436	Krebs-Henseleit 溶液
葡萄糖	Sigma-Aldrich	D9434	Krebs-Henseleit 解决方案
HEPES	Sigma-Aldrich	PHR1428	Krebs-Henseleit 溶液
Hydorchloric acid （HCl）	Sigma-Aldrich	1.37055	克雷布斯-亨塞莱特 解决方案
LabView 数据收集	实验室视图
硫酸镁 （MgSO4）	Sigma-Aldrich	M7506	Krebs-Henseleit 溶液
氯化钾 （KCl）	Sigma-Aldrich	P3911	Krebs-Henseleit 溶液
磷酸二氢钾 （KH2PO4）	Sigma-Aldrich	5.43841	Krebs-Henseleit 解决方案
S88	器草	M643H05	可在Ebay上购买
系列300B杠杆系统	Aurora	1200A	包括水套组织浴
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S5761	Krebs-Henseleit 溶液
氯化钠 （NaCl）	Sigma-Aldrich	S9888	Krebs-Henseleit 溶液
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma-Aldrich	S5881	Krebs-Henseleit 溶液
野生型小鼠	Jackson Laboratory	B6C3Fe a/a Ttn mdm/J