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方法文章

通过改进取样技术与组织学表征提升前列腺肿瘤生物样本库的可靠性

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DOI：

10.3791/65635

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2023年11月17日

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种促进从根治性前列腺切除术标本中采集样本的方法。其目标是在将组织样本存入生物样本库之前，根据解剖病理学标准对其进行定位、表征以及宏观-微观分离。

摘要

获取新鲜且经过充分表征的肿瘤组织样本对于开展高质量的"组学"研究至关重要。然而，由于前列腺器官的特殊性质以及该肿瘤具有高度异质性，前列腺癌（PC）研究中的组织获取尤为困难。另一方面，在不引起显著组织改变的前提下，于样本储存前完成组织的组织病理学表征也是一项颇具挑战性的任务。针对上述问题，本文提出一种基于解剖病理学标准获取、定位、表征及显微切割切除后前列腺组织的新方法。

与以往发表的方案不同，该方法在不损害前列腺标本结构的前提下，缩短了组织病理学分析所需的时间，而标本结构的完整性对于手术切缘的评估至关重要。此外，该方法能够对新鲜前列腺组织样本进行微-宏观解剖和分离，重点关注由病理学标准定义的组织学肿瘤区域，如格里森评分（Gleason score）、癌前病变（高级别前列腺上皮内瘤变 - PIN）和炎性病变（前列腺炎）。这些样本随后被保存至生物样本库，以供后续研究分析使用。

引言

前列腺癌（PC）是第2位nd 男性中最常见的癌症，以及第5位th 全球主要死因1患者的治疗方案和预后取决于肿瘤的分期和分级（Gleason评分），例如局限性低级别肿瘤（Gleason分级6级）的5年生存率较高（99%），而高级别Gleason分级和转移性肿瘤的5年生存率较低（31%）2.

前列腺癌的局部复发和治疗失败与该肿瘤类型特有的高度肿瘤内遗传异质性相关3。此外，前列腺癌被认为是一种多灶性疾病，其多个肿瘤病灶表现出不同的形态学、组织学和分子特征4，这些病灶可能独立发生，也可能源自共同的肿瘤细胞祖先5。既往研究表明，不同患者的肿瘤演化过程因其特定的遗传驱动因素而异，这些驱动因素可能促进转移，也可能将细胞谱系局限于前列腺内5。因此，对不同肿瘤病灶进行分子表征不仅对于提供更准确的诊断和预后评估至关重要，而且对于为患者制定有效且个体化的治疗方案也具有重要意义。

在此背景下，生物医学研究和整合性多组学方法为癌症的分类提供了前所未有的机遇，可将癌症划分为不同亚型，识别诊断和预后生物标志物，并发现与治疗反应相关的标志物。此外，这些方法有助于更深入地理解该疾病的生物学特性6,7。无论是组织还是生物液体，生物样本均可通过多种多组学平台（如基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等）进行分析，以揭示癌症病理生理学背后的生物学特征，从而应对当前在遗传和表型异质性方面的局限性6。然而，需要注意的是，组学研究所得数据的质量取决于从肿瘤中采集的样本质量、其准确表征以及后续的处理与保存8。

在此背景下，由于难以成功获取肿瘤样本，为研究获取新鲜的前列腺癌（PC）组织带来了方法学上的挑战9。既往方法是在根治性前列腺切除术后进行随机取样，结果较差10。然而，近年来的方法结合了基于磁共振成像（MRI）和活检数据的靶向采样方案，显著提高了肿瘤样本采集的有效性11。

另一方面，在样本储存前对其进行组织病理学表征，同时又不引起组织显著改变，也构成了一个有趣的挑战。因此，在许多情况下，样本的组织病理学鉴定是在其分析之后进行的（例如，高分辨率1H NMR代谢组学分析）12。这种做法导致了不必要的开支、耗时增加，并造成大量最终被排除在分析之外的样本损失（例如，经组织病理学分析后发现并非肿瘤组织的样本）。在其他情况下，样本的组织病理学表征则在其分析之前完成。事实上，一些先前的研究已尝试建立标准化方法，以从根治性前列腺切除术标本中获取具有代表性的高质量研究样本，用于基因组学和代谢组学研究13,14。然而，与从未经确认的切片中取样相比，从已有组织学确诊的切片中取样（尽管会破坏组织）的取样效率显著更高（88% 对 45%）1。

本文提出了一种新方法，旨在克服上述局限性，以在样本存入生物样本库之前获取新鲜且特征明确的前列腺癌（PC）样本。该方法由多个临床科室（泌尿外科、病理科及 La Fe 医院生物样本库）协作开发。需要特别指出的是，生物样本库在生物样本的收集、处理、保存和储存过程中发挥着关键作用，同时确保样本和数据的高质量，并符合伦理和法律要求8,15,16。

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方案

该方法由多个临床科室（泌尿科、病理科和 La Fe 医院生物样本库）协作开发。研究遵循机构、国家和国际有关人类福祉的指南，并获得了西班牙巴伦西亚 La Fe 大学综合医院暨医疗保健研究所生物医学研究伦理委员会的批准（Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spain）。所有样本均保存于 La Fe 医院生物样本库（PT13/0010/0026）。整体操作流程详见图1。

前列腺组织处理步骤示意图；切片机切片、染色、显微镜评估。
图1：整体操作流程图。 本图示为方案部分所述逐步操作的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 肿瘤靶向

  1. 手术前，采用多参数或双参数磁共振成像（mpMRI 或 bpMRI）17,18 定位肿瘤并绘制其在前列腺内的位置。若经直肠超声或直肠指检结果与MRI结果不一致，应结合MRI所获信息与上述检查结果进行综合判断。
  2. 为提高肿瘤定位的准确性，需复查术前经超声引导和MRI引导的经直肠前列腺活检结果。
    注意：在前列腺癌的诊断过程中，活检样本直接取自前列腺 通过 经直肠入路。这些活检包括对前列腺进行系统性取样（取样柱状组织样本，分布于整个腺体周围）以及直接针对MRI上可疑病灶的靶向取样。为实现这些样本的精准获取，采用经直肠超声引导，并将其与MRI结果通过主观判断方式结合（“认知融合”），或在有条件时使用“实时MRI-超声融合软件”进行融合。

2. 根治性前列腺切除术与前列腺样本采集

  1. 按照 Huynh 等人所述步骤19，通过经腹腔入路进行标准化的机器人辅助根治性前列腺切除术。
    1. 首先进行腹腔通路建立、气腹形成及摄像镜头穿刺口放置（参见材料表）。在直视下放置其余五个穿刺套管。将气腹压力设定为 12 mmHg。
    2. 切开腹膜，游离膀胱并解剖直肠旁间隙。
    3. 在两侧打开盆腔筋膜。
    4. 完整解剖前列腺和膀胱的前侧及外侧区域。
    5. 切开膀胱颈，识别并切断近端尿道，以暴露前列腺和膀胱的后方结构。
    6. 解剖精囊与直肠之间的间隙19。
    7. 解剖前列腺外侧部分，保留神经血管束。
    8. 确保耻骨后间隙内血管的止血彻底。
    9. 解剖前列腺尖部并切断远端尿道。
    10. 完成膀胱尿道吻合。
    11. 取出前列腺标本，并关闭切口19。
  2. 将新鲜前列腺组织置于干燥容器中收集。关键在于不得对样本进行固定或石蜡包埋处理。
  3. 将包含完整前列腺的新鲜手术标本运送至生物样本库进行后续处理。

3. 前列腺组织处理与样本采集

  1. 根据术前多参数磁共振成像（mpMRI）、术前活检结果以及前列腺切除标本的直接触诊所获得的肿瘤位置信息，选择用于取样的前列腺靶区。将该信息记录在表格上，表格内容包括患者身份识别信息、最终取样的前列腺区域以及采集的样本数量。
    注意：当MRI结果、术前活检结果与前列腺切除标本的直接触诊结果一致时，应将所有样本靶向该一个或多个位置（4至6个圆柱形组织块）。若存在任何不一致，应增加圆柱形组织块的数量，并分别对任一方法提示可疑的各个区域进行取样。
  2. 使用一次性自动穿刺针（外科医生操作）从选定区域（步骤1.1）获取圆柱形组织样本。随后由病理医生识别圆柱体的外周区域，用组织镊夹住该圆柱体，将其放置于载玻片上，并用组织墨水标记其外周区域。对所有获取的圆柱体重复此过程。
  3. 将采集的圆柱形组织水平放置于装有恒冷切片包埋介质的样本托盘（见材料表）中，并转移至切片机冷却板上进行切片。
  4. 将样本托盘放置于冷却板后，将其固定于标本夹头上，并通过谨慎转动轮盘按照以下步骤进行切片：
    1. 使用最佳切割温度化合物（OCT化合物，见材料表）在恒冷切片机-切片机上进行冷冻切片前包埋组织样本。
    2. 随后，在-25 °C条件下使用恒冷切片机-切片机对样本进行切片，将厚度为10 µm的圆柱形薄片收集到经处理的显微载玻片上。确保仅收集数微米厚的组织，以保证生物样本库储存时有足够的完整肿瘤组织量。
    3. 每张载玻片收集两到三个薄切片，并进行手工染色以控制最终着色效果。技术人员通过肉眼判断染色是否最佳，并可根据需要进行复染。按以下步骤操作：
      1. 将载玻片在96%乙醇中固定，蒸馏水中水化，随后用Harris苏木精染液（见材料表）染色1分钟以染细胞核。用蒸馏水冲洗去除多余苏木精染液。
      2. 用30%氨水处理载玻片，使苏木精染色变为蓝色。用蒸馏水冲洗去除多余溶液。
      3. 用伊红染液（见材料表）染色30秒。
      4. 接着，用浓度递增的酒精进行脱水，二甲苯（100%）透明，最后用DPX封片（DPX为二乙烯苯、增塑剂和二甲苯的混合物，是一种合成树脂封片介质，可替代二甲苯-树胶，见材料表）。在这些步骤中，将载玻片浸入并从科柏林染色缸的溶液中取出。
      5. 最后，在染色组织上加盖盖玻片，并使用具有合适折射率的封片介质（见材料表）以便在显微镜下观察。

4. 样品表征

  1. 在光学显微镜下分析样本（由病理学家操作），区分癌组织区域并确定肿瘤的Gleason评分。记录所有这些数据，并在切片上标记出精确的肿瘤区域。
  2. 在此步骤中，根据肿瘤的精确位置及其相应的Gleason评分对切片进行标记20。同时，根据形态学特征标记前列腺上皮内瘤变（PIN, Prostatic Intraepithelial Neoplasm）的位置。

5. 样品的显微-宏观解剖与保存

  1. 在切片上使用不同的标记物清晰地标记出不同的组织学组分（由病理学家完成），并直接与冰冻组织盘中的组织进行对应。
  2. 然后使用手术刀对 OCT 包埋盘中标记区域的样本进行宏观-显微解剖，将其分为肿瘤组织、瘤周组织、前列腺上皮内瘤变（PIN）以及正常前列腺组织。
  3. 当包埋介质开始解冻时，用镊子小心操作组织，并将其放入正确标记的冻存管中。
    注意：应根据冷冻切片的组织病理学诊断结果，仔细将每一块解剖得到的组织片段存入相应的冻存管中。
  4. 将带有完整组织病理学特征标注的冻存管存放于 -80 °C 生物样本库中，以备后续科研使用。
    注意：本节所述步骤可由经过培训的技术人员在病理学家的监督下完成。手术标本应尽快转运至生物样本库，以防止组织和核酸降解。根据参考指南，必须尽量避免过长的缺血时间（>30 min）21。只要保持样本质量控制原则，样本可在生物样本库中无限期保存。

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结果

结果表明，该技术已使61%的研究病例（41例中的25例）成功获取了肿瘤组织（表1）。

表1：研究样本的组织病理学数据。 本研究中所用样本的组织病理学数据汇总。诊断用组织柱指为诊断目的获取的前列腺穿刺活检样本，而处理用组织柱则指从前列腺切除标本中获取用于研究目的的组织柱。ND：无数据；LL：左叶；RL：右叶；TTB：总肿瘤负荷。请点击此处下载该表格。

在本分析中，将从根治性前列腺切除标本的各个叶中获取的圆柱形组织内存在肿瘤的样本数量，与诊断性活检中各圆柱形组织内肿瘤的存在情况进行了比较。具体而言，数据表明，在左侧叶进行的活检中，检出效率为59%（17/29），而在右侧叶进行的活检中，检出效率为21%（7/33）（表1）。在16例采样过程中未能...

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讨论

在任何研究中，获得高质量的样本是减少系统性偏差并获得可靠结果的基本要求22。因此，在涉及生物样本的任何方案中，都必须考虑样本处理和储存温度、样本采集至储存之间的时间间隔、无菌材料的使用，以及防腐剂或其他添加剂的加入对样本可能产生的影响等分析前变量。此外，样本的正确标识与编码及其病理学特征的准确描述也至关重要。否则，可能会导致大量高质量样本虽被储存却无法被有效利用。

由于肿瘤和非肿瘤样本在前列腺癌（PC）研究背景下的重要性极高，本方案主要关注样本在储存于生物样本库之前的采集与分类。从方法学角度来看，获取用于研究的新鲜PC组织具有相当大的挑战性，主要原因是成功采集肿瘤样本存在困难9。通常情况下，无法在前列腺中进行靶向取样以获取用于研究的肿瘤组织。另一个限制因素是难以获得能够代表手术标本的肿瘤样本。本文所介绍的方法已成功克服了这些局限，在肿瘤样本获取方面表现出良好的性能，尤其是当肿瘤负荷超过12%时（这在大多数情况下成立）。此外，该方法在组织穿刺柱与根治性前列腺切除术之间的Gleason评分一...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

A.L. 感谢一个 "Margarita Salas" 博士后合同（编号21-076），以及MAM-T的“玛丽亚·赞布拉诺”研究合同（编号MAZ/2021/03 UP2021-021）。这两项合同均由欧盟—下一代欧盟资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卡迪尔钳IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471049。可使用18次。
常规载玻片Knittel Glass2021磨砂/霜化端
冷冻切片机Thermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
冻存管Greiner Bio-One GmbH货号：122280。CRYO S. 聚丙烯材质，带螺旋盖，无菌。 
达芬奇手术系统IntuitivePN1052082-US 10/2021XI 型号
解剖器械Bayer---两把镊子和一把手术刀 
DPX Eukitt Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
伊红Agilent157252
带窗双极电凝钳IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471205。使用寿命14次。
普通双极电凝钳IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471405。可使用12次。
冷冻柜Thermo Scientific型号 907。-80 ºC
苏木精Agilent157251
免疫组织化学载玻片Agilent-DakoK802021-2
大型持针器IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471006。可使用15次。
马里兰双极电凝钳IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471172。可使用14次。
显微镜Olympus---Olympus cx40
切片机刀片PFM Medicala35
单极弯剪IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：470179。可使用10次。
OCT包埋剂NEG-50批号：117340
带斜面尖端的PlusSpeed S一次性活检装置Peter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
ProGasp钳IntuitivePN1052082-US 10/2021部件编号：471093。可使用18次。
样本夹持盘Davidson Cryo Chuck. BradleyProducts30 mm 
组织标记墨水Pelikan2021墨水4001 鲜艳黑色（301168）
二甲苯Quimipur货号：169

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