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方法文章

晶状体皮层和核部束状及单根纤维细胞的制备与免疫荧光染色

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DOI：

10.3791/65638

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2023年6月9日

 , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

本文内容

摘要

本方案描述了制备外周、成熟及核眼晶状体纤维细胞的方法，用于免疫荧光染色，以研究复杂的细胞间交错结构及膜结构。

摘要

晶状体是位于眼球前房的一个透明椭球状器官，可通过改变形状将光线精确聚焦到视网膜上，从而形成清晰的图像。该组织的大部分由特化的、已分化的纤维细胞构成，这些细胞呈六边形横截面，并从晶状体的前极延伸至后极。这些细长的细胞与邻近细胞紧密贴合，且沿细胞长度方向具有复杂的指状交错结构。这种特化的嵌合结构对于晶状体正常的生物力学特性至关重要，已有大量研究利用电子显微镜技术对其进行了详细描述。本实验方案展示了首个可用于保存并进行免疫染色的小鼠晶状体单根及成束纤维细胞的方法，从而实现对这些复杂形态细胞内蛋白质的精确定位。代表性数据展示了在整个晶状体各个区域中，包括周边、正在分化、成熟以及核部的纤维细胞的染色结果。该方法未来有望应用于从其他物种晶状体中分离出的纤维细胞。

引言

晶状体是位于眼球前房的一种透明卵圆形组织，由上皮细胞和纤维细胞两种细胞类型构成1（图1）。晶状体的前半球表面覆盖着一层单层的上皮细胞。纤维细胞由上皮细胞分化而来，构成了晶状体的主体部分。这些高度特化的纤维细胞经历一个拉长、分化和成熟的过程，其细胞膜形态从晶状体周边到中心呈现出明显的阶段性变化2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12，这一中心区域也被称为晶状体核。晶状体能够将来自不同距离的光线精确聚焦于视网膜上，这一功能依赖于其生物力学特性，包括刚度和弹性13,14,15,16,17,18,19。晶状体纤维之间复杂的指状交错结构曾被推测20,21，近期研究已证实其对晶状体刚度具有重要作用22,23。

晶状体纤维细胞成熟示意图；光学切面、横截面；纤维细胞的显微图像。
图1：晶状体解剖示意图及来自晶状体纤维的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像。 示意图显示了上皮细胞前单层（浅蓝色阴影）和大量晶状体纤维细胞（白色）的纵向视图（从上到下为前至后）。晶状体中心（粉红色阴影）称为核，由高度致密的纤维细胞组成。右侧的横截面示意图揭示了晶状体纤维的拉长六边形细胞形状，排列成蜂窝状结构。纤维细胞具有两个宽面和四个窄面。底部的代表性SEM图像显示了晶状体不同深度处纤维细胞之间复杂的膜交错结构。从右侧开始，位于晶状体周边新形成的纤维细胞在其窄面有小突起，宽面则具有球窝结构（红框）。在成熟过程中，晶状体纤维发育出大的桨状结构，窄面边缘分布有小突起（蓝框）。成熟的纤维细胞具有由小突起构成的大桨状结构。这些相互嵌合的结构对晶状体的生物力学特性至关重要。晶状体核内的纤维细胞窄面上的小突起较少，并具有复杂的舌槽交错结构（紫框）。细胞的宽面表现出球状膜形态。该示意图改编自22,32，未按比例绘制。比例尺 = 3 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

晶状体通过在先前世代的纤维细胞上叠加新的纤维细胞层而生长24,25。纤维细胞具有细长的六边形横截面，包含两个宽面和四个窄面。这些细胞从晶状体的前极延伸至后极，根据物种的不同，晶状体纤维的长度可达数毫米。为了维持这些细长而纤细的细胞结构，其宽面和窄面沿侧缘形成特化的指状交错结构，相互嵌合，以维持晶状体的形态和生物力学特性。纤维细胞分化和成熟过程中细胞膜形态的变化已被电子显微镜（EM）研究广泛记录2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29。新生的纤维细胞在其宽面具有“球与窝”结构，窄面仅有微小突起；而成熟的纤维细胞在窄面则具有相互嵌合的突起和桨状结构。核部纤维表现出“舌与槽”样指状交错结构以及球状膜形态。目前对介导这些复杂嵌合膜结构所需的蛋白质了解甚少。以往关于纤维细胞中蛋白质定位的研究依赖于晶状体组织切片，但这种方法难以清晰呈现复杂的细胞架构。

本研究建立并优化了一种固定单个及成束晶状体纤维细胞的新方法，可有效保持其复杂形态，并允许对细胞膜及胞质内的蛋白质进行免疫染色。该方法能真实保留细胞膜结构，其效果可与电镜研究结果相媲美，并可使用特异性蛋白的一抗进行染色。我们此前已对正在分化和成熟的皮质晶状体纤维进行过免疫染色22,23。在本方案中，还新增了针对晶状体核部纤维细胞的染色方法。该技术为深入理解纤维细胞成熟过程中膜指状交联结构的形成机制以及晶状体核致密化过程中的变化提供了可能。

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方案

小鼠的饲养和管理依据印第安纳大学布卢明顿分校机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案进行。用于生成代表性数据的小鼠为C57BL6/J背景的对照（野生型）雌性小鼠，年龄为8至12周。本实验可使用雄性或雌性小鼠，因为小鼠的性别极不可能影响实验结果。

1. 晶状体解剖与去囊

  1. 根据美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》以及机构批准的动物使用规程实施小鼠安乐死。
    注：本研究中，小鼠按照印第安纳大学批准的动物实验方案，采用过量二氧化碳（CO2）吸入法实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
  2. 使用弯头镊子摘除小鼠眼球：将镊子的一侧压住眼球周围组织，使眼球从眼窝中脱出；随后将镊子闭合于眼球下方，轻轻提起以取出眼球。将取出的眼球转移至解剖盘中新鲜的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  3. 使用超细剪刀尽可能靠近眼球处剪断视神经。随后，将细尖直头镊子经眼球后部视神经出口处小心插入眼球内部。
  4. 在步骤1.3中镊子插入的同一位置插入剪刀，开始从眼球后部向角膜-巩膜交界处剪开切口。
    注：啮齿类动物的晶状体约占眼球体积的30%。若镊子或剪刀插入过深，可能导致晶状体意外损伤。
  5. 沿角膜-巩膜交界处继续剪开，直至至少一半的交界区域被分离。
  6. 使用镊子轻压角膜，使晶状体通过步骤1.4和1.5所形成的切口脱出。
  7. 使用细尖直头镊子小心去除附着在晶状体上的大块组织。检查晶状体，确定其赤道区域。
  8. 用细尖直头镊子浅刺晶状体，随后剥离晶状体囊膜。晶状体纤维细胞团将保持完整，而晶状体上皮单层细胞仍附着于囊膜上。弃去晶状体囊膜。

2. 晶状体单根纤维细胞染色

  1. 将晶状体纤维细胞团转移至含有 500 µL 新鲜配制的 1% 多聚甲醛（PFA；溶于 1x PBS）溶液的孔板中，并在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜（图 2A）。
    注意：所给溶液的体积已针对 48 孔板优化。若使用其他规格的孔板或离心管，请相应调整溶液用量。固定液、封闭液和洗涤液（1x PTX，即含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS）均使用 10x PBS 和双蒸水（ddH2O）配制，最终浓度为 1x PBS。
  2. 将晶状体纤维细胞转移至 60 mm 培养皿中，加入 1% PFA。使用锋利的手术刀沿纤维细胞团的前-后轴将其切成两半（图 2B）。再沿同一轴线将每半进一步切分为两部分，得到四等份。
    注意：前-后轴可通过组织团中纤维细胞的排列方向轻易识别。
  3. 使用直头镊子从晶状体纤维细胞的四分之一部分中去除核区（图 2C）。
    注意：啮齿类动物晶状体的核区较为坚硬，晶状体中心部分可轻易与较软的皮质纤维分离。
  4. 在室温（RT）下，用 200 µL 的 1% PFA 对晶状体皮质区域的四分之一部分进行后固定，轻轻振荡孵育 15 分钟（在平板振荡器上以 300 rpm 振荡）。
  5. 在室温下，用 750 µL 的 1x PBS 洗涤组织四分之一部分两次，每次 5 分钟，轻轻振荡。
  6. 在室温下，用 200 µL 封闭液（5% 血清，0.3% Triton X-100，1x PBS）封闭样品 1 小时，轻轻振荡。
    注意：本方案中的代表性数据未使用一抗或二抗染色。在封闭步骤后，样品在避光条件下，于室温下用麦芽凝集素（WGA；1:100）和鬼笔环肽（phalloidin；1:100）（见 材料表）孵育 3 小时，同时轻轻振荡。此前已有文献报道过一抗染色方法22,23。
  7. 在 4 °C 下，用 100 µL 一抗溶液轻轻振荡孵育过夜。
    注意：一抗用封闭液稀释。与组织切片载玻片相比，此类样品中细胞数量更多，因此应提高一抗浓度，以确保有足够的抗体染色更多细胞。建议将用于组织切片的一抗浓度加倍。二抗的使用同样适用此原则。
  8. 在室温下，用 1x PTX（含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS）洗涤组织四分之一部分三次，每次 5 分钟，轻轻振荡。
  9. 在室温下，用 100 µL 二抗/染料溶液孵育纤维细胞 3 小时，轻轻振荡。此步骤及后续步骤均需避光。
    注意：可在二抗溶液中同时加入 WGA、鬼笔环肽及其他荧光染料，以实现细胞膜、细胞骨架或其他细胞器与目标蛋白的同步标记。
  10. 在室温下，用 1x PTX 洗涤纤维细胞四次，每次 5 分钟，轻轻振荡。
  11. 在转移组织四分之一部分至载玻片前，先在带正电荷的显微镜载玻片上滴加一滴或 50 µL 封片介质。
  12. 使用镊子轻轻将纤维细胞彼此分离，并尽量减少细胞束之间的重叠。
  13. 在样品的封片介质上轻轻加盖一张 #1.5 盖玻片。封片介质应扩散至盖玻片边缘；若未达到，可在盖玻片边缘补充少量封片介质。用移液器吸去盖玻片周围多余的封片介质，并用指甲油密封盖玻片边缘。
    ​注意：本实验可使用任何适用于共聚焦显微镜的封片介质。

3. 晶状体核单根纤维细胞染色

  1. 完成第1节所述的解剖操作。
  2. 通过将晶状体纤维细胞团轻轻转移至湿润的戴手套的手指尖，并轻轻滚动组织团块，机械性地去除晶状体纤维细胞球的皮质纤维，仅保留晶状体核。
    注意：在小鼠晶状体中，将晶状体纤维细胞球在戴手套的手指间轻轻滚动是有效去除皮质纤维细胞、保留坚硬晶状体核的方法28,30。对于该机械方法无效的晶状体，可采用精细解剖或涡旋法29去除皮质纤维细胞。
  3. 将晶状体核转移至孔板中新鲜配制的1% PFA溶液中，于4 °C条件下轻轻振荡孵育过夜。
  4. 将样品转移至含1% PFA的60 mm培养皿中，使用锋利的手术刀沿前后轴方向将晶状体核切开，再将组织样本再次对半切开，得到晶状体核的四分之一部分。
  5. 按照步骤2.4–2.13所述流程进行免疫染色和样品封片。

微量滴定板实验、晶状体解剖示意图、显微镜观察；晶状体成像制备、组织学分析。
图 2：晶状体纤维细胞制备与免疫染色的图示总结。（A）该48孔板按列进行了颜色编码，以展示所述方法的示例性板布局，便于使用镊子轻柔操作，在不同免疫染色步骤之间转移样品。尽管本方案的代表性数据未与一抗孵育，图中仍包含一抗孵育列，且洗涤用孔可在吸除废液后重复使用。（B）固定晶状体纤维细胞团后，沿前后轴（红色虚线）将组织切开，以保持细胞原有结构。当组织块被分为两半后，将样品旋转，并再次沿前后轴（红色虚线）将每半分为四分之一。（C）使用镊子可轻松去除晶状体核区域（粉红色），即从皮质纤维细胞（蓝色）中挖出致密的中央组织。卡通示意图部分使用 BioRender.com 制作，未按比例绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

晶状体纤维细胞从晶状体皮质（分化中的纤维和成熟纤维）及晶状体核中分离制备，细胞经鬼笔环肽染色以标记F-actin，麦芽凝集素（WGA）染色以标记细胞膜。细胞束混合物或单个晶状体纤维（图3）被观察并成像。从晶状体皮层中可观察到两种类型的细胞（图3A在晶状体周边发现正在分化的纤维细胞呈直线形，其短边带有极小的突起。随着细胞的分化，纤维细胞逐渐变得弯曲，并形成小型相互嵌合的突起。在进一步成熟的过程中，纤维细胞发育出带有小型相互嵌合突起的宽大桨状结构。小鼠晶状体的核部高度致密且坚硬，并被隔离 通过 在固定和染色核部晶状体纤维之前，机械去除较软的晶状体皮质。从晶状体核部可观察到成束的晶状体纤维，其直径较小，且具有精细的膜结构，在低倍镜图像中不易清晰观察。

通过对晶状体不同区域的晶状体纤维细胞进行高倍放大的三维重建（图3B）发现，F-肌动蛋白与麦芽凝集素（WGA）在分化中及成熟纤维细胞的细胞膜上高度...

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讨论

本方案展示了固定、保存以及免疫染色的方法，可真实保留晶状体不同深度处成束或单个晶状体纤维细胞的三维膜形态。染色后的晶状体纤维与长期以来用于研究晶状体纤维细胞形态的扫描电镜（SEM）样品进行了比较。结果显示，两种制备方法所呈现的膜结构具有可比性。尽管电镜（EM）仍是研究细胞形态的金标准，但在SEM样品中进行免疫标记以定位蛋白质更具挑战性33,34,35，且需要使用电子显微镜成像。该免疫染色方法的优势在于可同时标记多个靶点，并可在共聚焦显微镜上采集图像。

尽管该方法能够保持复杂的细胞形态，但由于基因突变、衰老、药物处理等因素导致晶状体纤维发生改变，仍需通过扫描电镜（SEM）来比较对照组与处理组晶状体纤维之间的交错结构。免疫染色制备过程会产生来自晶状体皮质或核部的细胞混合物，这些细胞在载玻片上呈随机分布。因此，如果细胞形态发生改变，则可能更难判断细胞在解离染色前于晶状体中的原始位置深度。在此类情况下，可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了国家眼科研究所资助项目 R01 EY032056（授予 CC）的支持。作者感谢斯克里普斯研究研究所核心显微镜中心的 Dr. Theresa Fassel 和 Kimberly Vanderpool 在电子显微镜图像方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60 mm 培养皿FisherScientificFB0875713A
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
10X 磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher70011-044
1X 磷酸盐缓冲液（PBS）ThermoFisher14190136
48 孔板CytoOneCC7672-7548
盖玻片（22 × 40 mm）FisherScientific12-553-467
弯头镊子World Precision Instruments501981
解剖显微镜Carl ZeissStereo Discovery V8
细尖直头镊子Electron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片FisherScientific12-550-15
配备 Airyscan（63X）和 Zen 3.5 软件的 LSM 800 共聚焦显微镜Carl Zeiss
指甲油
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-121
鬼笔环肽（罗丹明标记）ThermoFisherR415
一抗
Feather 一次性手术刀，无菌，11 号VWR76241-186
二抗
直头镊子World Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays（解剖托盘）FisherScientific12-565-154
超细剪刀World Precision Instruments501778
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1200
麦胚凝集素（荧光素标记）Vector LaboratoriesFL-1021-5

参考文献

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