方法文章

流式细胞术分析在测量 3D 脑类器官中多个线粒体参数的应用

DOI：

10.3791/65621

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2023年8月4日

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1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

本文内容

摘要

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该方案报告了一种使用流式细胞仪和多种抗体同时评估多个线粒体功能参数的独特方法，包括线粒体体积的变化、线粒体呼吸链 （MRC） 复合物亚基的数量和线粒体 DNA （mtDNA） 复制。

摘要

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线粒体功能障碍是许多类型神经退行性变的常见主要或次要因素，线粒体质量、线粒体呼吸链 （MRC） 复合物和线粒体 DNA （mtDNA） 拷贝数的变化经常出现在这些过程中。源自人诱导多能干细胞 （iPSC） 的人脑类器官概括了大脑的三维 （3D） 细胞结构排列，并为在复杂的人类系统中研究疾病机制和筛选新疗法提供了可能性。在这里，我们报道了一种独特的基于流式细胞术的方法，用于测量 iPSC 衍生的皮质类器官中的多个线粒体参数。本报告详细介绍了从 iPSC 生成皮质脑类器官、生成的类器官的单细胞解离、固定、染色和随后的流式细胞术分析以评估多个线粒体参数的方案。用针对 MRC 复合物亚基 NADH 的抗体进行双重染色:泛醌氧化还原酶亚基 B10 （NDUFB10） 或线粒体转录因子 A （TFAM） 与电压依赖性阴离子选择性通道 1 （VDAC 1） 一起允许评估每个线粒体中这些蛋白质的数量。由于 TFAM 的量对应于 mtDNA 的量，因此它提供了每个线粒体含量的 mtDNA 拷贝数的间接估计。整个过程可以在 2-3 小时内完成。至关重要的是，它允许同时量化多个线粒体参数，包括相对于线粒体质量的总水平和特定水平。

引言

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线粒体是必不可少的细胞器，也是三磷酸腺苷 （ATP） 产生的主要部位。线粒体除了为细胞提供能量外，还参与多种细胞过程，包括细胞信息传递、细胞分化和细胞凋亡，具有调节细胞生长和细胞周期的能力。在各种神经退行性疾病中已发现线粒体功能的变化，包括帕金森病 （PD）1,2、阿尔茨海默病 （AD）3 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）4。线粒体功能障碍在衰老过程中发挥作用，积累体细胞 mtDNA 突变和呼吸链功能下降5。

神经退行性变中会发生各种类型的线粒体功能障碍，在研究疾病机制和测试潜在治疗方法时，测量此类变化的能力非常有用。此外，建立合适的体外模型系统来概括人脑细胞中的疾病对于更好地了解疾病机制和开发新疗法至关重要。来自神经退行性疾病患者的 iPSC 已被用于产生表现出线粒体损伤的多样化脑细胞 6,7,8,9。

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方案

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1. iPSC 分化为皮质类器官

  1. 基质涂层板的制备
    1. 将小瓶市售的基底膜基质在冰上解冻过夜。在冷的 Advanced Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 DMEM/F12（终浓度为 1%）中以 1:100 稀释。制作等分试样并将其储存在 -20 °C（参见 材料表）。
    2. 在 4 °C 下解冻膜基质溶液（保持低温）并包被所需数量的孔（6 孔板中的一个孔为 1 mL）。在 37 °C 孵育 1 小时。
    3. 从培养箱中取出板，使其达到室温 （RT）（放置一个小时）。
      注意:板可以在冰箱中储存长达 2 周（记得将其取出并在 RT 中加热当天所需的包被孔，直到使用前摸起来不再凉爽）。建议在 3 天内使用板。如需长期储存，向包被板中加入 1 mL Essential 8 培养基（参见 材料表），以避免凝胶变干。

2. 用于 iPSC 培养的 Essential 8 （E8） 培养基的制备

  1. 在无菌环境中，通过将 E8 基础培养基与 E8 添加剂混合来制备 E8 培养基（参见 材料表

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结果

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图 1 提供了分化过程和流式细胞术分析策略的图示表示。将人 iPSC 在非贴壁 96 孔板中培养以形成 EB，然后转移到非贴壁 6 孔板以获得完全生长的皮质类器官。在用神经元16 和神经胶质标志物17 进行免疫染色后，使用共聚焦显微镜验证类器官的细胞组成。类器官被解离成单个细胞，以促进基于流式细胞术的单个细胞中多个线粒体参数的测量。在该方案中，多种染色策略用于获取和分析线粒体质量的参数、MRC 复合物 I 亚基和 TFAM 的量，以及相对 mtDNA 拷贝数的间接测量。该协议提供了解离类器官和获取流式细胞术数据的步骤。

使用 Park、IH 等人 18 的先前方案，通过双重 SMA 和 MAD 相关蛋白 （SMAD） 抑制和无翼/整合 （Wnt） 抑制诱导前神经外胚层命运，从 iPSC 产生皮质类器官。如图 2A

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讨论

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提出了一种方案，用于从人 iPSC 生成皮质脑类器官，并用于对从这些类器官分离的单细胞中的线粒体参数进行流式细胞术分析。通过共聚焦显微镜验证类器官的细胞组成，免疫组织化学染色神经元和神经胶质细胞标志物。基于流式细胞术的策略与抗 NDUFB10、VDAC 1 和 TFAM 共染色已被证明可以测量相对于细胞中线粒体数量的复合物 I 和 mtDNA 的特定水平。该方案适用于测量所有类型的脑样细胞中的线粒体，可用于研究线粒体功能障碍疾病。

该协议允许使用双重 SMAD 和 Wnt 抑制的组合来生成脑类器官。与双重 SMAD 抑制相比，这种三重抑制产生更均匀的皮质 NSC 谱21。一些细胞系可能需要 10% 热灭活的 FBS 在 NIM 中，尽管没有使用 FBS。为确保成功分化，iPSC 应在铺板形成 EB 之前未分化。

将脑类器官分离成活的单细胞的综合方案非常重要，因为它是流式细胞术和单细胞 RNA 测序等程序之前的关键.......

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披露

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作者没有什么可披露的。

致谢

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我们衷心感谢挪威奥斯陆大学基础医学科学研究所的 Gareth John Sullivan 慷慨地为我们提供 AG05836 （RRID:CVCL_2B58） 细胞系。我们衷心感谢挪威卑尔根大学分子成像中心、流式细胞术核心设施。这项工作得到了以下资金的支持:KL 得到了卑尔根大学 Meltzers Høyskolefonds（项目编号:103517133）和 Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat（项目编号:103816102）的部分支持。L.A.B 得到了挪威研究委员会（项目编号:229652）、Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 和 Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
流式细胞术
抗 DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS 生物制剂NBP2-72915AF405
抗 VDAC1 Alexa Fluor 647Santa cruz 技术sc-390996
抗 TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L/D 可固定近红外死细胞染色试剂盒Life technologiesL10119
用于免疫荧光染色
的抗体 Tuj1Abcamab78078
抗 SOX2 Abcamab97959
抗 Alexa 面粉 488Thermo Fisher ScientificA28175
抗 Alexa 面粉 594Thermo Fisher ScientificA-21442
商业细胞
AG05836 （RRID：CVCL_2B58）由基础医学科学研究所的 Gareth John Sullivan 提供挪威奥斯陆大学
Essential 8 培养基（iPSC 培养基）
Essential 8 基础培养基 Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8补充剂（50x） 2% （v/v）Thermo Fisher ScientificA1517101
Store在4 °C 并在使用前预热至 RT。
Instruments
Heracell 150i CO2 培养箱Fisher Scientific，美国
摇床 - SSM1、SSL1Stuart 设备，英国
CCD 显微镜相机 徕卡 DFC3000 G徕卡显微系统公司，德国
水浴 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 赠款仪器美国 Grant Instruments
液体抽吸系统 BVC 控制器Vacuubrand，德国
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜Leica Microsystems，德国
50 mL 猎鹰管Sigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences，美国
Flowjo 采样器 分析FlowJo LLC，美国
10 mL 移液器Sigma-AldrichSIAL1100
1、10、100、1000 mL 移液器Sigma-Aldrich
40 µm 细胞计数仪Sigma-AldrichCLS431750
超低吸附 96 孔板S-BIOMS-9096UZ
Countess II 自动细胞计数仪Thermo Fisher Scientific
神经分化培养基 （NDM+）
DMEM/F12生命技术11330032
Neurobasal 培养基生命技术2110349
谷氨酰胺补充剂 1% （v/v）生命技术35050
N2 补充剂 0.5% （v/v）生命技术17502-048
B27 补充剂 1% （v/v）生命技术17504-044
&β;-巯基乙醇 50 &微量;MSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mLPeprotech450-02
抗坏血酸 200 &微量;MSigma-Aldrich A92902
商店在 4°C 长达 2 周
<强>神经分化培养基减去 viatmin A （NDM-）
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasal 培养基Life technologies2110349
Glutamax 补充剂 1% （v/v）Life technologies35050
N2 补充剂 0.5% （v/v）Life technologies17502-048
B27 增刊 W/O vit.A 1% （v/v）Life technologies12587010
β-巯基乙醇 50 µMSigma-aldrichM3148
商店位于 4°C 长达 8 天
神经诱导培养基 （NIM）
DMEM/F12Life technologies11330032
Knockout 血清替代物 15% （v/v）Life technologies10828028
Glutamax 补充剂 1% （v/v）Life technologies35050
β-巯基乙醇 100 & 微量;MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 µMTocris1614
XAV939 2 µMSigma-AldrichX3004
商店位于 4°C 长达 10 天
<强>中和培养基
IMDMLife technologies21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
<强>其他试剂
DPBS（不含 Ca2+/Mg2+）Thermo Fisher Scientific14190250
牛血清 白蛋白Europa 生物制品EQBAH62-1000
AccutaseLife 技术A11105-01
GeltrexLife 技术A1413302
EDTALife 技术15575038
Advanced DMEM / F12Life 技术12634010
神经组织解离试剂盒Miltenyi biotec130-092-628
Y-27632 二盐酸盐岩石抑制剂Biotechne Tocris1254
氟安装-G™封固剂SouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908
中使用的抗体轨道

参考文献

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  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 59....

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