流式细胞术分析在测量 3D 脑类器官中多个线粒体参数的应用

Summary

该方案报告了一种使用流式细胞仪和多种抗体同时评估多个线粒体功能参数的独特方法，包括线粒体体积的变化、线粒体呼吸链 （MRC） 复合物亚基的数量和线粒体 DNA （mtDNA） 复制。

Abstract

线粒体功能障碍是许多类型神经退行性变的常见主要或次要因素，线粒体质量、线粒体呼吸链 （MRC） 复合物和线粒体 DNA （mtDNA） 拷贝数的变化经常出现在这些过程中。源自人诱导多能干细胞 （iPSC） 的人脑类器官概括了大脑的三维 （3D） 细胞结构排列，并为在复杂的人类系统中研究疾病机制和筛选新疗法提供了可能性。在这里，我们报道了一种独特的基于流式细胞术的方法，用于测量 iPSC 衍生的皮质类器官中的多个线粒体参数。本报告详细介绍了从 iPSC 生成皮质脑类器官、生成的类器官的单细胞解离、固定、染色和随后的流式细胞术分析以评估多个线粒体参数的方案。用针对 MRC 复合物亚基 NADH 的抗体进行双重染色:泛醌氧化还原酶亚基 B10 （NDUFB10） 或线粒体转录因子 A （TFAM） 与电压依赖性阴离子选择性通道 1 （VDAC 1） 一起允许评估每个线粒体中这些蛋白质的数量。由于 TFAM 的量对应于 mtDNA 的量，因此它提供了每个线粒体含量的 mtDNA 拷贝数的间接估计。整个过程可以在 2-3 小时内完成。至关重要的是，它允许同时量化多个线粒体参数，包括相对于线粒体质量的总水平和特定水平。

Introduction

线粒体是必不可少的细胞器，也是三磷酸腺苷 （ATP） 产生的主要部位。线粒体除了为细胞提供能量外，还参与多种细胞过程，包括细胞信息传递、细胞分化和细胞凋亡，具有调节细胞生长和细胞周期的能力。在各种神经退行性疾病中已发现线粒体功能的变化，包括帕金森病 （PD）^1,2、阿尔茨海默病 （AD）³ 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）⁴。线粒体功能障碍在衰老过程中发挥作用，积累体细胞 mtDNA 突变和呼吸链功能下降⁵。

神经退行性变中会发生各种类型的线粒体功能障碍，在研究疾病机制和测试潜在治疗方法时，测量此类变化的能力非常有用。此外，建立合适的体外模型系统来概括人脑细胞中的疾病对于更好地了解疾病机制和开发新疗法至关重要。来自神经退行性疾病患者的 iPSC 已被用于产生表现出线粒体损伤的多样化脑细胞 6,7,8,9。源自 iPSC 的 3D 脑类器官的开发是疾病建模的重要一步。这些 iPSC 衍生的脑类器官提供了复杂性并包含患者自身的遗传背景，从而提供了一个更准确地反映患者大脑病理的疾病模型。

虽然已经对使用 iPSC 来源的脑类器官的线粒体研究进行了一些研究 10,11,12，^但用于确定 iPSC 来源的脑类器官中多个线粒体功能参数的方便可靠的技术仍然有限。流式细胞术提供了一种强大的工具，可以在单细胞水平上测量线粒体参数，正如我们之前所证明的那样¹³。本研究提供了从 iPSC 生成皮质类器官的详细方案，并结合了一种基于流式细胞术的新型方法，可同时测量多个线粒体参数，包括线粒体质量、呼吸链复合物亚基和 mtDNA 拷贝数（图 1）。重要的是，通过使用线粒体质量作为分母，这些协议允许测量每个线粒体单位的总水平和特定水平。

Protocol

1. iPSC 分化为皮质类器官

1. 基质涂层板的制备
   1. 将小瓶市售的基底膜基质在冰上解冻过夜。在冷的 Advanced Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 DMEM/F12（终浓度为 1%）中以 1:100 稀释。制作等分试样并将其储存在 -20 °C（参见 材料表）。
   2. 在 4 °C 下解冻膜基质溶液（保持低温）并包被所需数量的孔（6 孔板中的一个孔为 1 mL）。在 37 °C 孵育 1 小时。
   3. 从培养箱中取出板，使其达到室温 （RT）（放置一个小时）。
      注意:板可以在冰箱中储存长达 2 周（记得将其取出并在 RT 中加热当天所需的包被孔，直到使用前摸起来不再凉爽）。建议在 3 天内使用板。如需长期储存，向包被板中加入 1 mL Essential 8 培养基（参见 材料表），以避免凝胶变干。

2. 用于 iPSC 培养的 Essential 8 （E8） 培养基的制备

1. 在无菌环境中，通过将 E8 基础培养基与 E8 添加剂混合来制备 E8 培养基（参见 材料表）。这可以在 4 °C 下储存 2 周。
   注:在制备完全培养基之前，将冷冻 E8 补充剂在 4 °C 下解冻过夜。不建议在 37 °C 下解冻冷冻补充剂;使用 E8 培养基 2 周。使用前，将当天所需的 E8 培养基在 RT 中加热，直到摸起来不再凉爽。

3. iPSC 的传代培养

1. 在 RT 中或在 37 °C 的培养箱中预热基质包被的板 20-30 分钟。在 RT 下预热所需的 E8 培养基量。
2. 用移液管吸出培养基。
3. 用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）（DPBS-/-）（6 孔板中的一个孔为 4 mL）冲洗 iPSC（参见材料表）。
4. 添加乙二胺四乙酸 （EDTA） （0.5 mM）（6 孔板中的一个孔为 1 mL）。在 37 °C 下孵育，直到菌落的边缘开始从板中分离（通常为 3-5 分钟）。
5. 吸出解离溶液。
6. 加入预热的 E8 培养基（6 孔板中的一个孔为 4 mL），并使用高压分离 iPSC 集落。
7. 转移到基质包被的 6 孔板中的两个不同孔中（6 孔板中的一个孔为 2 mL），并在 37 °C 下孵育。
   注意:在将板放入培养箱之前轻轻摇晃。分光比可以是 1:2-1:4。
8. 每天交换媒体，直到菌落获得 80% 的汇合度，具有良好的大小和连接。
   注:监测适当大小的菌落，通常以明确的圆形和直径范围为 0.5 至 1 mm。菌落应表现出致密、紧凑的结构，边界清晰、光滑。

4. 拟胚体 （EB） 形成和神经诱导

1. 通过组合 材料表中列出的成分来制备神经诱导培养基 （NIM）。
2. 吸出培养基并用 DPBS -/-（6 孔板中每孔 4 mL）冲洗细胞。
3. 在孔中加入预热的 Accutase（6 孔板中每孔 1 mL）（参见 材料表），并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
4. 使用 1000 μL 移液器吸头轻轻上下移液 3 至 4 次。
5. 用 2 mL DMEM 和 10% 胎牛血清 （FBS） 中和，并在室温下以 600 x g 离心含有细胞的 15 mL 锥形管 5 分钟。吸出上清液。
6. 通过轻轻上下吹打直至单细胞托盘来重悬细胞沉淀。
7. 在自动细胞计数仪中使用台盼蓝¹⁴ 计数并计算活细胞浓度。
8. 计算稀释比并在 NIM 中稀释细胞，使最终细胞浓度为 60,000 个活细胞/mL。
9. 将 Rho 相关蛋白激酶 （ROCK） 抑制剂 Y-27632（终浓度 50 μM）（参见 材料表）添加到细胞悬液中并轻轻混合。
10. 将 150 μL 单细胞悬液添加到超低吸附 96 孔板的每个孔中（参见 材料表）并放入培养箱中。设置为第 0 天。
11. 第 1 天，检查每个孔中的细胞和 EB 形式。
    注:根据它们在显微镜下明亮、球形和半透明的外观、它们保持自由漂浮和分离的能力以及不存在死细胞（表现为黑点）来评估 EB 的成功形成。
12. 第 2 天，小心地从每个孔中取出 75 μL 培养基，并向每个孔中加入 150 μL NIM 和 50 μM Y-27632。
13. 在第 4 天、第 6 天和第 8 天，从每个孔中取出 100 μL 培养基，并向每个孔中加入 150 μL NIM。

5. 皮质类器官的产生

1. 通过组合 材料表中列出的组分来制备不含维生素 A （NDM-） 的神经分化培养基。
2. 第 10 天，使用 5 mL 移液器将 EB 从超低吸附 96 孔板转移到超低吸附 6 孔板。小心地将 8 个 EB 转移到每个孔中（图 2）。向每个孔中加入 5 mL NDM-。
3. 将板放在培养箱内的轨道摇床上，然后以 80 rpm 的速度开始旋转。
4. 在第 12 天、第 14 天和第 16 天，吸出 3 mL 旧培养基后，用 4 mL 替换 NDM-。

6. 皮质类器官的成熟和长期培养

1. 用维生素 A （NDM+） 和脑源性神经营养因子 （BDNF） 制备神经分化培养基。有关详细信息，请参见 材料表。
2. 第 18 天，去除 3 mL 培养基并添加 4 mL NDM+。
3. 将板放回旋转培养物中。
4. 每 4 天喂食一次，并将分化的皮质类器官维持在 NDM+ 中直至使用。25-40 天龄的皮质类器官用于下游分析。
   注意:皮质类器官可以维持更长时间（长达 3-4 个月）;但由于缺乏营养交换，细胞活力会下降。

7. 通过免疫细胞化学和免疫荧光染色进行细胞表征

1. 使用 1000 μL 移液器轻轻地从培养基中收集类器官，并将其轻轻放置在标准显微镜载玻片上含有最少培养基的培养基上。
2. 在 RT 下完全干燥。加入 4% 多聚甲醛 （PFA）（每个样品 300 μL），持续 30 分钟。去除 PFA，然后用 PBS 冲洗两次。
   注意:PFA 有毒，怀疑具有致癌性。避免接触皮肤和眼睛，并在化学通风橱下处理。
3. 向载玻片中加入 30% 蔗糖溶液（每个样品 300 μL），并在 4 °C 下孵育过夜。
4. 用含有PBS（含Ca^{2 +} / Mg^{2 +}），0.3%Triton X-100和10%正常山羊血清的封闭缓冲液（BB）（每个样品300μL）封闭和透化类器官，在室温下放置2小时（或在4°C下过夜）。用疏水屏障笔勾勒出类器官的轮廓，以将缓冲液保持在载玻片上。
5. 将样品与一抗叠加在封闭缓冲液（每个样品 300 μL）、抗 SRY（性别决定区 Y）-盒 2（SOX2,1:100）和抗神经标志物块茎蛋白 β III（Tuj1,1:1000）中，并在 4°C 下避光孵育过夜（参见 材料表）。
6. 在 PBS 中洗涤 3 小时，在轻柔的摇动平台上更换 2 至 3 次缓冲液。
7. 与二抗（每个样品 300 μL）、抗 Alexa 面粉 488 （1:800） 和抗 Alexa 面粉 594 （1:800） 一起在加湿暗室中于 4 °C 孵育过夜。同时加入 Hoechst 33342 （1:5000） 核染色剂（参见 材料表）。
8. 吸出抗体并用 PBS 快速冲洗，然后在 4 °C 下加入含有 0.01% NaAzide 的 PBS 1-2 天以防止污染。
9. 吸出 PBS 并去除多余的溶液。用安装介质安装类器官（参见 材料表），然后添加盖玻片。避免形成气泡，并在室温的暗室中放置至少 12 小时，以使封片剂完全聚合。
   注意:样品现在可以在荧光显微镜下进行想象。

8. 皮质类器官的解离

1. 在 50 mL 离心管中加入 30 mL DPBS -/-。
2. 使用 10 mL 移液器轻轻收集管中的脑类器官。一次染色至少使用 3 个类器官，并且它们应超过 25 天但少于 40 天。
3. 沉淀类器官约 5 分钟。请勿离心。
4. 吸出 DPBS 并在试管中加入 2 mL 预热的 Accutase。将样品在 37 °C 的水浴中孵育 5 分钟。
5. 使用 1000 μL 移液器吸头轻轻研磨 15 次，不产生气泡。将样品在 37 °C 下在水浴中再孵育 5 分钟。
6. 使用 1000 μL 移液器吸头轻轻解离 15 次，不产生气泡（图 3A）。
   注:如果仍有一些未解离的细胞，请将未解离的细胞转移到新的 50 mL 离心管中，然后在 37 °C 水浴中再孵育 5 分钟。然后使用 1000 μL 移液器吸头轻轻解离 20 次。
7. 用 4 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中和，并在室温下以 600 x g 离心含有细胞的 15 mL 锥形管 5 分钟。
8. 吸出上清液，并使用 1000 μL 移液器吸头用 200 μL DPBS 重悬 10 次，而不会产生气泡。
9. 加入 200 μL DPBS，在 DPBS 中制备总体积为 400 μL 的细胞悬液。
10. 用过滤器或过滤管过滤（使用 35 或 40 μm 过滤器，并在使用过滤器前用 DPBS 冲洗过滤器）。
11. 将一半的溶液分装在试管中，用作未染色的样品。

9. 固定细胞中 MRC 复合物亚基和 TFAM 的流式细胞术测量

1. 添加活和死 （L/D） 染色染料 （1:1000）（参见 材料表）（使用远红或近红外，取决于流式细胞术标记物的设置）。
   注:如果打开用于 L/D 染料的新样品瓶，则加入 50 μL DMSO 进行复溶，并制成 10 μL 等分试样以将其储存在 -20 °C 下。
2. 在 RT 中保持黑暗 30 分钟。添加 40 mL DPBS -/-。以 600 x g 离心 5 分钟。
3. 弃去上清液后重悬至单细胞悬液中。
4. 在 -20 °C 下用 1 mL 冰冷的 90% 甲醇固定和透化细胞 20 分钟。
5. 将样品封闭在 1 mL 封闭缓冲液中，其中含有 0.3 M 甘氨酸、5% 山羊血清和 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）溶液。
6. 用 20 mL 含 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）和 0.2% BSA 的流式缓冲液洗涤一次或两次。
7. 添加与 Alexa Fluor 405 （1:100） 偶联的抗 NDUFB10抗体、与 Alexa Fluor PE 偶联的抗 VDAC 1 （1:100） 和与 Alexa Fluor 488 （1:200） 偶联的抗 TFAM 抗体 30 分钟（参见 材料表）。
8. 用 20 mL 流式缓冲液洗涤。
9. 吸出并留下约 100 μL，然后将细胞沉淀重新溶于 300 μL 流式缓冲液中。
10. 将细胞转移到 1.5 mL 流式管中。避光和冰块。
11. 在流式细胞仪上分析（参见 材料表）。使用 450/50 带通滤光片检测抗 NDUFB10-Alexa 405、使用 530/30 带通滤光片的 TFAM-Alexa 488、使用 670/14 带通滤光片的 VDAC 1-Alexa 647 和 780/60 带通滤光片中的 L/D 染料的信号（图 3B）。

10. 流式细胞术采集和分析

1. 使用对照类器官的未染色和单染色样品来设置细胞仪设置的电压。
2. 使用未染色的对照管，根据细胞群的大小和粒度设置前向散射区 （FSC-A） 和侧向散射区 （SSC-A） 散点图（图 4A）。
3. 门出碎片，从 FSC-A 和 SSC-A 图中选择活细胞。使用侧向散射高度 （SSC-H） 与选门双合体SSC-A 图（图 4B）。
4. 通过切换到 APC-cy7 vs，根据 L/D 染料的染色选择活细胞。FSC-A 图（图 4C）。
5. 使用每条线的未染色样本，在 FSC-A 与的主要事件种群上方绘制一个门。荧光染料通道 （FITC， APC， BV 421） 图。
6. 设置补偿流式细胞仪¹⁵。
7. 使用同型对照进行阴性对照以观察背景染色。
8. 执行数据采集。
   1. 通过切换到 APC-cy7 vs，根据 L/D 染料的染色选择活细胞。FSC-A 图（图 4C）。
   2. 使用未染色的阴性对照。然后，在检查 FSC-A 与 FSC-A 时。荧光染料通道 （FITC， APC， BV 421） 图，在单细胞事件的主要群体上方建立了一个门（图 4D-F）。
9. 使用 FlowJo 软件进行数据分析（参见 材料表）。
   1. 将门的位置复制到染色的细胞样品上。记录表现出阳性染色的细胞数量。
   2. 对于每个目标群体，评估绘制在直方图的 x 轴上的不同通道（FITC、APC、BV 421）的中位荧光强度 （MFI） 以识别线粒体信号。复合物 I 亚基 NDUFB10 和 TFAM 的特异性值可以通过将复合物表达或 TFAM 的 MFI 除以线粒体质量指示剂 VDAC 1 来确定。

Results

图 1 提供了分化过程和流式细胞术分析策略的图示表示。将人 iPSC 在非贴壁 96 孔板中培养以形成 EB，然后转移到非贴壁 6 孔板以获得完全生长的皮质类器官。在用神经元¹⁶ 和神经胶质标志物¹⁷ 进行免疫染色后，使用共聚焦显微镜验证类器官的细胞组成。类器官被解离成单个细胞，以促进基于流式细胞术的单个细胞中多个线粒体参数的测量。在该方案中，多种染色策略用于获取和分析线粒体质量的参数、MRC 复合物 I 亚基和 TFAM 的量，以及相对 mtDNA 拷贝数的间接测量。该协议提供了解离类器官和获取流式细胞术数据的步骤。

使用 Park、IH 等人 ¹⁸ 的先前方案，通过双重 SMA 和 MAD 相关蛋白 （SMAD） 抑制和无翼/整合 （Wnt） 抑制诱导前神经外胚层命运，从 iPSC 产生皮质类器官。如图 2A

Discussion

提出了一种方案，用于从人 iPSC 生成皮质脑类器官，并用于对从这些类器官分离的单细胞中的线粒体参数进行流式细胞术分析。通过共聚焦显微镜验证类器官的细胞组成，免疫组织化学染色神经元和神经胶质细胞标志物。基于流式细胞术的策略与抗 NDUFB10、VDAC 1 和 TFAM 共染色已被证明可以测量相对于细胞中线粒体数量的复合物 I 和 mtDNA 的特定水平。该方案适用于测量所有类型的脑样细胞中的线粒体，可用于研究线粒体功能障碍疾病。

该协议允许使用双重 SMAD 和 Wnt 抑制的组合来生成脑类器官。与双重 SMAD 抑制相比，这种三重抑制产生更均匀的皮质 NSC 谱²¹。一些细胞系可能需要 10% 热灭活的 FBS 在 NIM 中，尽管没有使用 FBS。为确保成功分化，iPSC 应在铺板形成 EB 之前未分化。

将脑类器官分离成活的单细胞的综合方案非常重要，因为它是流式细胞术和单细胞 RNA 测序等程序之前的关键...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
流式细胞术
抗 DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS 生物制剂	NBP2-72915AF405
抗 VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz 技术	sc-390996
抗 TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D 可固定近红外死细胞染色试剂盒	Life technologies	L10119
用于免疫荧光染色
的抗体 Tuj1	Abcam	ab78078
抗 SOX2	Abcam	ab97959
抗 Alexa 面粉 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
抗 Alexa 面粉 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
商业细胞
AG05836 （RRID：CVCL_2B58）			由基础医学科学研究所的 Gareth John Sullivan 提供挪威奥斯陆大学
Essential 8 培养基（iPSC 培养基）
Essential 8 基础培养基	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8补充剂（50x） 2% （v/v）	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Store在4 °C 并在使用前预热至 RT。
Instruments
Heracell 150i CO2 培养箱	Fisher Scientific，美国
摇床 - SSM1、SSL1	Stuart 设备，英国
CCD 显微镜相机 徕卡 DFC3000 G	徕卡显微系统公司，德国
水浴 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 赠款仪器	美国 Grant Instruments
液体抽吸系统 BVC 控制器	Vacuubrand，德国
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜	Leica Microsystems，德国
50 mL 猎鹰管	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences，美国
Flowjo 采样器 分析	FlowJo LLC，美国
10 mL 移液器	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1、10、100、1000 mL 移液器	Sigma-Aldrich
40 µm 细胞计数仪	Sigma-Aldrich	CLS431750
超低吸附 96 孔板	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific
神经分化培养基 （NDM+）
DMEM/F12	生命技术	11330032
Neurobasal 培养基	生命技术	2110349
谷氨酰胺补充剂 1% （v/v）	生命技术	35050
N2 补充剂 0.5% （v/v）	生命技术	17502-048
B27 补充剂 1% （v/v）	生命技术	17504-044
&β;-巯基乙醇 50 &微量;M	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
抗坏血酸 200 &微量;M	Sigma-Aldrich	A92902
商店在 4°C 长达 2 周
<强>神经分化培养基减去 viatmin A （NDM-）
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal 培养基	Life technologies	2110349
Glutamax 补充剂 1% （v/v）	Life technologies	35050
N2 补充剂 0.5% （v/v）	Life technologies	17502-048
B27 增刊 W/O vit.A 1% （v/v）	Life technologies	12587010
β-巯基乙醇 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
商店位于 4°C 长达 8 天
神经诱导培养基 （NIM）
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout 血清替代物 15% （v/v）	Life technologies	10828028
Glutamax 补充剂 1% （v/v）	Life technologies	35050
β-巯基乙醇 100 & 微量;M	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
商店位于 4°C 长达 10 天
<强>中和培养基
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
<强>其他试剂
DPBS（不含 Ca2+/Mg2+）	Thermo Fisher Scientific	14190250
牛血清 白蛋白	Europa 生物制品	EQBAH62-1000
Accutase	Life 技术	A11105-01
Geltrex	Life 技术	A1413302
EDTA	Life 技术	15575038
Advanced DMEM / F12	Life 技术	12634010
神经组织解离试剂盒	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 二盐酸盐岩石抑制剂	Biotechne Tocris	1254
氟安装-G™封固剂	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908