通过改进采样技术和组织学表征提高前列腺肿瘤生物样本库的可靠性

摘要

该协议描述了一种促进从根治性前列腺切除术标本收集样本的方法。目标是根据解剖病理学标准对标本中的组织样本进行映射、表征和微观-宏观解剖，然后再将它们储存在生物样本库中。

摘要

获取新鲜且表征良好的肿瘤组织样本对于进行高质量的"组学"研究至关重要。然而，由于前列腺癌 （PC） 的独特性质以及与该肿瘤相关的高度异质性，它在前列腺癌 （PC） 的背景下可能特别具有挑战性。另一方面，在样本储存前对样本进行组织病理学表征而不引起显着的组织改变也是一个有趣的挑战。在这种情况下，我们提出了一种基于解剖病理学标准获取、映射、表征和显微解剖切除前列腺组织的新方法。

与以前发表的方案不同，该方法减少了前列腺标本组织病理学分析所需的时间，而不会影响其结构，这对于评估手术边缘至关重要。此外，它还能够对新鲜前列腺组织样本进行描绘和微观-宏观解剖，重点关注由病理标准定义的组织学肿瘤区域，如格里森评分、前体病变（高级别前列腺上皮内瘤变 - PIN）和炎症性病变（前列腺炎）。然后将这些样本储存在生物样本库中，用于后续研究分析。

引言

前列腺癌 （PC） 是男性第 2 大常见癌症，也是全球第^{5 大死}因¹。患者的治疗和预后取决于肿瘤的分期和分级（Gleason评分），与高Gleason分级和转移性肿瘤（31^%）相比，局限性和低级别肿瘤（Gleason 6级）（99%）的5年生存率更高2。

PC 局部复发和治疗失败与该肿瘤³ 型的特征性高遗传瘤内异质性有关。此外，PC 被认为是一种多灶性疾病，具有多个肿瘤病灶表现出不同的形态学、组织学和分子学特征⁴，这些病灶可能独立起源或源自共同的肿瘤细胞祖先⁵。先前的研究表明，基于特定的遗传驱动因素，患者的肿瘤进化存在差异，这些遗传驱动因素可以促进转移或将细胞谱系限制在前列腺⁵。因此，不同肿瘤病灶的分子表征不仅对于提供更准确的诊断和预后至关重要，而且对于为患者定制有效和个性化的治疗也至关重要。

在此背景下，生物医学研究和综合多组学方法为将癌症分类为不同的亚型、识别诊断和预后生物标志物以及发现与治疗反应相关的标志物提供了前所未有的机会。此外，这些方法有助于更好地理解这种疾病的生物学特性 ^6,7。生物样本，无论是组织还是生物流体，都可以使用各种多组学平台（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）进行分析，以揭示癌症病理生理学的生物学特征，从而解决当前与遗传和表型异质性相关的限制⁶.然而，重要的是要考虑到，从组学研究中获得的数据质量取决于从肿瘤收集的样本的质量、它们的准确表征以及随后的处理和储存⁸.

在这种情况下，由于成功取样肿瘤的困难，获得新鲜的 PC 组织进行研究提出了方法学挑战⁹.以前的方法涉及根治性前列腺切除术后的随机抽样，结果很差¹⁰。然而，最近的方法结合了基于磁共振成像 （MRI） 和活检数据的靶向方案，从而提高了肿瘤样本采集的疗效¹¹。

另一方面，在不发生重大组织改变的情况下，在储存样品之前对样本进行组织病理学表征也提出了一个有趣的挑战。因此，在许多情况下，样本的组织病理学测定是在分析样本后进行的（例如，HR ¹H NMR 代谢组学分析）¹²。这种做法会带来不必要的费用、时间消耗和大量样本的损失，这些样本最终会被排除在分析之外（例如，经过组织病理学分析后，样本被证明不是肿瘤样本）。在其他情况下，样品的组织病理学表征是在分析之前进行的。事实上，以前的一些研究已经试图标准化方法，以提供来自根治性前列腺切除术标本的代表性高质量研究样本用于基因组学和代谢组学^13,14。然而，与从未经证实的切片（45%）进行采样相比，从已经组织学证实的破坏组织的切片（88%）进行采样效率要高^得多1。

在这里，提出了一种克服这些限制的新方法，旨在获得新鲜且表征良好的PC样品，然后再储存在生物样本库中。这种方法是通过不同临床服务（泌尿科、病理科和拉菲医院生物银行）之间的合作努力开发的。需要强调的是，生物样本库在生物样本的收集、处理、保存和储存方面发挥着至关重要的作用，同时确保样本和数据的高质量，并遵守道德和法律要求 ^8,15,16。

方案

这种方法是通过涉及不同临床服务（泌尿科、病理学和拉菲医院生物银行）的合作努力开发的。该研究是按照机构、国家和国际人类福利指南进行的，并获得了 Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe（西班牙瓦伦西亚）生物医学研究伦理委员会的批准。所有样本均储存在拉菲医院生物样本库（PT13/0010/0026）。整个过程详见 图 1。

图1:整体流程方案。 协议部分中描述的逐步过程的示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.

1. 肿瘤靶向

1. 手术前，利用多参数或双参数磁共振成像（mpMRI 或 bpMRI）^17,18 来定位肿瘤并绘制其在前列腺内的位置。将 MRI 获得的信息与经直肠超声或直肠检查的结果相结合，如果后者产生的结果不一致。
2. 为了增强肿瘤定位，回顾术前超声引导和 MRI 引导的经直肠前列腺活检结果。
   注意:在前列腺癌的诊断程序中，活检 是通过经直 肠通路直接从前列腺进行的。这些活检包括从前列腺进行系统取样（涉及分布在腺体周围的圆柱体）和直接针对 MRI 可疑发现的圆柱体。为了有针对性地提取这些样本，使用经直肠超声，将其与认知方式的 MRI 结果（"认知融合"）或"真正的 MRI-超声融合软件"（如果有）相结合。

2.根治性前列腺切除术和前列腺收集术

1. 按照 Huynh 等人 ¹⁹ 概述的步骤，通过经腹膜方法进行标准化的机器人辅助根治性前列腺切除术。
   1. 从腹部通路、吹气和相机端口放置开始（参见 材料表）。将其余五个端口置于直接视线下。将气腹设置为12毫米。
   2. 通过切开腹膜释放膀胱并解剖直肠周围空间。
   3. 打开两侧的骨盆筋膜。
   4. 对前列腺和膀胱的前部和外侧进行完全解剖。
   5. 进行膀胱颈的开放，识别并切片近端尿道，以进入前列腺和膀胱的后部。
   6. 解剖精囊和直肠间隙¹⁹.
   7. 解剖前列腺的外侧，保留神经血管束。
   8. 确保耻骨后间隙血管止血。
   9. 解剖尿道顶端并切开远端尿道。
   10. 完成膀胱尿道吻合术。
   11. 取出前列腺并进行切口闭合¹⁹.
2. 将新鲜的前列腺收集在干燥的容器中。至关重要的是，不要将样品固定或石蜡嵌入样品中。
3. 将新鲜的手术标本（包括整个前列腺）运送到生物样本库进行样本处理。

3. 前列腺处理和样本采集

1. 根据从术前 mpMRI 检索的肿瘤位置信息、术前活检结果和直接前列腺切除标本触诊中检索到的肿瘤位置信息，选择目标前列腺区域进行采样。将此信息记录在表格上，其中包括患者识别数据、最终采样的前列腺区域以及收集的样本数量。
   注意:当 MRI 结果、术前活检结果和直接前列腺切除标本触诊一致时，将所有样本对准那个或那些位置（4 到 6 个圆柱体之间）。如果有任何不一致，请增加气瓶的数量，并分别针对所有怀疑可能受到这些方法影响的区域。
2. 使用一次性自动针头（外科医生）从选定区域取出圆柱形样本（步骤 1.1）。然后，识别（病理学家）圆柱体的外部区域，用组织镊子夹住圆柱体，将其放在载玻片上，并用组织墨水标记外部区域。在取下所有气缸的情况下重复此过程。
3. 将收集的圆柱体水平放置在装有低温恒温器包埋培养基的样品架盘（参见 材料表）上，并将它们转移到切片机冷却板进行切割。
4. 放置在压板上后，将样品架盘连接到样品夹头上，然后按照以下步骤小心地移动轮子进行切割:
   1. 使用最佳切割温度化合物（OCT 化合物，参见 材料表）将组织样品包埋，然后再将冷冻切片机切片机冷冻到恒温器上。
   2. 之后，在-25°C下使用低温恒温切片机切割样品。 将薄的圆柱形组织切片（10μm）收集到处理过的显微镜载玻片上。确保只收集几微米的组织，以确保有足够的完整肿瘤组织储存在生物样本库中。
   3. 每张载玻片收集两到三个薄片，并手动染色它们以控制最终着色。技术人员的眼睛确保了最佳的染色效果，并且可以进行任何必要的重新染色。请按照下列步骤操作
      1. 将载玻片固定在96%乙醇中，在蒸馏水中水合，并用Harris苏木精（参见 材料表）染色1分钟以染色细胞核。用蒸馏水冲洗载玻片，去除多余的苏木精。
      2. 用30%氢氧化铵处理载玻片，使苏木精变成蓝色。用蒸馏水冲洗干净，去除多余的溶液。
      3. 用曙红染色载玻片（参见 材料表）30秒。
      4. 接下来，用增加的酒精滴定法对载玻片进行脱水，用二甲苯 （100%） 透明，并用 DPX（二苯乙烯、增塑剂和二甲苯的混合物，用作替代二甲苯-香脂的合成树脂封片介质，参见 材料表）。在这些步骤中，将载玻片浸入 Coplin 溶液罐中并从中取出。
      5. 最后，将盖玻片放在染色组织的顶部，并使用具有合适折射率的培养基（参见 材料表）在显微镜下观察。

4. 样品表征

1. 在光学显微镜（病理学家）下分析样品，区分癌区域并确定肿瘤的格里森评分。记录所有这些数据，并在载玻片上标记精确的肿瘤区域。
2. 在此步骤中，用肿瘤的精确位置及其各自的格里森评分²⁰ 标记载玻片。此外，根据形态学鉴定标记 PIN（前列腺上皮内肿瘤）的位置。

5. 样品微观宏观解剖与贮存

1. 在载玻片上用不同的标记清楚地标记不同的组织学成分（病理学家），并将它们与椎间盘上的冷冻组织直接关联。
2. 然后，使用手术刀片，宏观-微观解剖 OCT 盘内载玻片上标记的样本区域，将它们分为肿瘤、肿瘤周围、PIN 和正常前列腺组织。
3. 当包埋培养基开始解冻时，用镊子处理组织并将其放入正确标记的冻存管中。
   注意:根据冷冻切片的组织学诊断，小心地将每个解剖的片段储存在相应的管中。
4. 将标记的冻存管与完全表征的组织学样品储存在-80°C的生物库中，以便随后用于研究。
   注意:本节中描述的步骤可以由训练有素的技术人员在病理学家的监督下执行。手术标本应尽快运至生物样本库，以防止组织和核酸降解。根据参考指南，必须努力避免缺血时间延长（>30 分钟）²¹。只要保持样本质量原则，样本就可以无限期地保存在生物样本库中。

结果

结果显示，该技术使得在61%的研究病例（41例中的25例）中获得肿瘤物质成为可能（表1）。

表1:研究样本的组织病理学数据。 研究中使用的样本的组织病理学数据摘要。诊断圆柱体是指为诊断目的而获得的前列腺活检样本，而处理过的圆柱体对应于为研究目的从前列腺切除术标本中获得的圆柱体。ND:无数据;LL: 左小叶;RL: 右小叶;TTB:肿瘤总负荷。 请按此下载此表格。

对于该分析，将从每个小叶的根治性前列腺切除术标本中获得的圆柱体中存在的肿瘤样本数量与为诊断而进行的活检圆柱体中存在的肿瘤数量进行比较。具体来说，数据显示，左肺叶活检的效率为59%（17/29），右肺叶活检的效率为21%（7/33）（表1）。关于在取样过程中无法获得肿瘤的16个前列腺...

讨论

在任何研究中，获得高质量的样本是减少系统性偏差和获得可靠结果的基本要求²².因此，在任何涉及生物样品的方案中，都必须考虑分析前变量的控制，例如处理和储存样品的温度、从样品收集到储存所经过的时间、灭菌材料的使用或添加防腐剂或其他添加剂可能对样品产生的影响。这不仅是关键，而且样本的正确识别和编码以及它们的病理特征也至关重要。否则，可能会存储了大量高质量样本，但仍未使用。

由于它们在PC环境中的巨大重要性，在储存在生物库中之前收集和分型肿瘤和非肿瘤样本是该协议的主要焦点。从方法学的角度来看，获得新鲜的 PC 组织用于研究是一个相当大的挑战，因为成功的肿瘤取样很困难⁹.通常，在前列腺中进行有针对性的取样以收集肿瘤样本进行研究是不可能的。另一个限制包括获得手术标本的代表性肿瘤样本。本文介绍的方法成功地克服了这些限制，在采集肿瘤样本方面表现出良好的性能，特别是当肿瘤负荷超过12%时（这在大多数情况下都会发生）。此外，该方法在组织圆柱体和根治性前列腺切除术之间的格里森评分对应关系为 64%，当包括直接...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cadiere 镊子	直观	PN1052082-US 10/2021	零件编号：471049 18 次使用。
常规载玻片	Knittel Glass	2021	研磨/磨砂末端
低温恒温器切片机	Thermo Fisher Scientific	---	Criostato CryoStar NX50
低温管	Greiner Bio-One GmbH	Ref.： 122280.	CRYO S. PP， 带螺口盖， 无菌。
达芬奇手术系统	直观的	PN1052082-US 10/2021	XI 型号
解剖器械	拜耳	---	两个镊子和一个手术刀片
DPX Eukitt	Medizin- und Labortechnik GmbH	6.00.01.0001.06.01.01
Eosin	Agilent	157252
开孔双极镊子	直观的	PN1052082-US 10/2021	零件号：471205。14 条生命。
力双极	直观	PN1052082-US 10/2021	零件编号：471405。 12 次使用。
Thermo	Scientific		型号 907. -80 º 冰箱C
苏木精	安捷伦	157251
免疫组织化学载玻片	安捷伦-达科	K802021-2
大针驱动器	直观的	PN1052082-US 10/2021	零件编号：471006。 15 次使用。
马里兰双极镊子	直观的	PN1052082-US 10/2021	零件编号：471172 14 次使用。
显微镜	奥林巴	---	Olympus cx40
切片机刀片	PFM 医用	a35
单极弯曲剪刀	直观	PN1052082-US 10/2021	零件编号：470179。 10 次使用。
OCT 化合物	NEG-50	LOT.117340
PlusSpeed S 一次性使用活检装置，带斜面尖端	Peter Pflugbeil GmbH	PSS-1825-S
ProGasp镊子	直观	PN1052082-US 10/2021	零件编号：471093。 18次使用。
样品架 Disc	Davidson Cryo Chuck。Bradley产品		30 毫米
纸巾墨水	百利金	2021	墨水 4001 亮黑色 （301168）
Xylol	Quimipur	Ref. 169