本方案描述了制备外周、成熟及核眼晶状体纤维细胞的方法，用于免疫荧光染色，以研究复杂的细胞间交错结构及膜结构。
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本文内容
摘要
摘要
晶状体是位于眼球前房的一个透明椭球状器官，可通过改变形状将光线精确聚焦到视网膜上，从而形成清晰的图像。该组织的大部分由特化的、已分化的纤维细胞构成，这些细胞呈六边形横截面，并从晶状体的前极延伸至后极。这些细长的细胞与邻近细胞紧密贴合，且沿细胞长度方向具有复杂的指状交错结构。这种特化的嵌合结构对于晶状体正常的生物力学特性至关重要，已有大量研究利用电子显微镜技术对其进行了详细描述。本实验方案展示了首个可用于保存并进行免疫染色的小鼠晶状体单根及成束纤维细胞的方法，从而实现对这些复杂形态细胞内蛋白质的精确定位。代表性数据展示了在整个晶状体各个区域中，包括周边、正在分化、成熟以及核部的纤维细胞的染色结果。该方法未来有望应用于从其他物种晶状体中分离出的纤维细胞。
引言
晶状体是位于眼球前房的一种透明卵圆形组织，由上皮细胞和纤维细胞两种细胞类型构成1（图1）。晶状体的前半球表面覆盖着一层单层的上皮细胞。纤维细胞由上皮细胞分化而来，构成了晶状体的主体部分。这些高度特化的纤维细胞经历一个拉长、分化和成熟的过程，其细胞膜形态从晶状体周边到中心呈现出明显的阶段性变化2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12，这一中心区域也被称为晶状体核。晶状体能够将来自不同距离的光线精确聚焦于视网膜上，这一功能依赖于其生物力学特性，包括刚度和弹性
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方案
小鼠的饲养和管理依据印第安纳大学布卢明顿分校机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案进行。用于生成代表性数据的小鼠为C57BL6/J背景的对照（野生型）雌性小鼠，年龄为8至12周。本实验可使用雄性或雌性小鼠，因为小鼠的性别极不可能影响实验结果。
1. 晶状体解剖与去囊
- 根据美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》以及机构批准的动物使用规程实施小鼠安乐死。
注：本研究中，小鼠按照印第安纳大学批准的动物实验方案，采用过量二氧化碳（CO2）吸入法实施安乐死，随后进行颈椎脱位。 - 使用弯头镊子摘除小鼠眼球：将镊子的一侧压住眼球周围组织，使眼球从眼窝中脱出；随后将镊子闭合于眼球下方，轻轻提起以取出眼球。将取出的眼球转移至解剖盘中新鲜的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 使用超细剪刀尽可能靠近眼球处剪断视神经。随后，将细尖直头镊子经眼球后部视神经出口处小心插入眼球内部。
- 在步骤1.3中镊子插入的同一位置插入剪刀，开始从眼球后部向角膜-巩膜交界处剪开切口。
注：啮齿类动物的晶状体约占眼球体积的30%。若镊子或剪刀插入过深，可能导致晶状体意外损伤。 - 沿角膜-巩膜交界处继续剪开，直至至少一半的交界区域被分离。
- 使用镊子轻压角膜，使....
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结果
晶状体纤维细胞从晶状体皮质（分化中的纤维和成熟纤维）及晶状体核中分离制备，细胞经鬼笔环肽染色以标记F-actin，麦芽凝集素（WGA）染色以标记细胞膜。细胞束混合物或单个晶状体纤维（图3）被观察并成像。从晶状体皮层中可观察到两种类型的细胞（图3A在晶状体周边发现正在分化的纤维细胞呈直线形，其短边带有极小的突起。随着细胞的分化，纤维细胞逐渐变得弯曲，并形成小型相互嵌合的突起。在进一步成熟的过程中，纤维细胞发育出带有小型相互嵌合突起的宽大桨状结构。小鼠晶状体的核部高度致密且坚硬，并被隔离 通过 在固定和染色核部晶状体纤维之前，机械去除较软的晶状体皮质。从晶状体核部可观察到成束的晶状体纤维，其直径较小，且具有精细的膜结构，在低倍镜图像中不易清晰观察。
通过对晶状体不同区域的晶状体纤维细胞进行高倍放大的三维重建（图3B）发现，F-肌动蛋白与麦芽凝集素（WGA）在分化中及成熟纤维细胞的细胞膜上高度.......
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讨论
本方案展示了固定、保存以及免疫染色的方法，可真实保留晶状体不同深度处成束或单个晶状体纤维细胞的三维膜形态。染色后的晶状体纤维与长期以来用于研究晶状体纤维细胞形态的扫描电镜（SEM）样品进行了比较。结果显示，两种制备方法所呈现的膜结构具有可比性。尽管电镜（EM）仍是研究细胞形态的金标准，但在SEM样品中进行免疫标记以定位蛋白质更具挑战性33,34,35，且需要使用电子显微镜成像。该免疫染色方法的优势在于可同时标记多个靶点，并可在共聚焦显微镜上采集图像。
尽管该方法能够保持复杂的细胞形态，但由于基因突变、衰老、药物处理等因素导致晶状体纤维发生改变，仍需通过扫描电镜（SEM）来比较对照组与处理组晶状体纤维之间的交错结构。免疫染色制备过程会产生来自晶状体皮质或核部的细胞混合物，这些细胞在载玻片上呈随机分布。因此，如果细胞形态发生改变，则可能更难判断细胞在解离染色前于晶状体中的原始位置深度。在此类情况下，可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了国家眼科研究所资助项目 R01 EY032056（授予 CC）的支持。作者感谢斯克里普斯研究研究所核心显微镜中心的 Dr. Theresa Fassel 和 Kimberly Vanderpool 在电子显微镜图像方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60 mm 培养皿 | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48 孔板 | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 盖玻片（22 × 40 mm） | FisherScientific | 12-553-467 | |
| 弯头镊子 | World Precision Instruments | 501981 | |
| 解剖显微镜 | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| 细尖直头镊子 | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片 | FisherScientific | 12-550-15 | |
| 配备 Airyscan（63X）和 Zen 3.5 软件的 LSM 800 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | ||
| 指甲油 | |||
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| 鬼笔环肽（罗丹明标记） | ThermoFisher | R415 | |
| 一抗 | |||
| Feather 一次性手术刀，无菌，11 号 | VWR | 76241-186 | |
| 二抗 | |||
| 直头镊子 | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays（解剖托盘） | FisherScientific | 12-565-154 | |
| 超细剪刀 | World Precision Instruments | 501778 | |
| 含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 麦胚凝集素（荧光素标记） | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
参考文献
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy.
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重印与许可
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